Summary
सेलुलर समारोह पर substrata कठोरता के प्रभाव modeled किया जा सकता है
Abstract
ऊतक कठोरता सेलुलर समारोह का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, और ऊतक कठोरता में परिवर्तन सामान्यतः तंतुमयता, कैंसर और हृदय रोग 1-11 के साथ जुड़े रहे हैं . पारंपरिक सेल सेलुलर समारोह का अध्ययन जैविक दृष्टिकोण संवर्धन कोशिकाओं (प्लास्टिक के बर्तन या कांच coverslips) एक कठोर बुनियाद पर जो एक लोचदार ईसीएम या ऊतकों के बीच ECM कठोरता में बदलाव के प्रभाव के लिए खाते में नहीं कर सकते हैं शामिल हैं. इन विट्रो में vivo ऊतक अनुपालन की स्थिति में मॉडल करने के लिए, और हम दूसरों ECM-लेपित hydrogels उपयोग. हमारी प्रयोगशाला में, hydrogels polyacrylamide जो ऊतक 12 जैविक देखा अनुपालन की सीमा की नकल कर सकते पर आधारित हैं. "प्रतिक्रियाशील" कवर फिसल जाता है NaOH साथ ऊष्मायन 3 APTMS के अलावा द्वारा पीछा द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. Glutaraldehyde 3-APTMS और polyacrylamide जेल पार से लिंक के लिए प्रयोग किया जाता है. (एसी) acrylamide, बीआईएस acrylamide (बीआईएस - एसी) और अमोनियम persulfate के समाधान hydrogel के polymerization के लिए प्रयोग किया जाता है. एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) एसी crosslink ईसीएम hydrogel करने के लिए प्रोटीन के समाधान में शामिल है. Hydrogel के polymerization के बाद, जेल सतह fibronectin, vitronectin, मज्जा, आदि जैसे पसंद का एक ECM प्रोटीन के साथ लेपित है
एक hydrogel की कठोरता rheology या परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और 12 समाधान में एसी और / या बीआईएस - एसी का प्रतिशत अलग से समायोजित . इस तरीके में, बुनियाद कठोरता जो भी rheology या AFM का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जैविक ऊतकों की कठोरता के लिए मिलान किया जा सकता है. कोशिकाओं तो इन hydrogels और सुसंस्कृत प्रयोगात्मक आवश्यक शर्तों पर आधारित पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. कोशिकाओं और आणविक विश्लेषण के लिए उनकी वसूली की इमेजिंग सीधा है. इस लेख के लिए, हम उन 20,000 पास्कल <ई के साथ उन लोगों के रूप में 3000 पास्कल और कड़ी substrata / ऊतकों> लोचदार (ई) के moduli होने के रूप में नरम substrata परिभाषित.
Protocol
तैयार
- Coverslips autoclaved होना चाहिए.
- बाँझ आसुत या विआयनीकृत जल के समाधान तैयार करने और coverslips धोने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- (40% w / v) एसी और बीआईएस एसी (1% w / ध्) समाधान 0.2 सुक्ष्ममापी निस्पंदन द्वारा निष्फल रहे हैं. शीघ्र ही उपयोग और बाँझ फिल्टर से पहले, 10% अमोनियम persulfate (100μg/ml पानी पी एस) तैयार करें. ए पी एस समाधान मासिक बदलें.
- 3-APTMS, क्लोरोफॉर्म, glutaradehyde, एन एच एस, और SurfaSil जैसे रासायनिक अभिकर्मकों कि autoclaved नहीं किया जा सकता hydrogels की तैयारी के लिए पूरी तरह से इस्तेमाल किया एक नियत बोतल में रखा जाता है.
- सर्वोत्तम परिणामों के लिए, hydrogels उपयुक्त ECM प्रोटीन के साथ रात में ऊष्मायन के बाद कुछ दिनों के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए.
- एक 50 मिलीलीटर polypropylene फाल्कन ट्यूब में एक 10% क्लोरोफॉर्म (10 मिलीलीटर आमतौर पर शीर्ष 20 coverslips के लिए पर्याप्त) में SurfaSil समाधान से पहले तैयार करने के लिए hydrogel के गिरने. (हमारी प्रयोगशाला आमतौर पर 0.5% glutaraldehyde ऊष्मायन चरण के दौरान शीर्ष coverslips siliconizes है). फाल्कन ट्यूब और रॉक करने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए coverslips जोड़ें. SurfaSil समाधान छानना और जैविक सुरक्षा कैबिनेट जहां hydrogels तैयार हो जाएगा हवा में Kimwipes पर coverslips सूखी.
- गर्मी निष्क्रिय BSA समाधान की तैयारी के रूप में इस प्रकार है: पीबीएस में फैटी एसिड मुक्त BSA के समाधान एक 20 मिलीग्राम / एमएल 30 मिनट के लिए एक 68 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में incubated है. समाधान तो बाँझ फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है
प्रक्रिया
- एक 150 मिमी पेट्री डिश के नीचे आधे पर Parafilm की एक परत रखें.
- 9 Parafilm के शीर्ष पर 25 मिमी coverslips प्लेस और उन्हें 1 मिलीलीटर 0.1 एम NaOH के साथ कवर. 3 मिनट के लिए सेते हैं और फिर एक निर्वात लाइन के साथ aspirate.
- प्रत्येक coverslip पर एक रासायनिक डाकू, जगह 0.5 मिलीलीटर 3 APTMS में कार्य. 3 मिनट के लिए सेते हैं और फिर APTMS aspirate. यदि आप बहुत लंबा इंतजार, एक फोम के रूप में होगा.
- एक ही थाली में 20 मिलीलीटर विआयनीकृत जल के साथ coverslips एक बार कुल्ला. घुमावदार संदंश का उपयोग पकवान से coverslips निकालें और उन्हें उनके इलाज पक्ष का सामना करना पड़ रहा है एक नया पकवान 150 मिमी के लिए, के साथ, हस्तांतरण. विआयनीकृत जल तीन बार के साथ coverslips धो, झूली कुरसी पर 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए. यदि आप सभी APTMS को हटाने में विफल है, यह अगले कदम में glutaraldehyde साथ प्रतिक्रिया और एक सफेद बादल छाए रहेंगे वेग (चित्रा 1) छोड़.
- Glutaraldehyde (~ उपयोग करने से पहले 10 मिनट) पहले गला लें.
- घुमावदार संदंश का प्रयोग, एक साफ Parafilm साथ स्तरित पकवान coverslips हस्तांतरण और किसी भी शेष तरल aspirate. एक निर्वात लाइन या Kimwipe प्रयोग शेष पानी दाग के रूप में की जरूरत है.
- प्रत्येक coverslip पूरी तरह से बाँझ विआयनीकृत पानी में 0.5% glutaraldehyde की 0.5 मिलीलीटर के साथ कवर एक रासायनिक हुड में 30 मिनट के लिए सेते हैं. Glutaraldehyde Aspirate. कुल्ला और चरण 4 में coverslips धोने. Coverslips पूरी तरह से सूखी. [आप यहाँ बंद कर सकते हैं और एक शुष्क क्षेत्र में कई हफ्तों के लिए coverslips छोड़].
- जब आप hydrogels तैयार करने के लिए तैयार हैं, घुमावदार संदंश का उपयोग करें Parafilm के एक पत्रक है कि जैविक सुरक्षा कैबिनेट की सतह पर टेप है coverslips, प्रतिक्रियाशील ओर उठ, हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि coverslips Parafilm सतह पर सपाट हैं.
- टोल्यूनि में एक संतृप्त एनएचएस समाधान तैयार करें. (विशेष रूप से प्रयोग के लिए पर्याप्त टोल्यूनि में एन एच एस के एक छोटी राशि भंग एनएचएस बिट द्वारा बिट जोड़ने जब तक एन एच एस अब घुल नहीं रखें. संतृप्त समाधान आम तौर पर बादल छाए रहेंगे और गुलाबी है.)
- अगला, acrylamide, पानी बीआईएस acrylamide, और ए पी एस तैयार करने के लिए वांछित acrylamide प्रतिशत तक पहुँचने के लिए. Microcentrifuge ट्यूबों में अभिकर्मकों के रूप में 0.8ml की कुल मात्रा के लिए नीचे उल्लिखित जोड़ें.
- फिर, एक समय में एक विभाज्य, एन एच एस जोड़ सकते हैं और 0.8 मिलीलीटर एसी समाधान TEMED, भंवर संक्षिप्त और तुरंत 3-5 जैविक सुरक्षा हुड में coverslip प्रति 140 μl का उपयोग जैल डालना. जब भी संभव हो, इस बिंदु से सभी चरणों का एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. [ध्यान दें: अलग अलग आकार coverslips जरूरत पर आधारित का उपयोग किया जा सकता है है. यदि 18 मिमी coverslips उपयोग किया जाता है, ~ 33 coverslip प्रति μl एसी समाधान और एक 18 मिमी शीर्ष siliconized coverslip का उपयोग करें.]
बीआईएस - एसी (%) 0.3 (कड़ी) 0.15 0.06 0.03 (नरम) μl μl μl μl पानी 402 522 594 618 एसी 150 150 150 150 बीआईएस - एसी 240 120 48 24 ए पी एस 8 8 8 8 TEMED 1 1 1 1 एनएचएस 228 228 228 228 - जल्दी प्रत्येक जेल के शीर्ष पर siliconized 25 मिमी coverslip जगह पहले यह polymerize शुरू होता है. शीर्ष coverslip के अलावा एसी पूरी तरह से नीचे coverslip को कवर करने के लिए अनुमति चाहिए. कमरे के तापमान पर इस "सैंडविच" सेते हैं जब तक एसी polymerizes. (Microcentrifuge ट्यूब में अवशिष्ट एसी समाधान के लिए निर्धारित है जब polymerization हुआ है की जाँच करें आमतौर पर कड़ी जैल के लिए एक कुछ मिनट और नरम वालों के लिए थोड़ी देर पर्याप्त होगा.)
- ध्यान सैंडविच लेने (बाँझ दस्ताने पर!) और जब तक यह polymerized जेल overhangs शीर्ष coverslip स्लाइड. तब आप इसे निहारना बंद कर सकते हैं जेल. यदि आप शीर्ष coverslip हटाने से पहले भी लंबा इंतजार, जेल के रूप में coverslip निकाल दिया जाता है चीर देगा.
- शीर्ष coverslip त्यागें. 6 अच्छी तरह प्लेटें में 2 मिलीलीटर पीबीएस / अच्छी तरह के साथ नीचे जेल coverslips (इसके बाद बुलाया hydrogel) रखें. पीबीएस प्रत्येक अच्छी तरह से जेल - coverslip के पहले या बाद में जोड़ा जा सकता है. पीबीएस तीन बार के साथ hydrogels एक झूली कुरसी, धोने 5 प्रति मिनट पर, धो.
- दोहराएँ 11-14 कदम जब तक hydrogels के लिए आवश्यक संख्या तैयार किया गया है.
- एक fibronectin समाधान (3 / पीबीएस में μg मिलीलीटर) या अन्य ECM प्रोटीन (क्लेन एट अल देखने के विवरण के लिए 13.) 2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक hydrogel कवर . ECM प्रोटीन covalently रातोंरात ऊष्मायन के दौरान डिग्री सेल्सियस 4 hydrogel करने के लिए बाध्य हो जाता है
- कम से कम 30 मिनट के लिए 37 ECM समाधान और 1mg/ml गर्मी निष्क्रिय फैटी एसिड सीरम मुक्त मीडिया में मुफ्त BSA के साथ unreacted एन एच एस ब्लॉक Aspirate डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में. बाँझ पीबीएस या सेल संस्कृति माध्यम के साथ hydrogels एक बार कुल्ला.
- उपयुक्त संस्कृति FBS युक्त माध्यम प्लेट कोशिकाओं. hydrogel पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या सेल प्रसार और confluency प्रयोग के लिए आवश्यक की डिग्री पर आधारित उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. लगभग 10 5 कोशिकाओं आम तौर पर पश्चिमी सोख्ता और qPCR विश्लेषण के लिए पर्याप्त है.
- ऊष्मायन अवधि के बाद, सेल प्रोटीन या mRNA निकाला जा सकता है. coverslips घुमावदार संदंश का उपयोग कुओं से ध्यान हटा रहे हैं और lysis बफर के 100 μl बूंदों जो बाहर स्थान दिया गया है प्रयोगशाला बेंच पर Parafilm के एक पत्रक के साथ (2-3cm) के शीर्ष पर रखा (सेल साइड नीचे). (हम मानक एसडीएस नमूना बफर और TRIzol, क्रमशः, उपयोग के लिए पश्चिमी सोख्ता के लिए नमूने तैयार करने और qPCR के लिए शाही सेना को अलग.) ठीक एक मिनट के लिए lysis बफर के साथ कोशिकाओं सेते हैं. Coverslips निकालें और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए lysis बफर हस्तांतरण. आरएनए केवल निकासी के लिए वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता एक नया 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक hydrogel हस्तांतरण और TRIzol अच्छी तरह / 1ml जोड़ने कर सकते हैं. 3 मिनट के लिए सेते हैं और एक microcentrifuge ट्यूब में भंडारण के लिए TRIzol समाधान निकालने.
Immunofluorescence जैसे प्रक्रियाओं पर अतिरिक्त जानकारी, BrdU धुंधला हो जाना, अभिकर्मक hydrogels पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के लिए, आदि क्लेन एट अल में वर्णित है. २००७ 13.
प्रतिनिधि परिणाम
Coverslips की पूरी तरह से APTMS के अलावा निम्नलिखित धोने "प्रतिक्रियाशील" coverslips के उत्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम है. यदि एक के लिए APTMS पूरी तरह से हटाने में विफल रहता है, यह निम्न चरण में glutaraldehyde साथ प्रतिक्रिया और एक सफेद बादल छाए रहेंगे वेग के रूप में चित्र 1A में देखा उत्पादन होगा. चित्रा 1B coverslip ठीक से धोया और सूखे से पता चलता है. यदि वेग विकसित, पूरी प्रक्रिया की शुरुआत से आरंभ किया जाना चाहिए के रूप में coverslip नहीं रह गया है useable.
Hydrogel गठन और रातोंरात ECM प्रोटीन के साथ कोटिंग के बाद अगले दिन, कोशिकाओं वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. चित्रा 2 से पता चलता है के रूप में, वहाँ कड़ी बनाम नरम hydrogels पर फैल सेल के बीच एक स्पष्ट अंतर है. के रूप में माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) में phalloidin धुंधला द्वारा देखा जा सकता है है, कोशिकाओं कड़ी पर एक बड़ी हद तक फैल के रूप में मुलायम hydrogels की तुलना में. वास्तव में, सबसे एक नरम hydrogel संलग्न कोशिकाओं कॉम्पैक्ट बना रहेगा और कम कुशलता से संलग्न होगा.
हालांकि केवल MEF morphology चित्रा 2 में दिखाया गया है, सेल प्रसार में अंतर कई अन्य सेल लाइनों के पार अनुरूप है 11-12,14 परीक्षण किया.
सफलता के लिए गोपनीयता
- एक बार प्रक्रिया शुरू होता है, यह बहुत महत्वपूर्ण है "प्रतिक्रियाशील" पक्ष के साथ coverslips को बनाए रखने और मन में रखने के लिए जो पक्ष लेपित किया गया है.
- दस्ताने के एक काम वातावरण है कि के रूप में संभव के रूप में बाँझ है प्रदान करने की प्रक्रिया के दौरान सभी समय पहना होना चाहिए.
- प्रारंभिक कदम के अधिकांश एक रासायनिक धूआं डाकू और प्रयोगशाला बेंच के बीच प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी coverslips से अधिक glutaraldehyde निकालने के लिए बाद के चरणों का एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत निष्पादित किया जाना चाहिए.
- सेल sprea में मतभेद के कारणडिंग (चित्रा 2), हम नरम hydrogels पर दो बार कोशिकाओं की संख्या में बोने की सिफारिश के रूप में कड़ी hydrogels की तुलना में.
- एसी polymerization प्रक्रिया बहुत जल्दी है. पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए एक ए पी एस की राशि में कमी या polymerization प्रक्रिया को लम्बा खींच करने के लिए समाधान में TEMED कर सकते हैं. एक समय में कुछ coverslips से अधिक तैयार करने की कोशिश मत करो.
- कोशिका चक्र के अध्ययन में जहां G0 में सिंक्रनाइज़ेशन की आवश्यकता है, हम आमतौर पर प्लास्टिक की संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं सीरम - भूखा, कोशिकाओं trypsinize और उन्हें अलग अनुपालन के hydrogels पर mitogens (FBS और / या वृद्धि कारकों) की उपस्थिति में Reseed. यह प्रक्रिया सुनिश्चित करता है कि G0 - सिंक्रनाइज़ हुए कोशिकाओं के शुरू जनसंख्या सभी नमूनों में समान है. हालांकि, कई संकेत transduction अध्ययन के लिए, आवश्यक mitogen उत्तेजना अवधि काफी लंबे समय के लिए लगाव और कोशिकाओं के प्रसार के लिए अनुमति नहीं किया जा सकता है. इस मामले में, हम hydrogels पर कोशिकाओं सीरम - भूखा और फिर उन्हें सीधे उत्तेजित mitogen साथ.
चित्रा 1A. अनुचित coverslip धोया APTMS के अलावा के बाद. Coverslip 1-2 मिनट के लिए glutaraldehyde समाधान के अलावा पहले धोया गया था. एक वेग coverslip है कि प्रक्रिया में उल्लिखित चरणों के अनुसार नहीं धोया है पर रूपों.
चित्रा 1 बी. ठीक से धोया coverslip APTMS के बाद इसके अलावा, coverslip glutaraldehyde समाधान के अलावा पहले तीन 10 मिनट प्रत्येक बार के लिए धोया गया था. कोई वेग coverslip पर रूपों.
चित्रा 2. कठोरता बदलती. Hydrogels पर कक्षों की आकृति विज्ञान स्थापित MEFs 9 घंटे के लिए उच्च या कम कठोरता के fibronectin लेपित hydrogels पर वरीयता प्राप्त थे. ऊष्मायन अवधि के बाद, कोशिकाओं तय थे permeabilized और FITC - phalloidin जो च actin बांध के साथ दाग. MEFs उच्च कठोरता जैल पर तनाव फाइबर प्रदर्शन और कम कठोरता hydrogels पर वरीयता प्राप्त लोगों की तुलना में अच्छी तरह से फैल रहे हैं. स्केल बार = 50μm.
चित्रा 3. माउस cyclin D1 mRNA स्तर के प्रतिनिधि मात्रात्मक पीसीआर परिणाम सीरम भूखे माउस भ्रूण fibroblasts उच्च (3% acrylamide) या कम (0.3% acrylamide) कठोरता hydrogels पर चढ़ाया गया और 9 बजे के लिए 10% FBS के साथ प्रेरित है. शाही सेना निकासी के बाद, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण cyclin D1 mRNA स्तर (18s शाही सेना के लिए सामान्यीकृत) के लिए प्रदर्शन किया था. G0 cyclin मौन कोशिकाओं से D1 mRNA का प्रतिनिधित्व करता है. कड़ी hydrogels पर नहीं बल्कि नरम hydrogels पर Cyclin D1 mRNA स्तर काफी वृद्धि हुई है. डुप्लिकेट पीसीआर प्रतिक्रियाओं के एसडी - डेटा + / मतलब कर रहे हैं.
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Discussion
Hydrogel polymerization की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण तत्व हवा बुलबुला गठन है जो कोशिकाओं को ECM-लेपित ही hydrogel बजाय कांच coverslip करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देगा से बचने के है. यह ध्यान से polymerization के समाधान pipetting बाद vortexing और नेत्रहीन बनाने सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले जेल में फँस बन गए हैं से रोका जा सकता है. हम हमेशा अतिरिक्त "प्रतिक्रियाशील" coverslips और hydrogels प्रयोग के लिए पर्याप्त होने सुनिश्चित करने की तैयारी की सलाह देते हैं.
जब भी जैल पीबीएस के साथ धो रहे हैं विशेष रूप से ध्यान दिया जाना चाहिए. चूषण की प्रक्रिया hydrogel ही के रूप में इसे और पकड़े सकता है फटे के साथ निकट संपर्क से बचना चाहिए. सबसे सुरक्षित तरीका बिना perturbing hydrogels तरल aspirate थाली टिप जबकि suctioning है.
यह मुश्किल है के लिए पूरी तरह से स्तर hydrogels प्राप्त करने, और hydrogel मोटाई में सूक्ष्म अंतर असमान सतहों है कि यह देखने के एक क्षेत्र भर में मुश्किल छवियों को ध्यान केंद्रित करने के लिए बनाने में परिणाम कर सकते हैं. एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं, और हम पाते हैं कि इस दृष्टिकोण सबसे चरण विपरीत और epifluorescence के रूप में छवि में दिखाया गया अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है. 2. समस्या बढ़ाई बढ़ जाती है के रूप में गंभीर हो जाता है तो, प्रोटीन सह स्थानीयकरण जैसे उच्च संकल्प विश्लेषण सबसे अच्छा confocal सूक्ष्मदर्शी से ऑप्टिकल स्लाइस के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं. Confocal माइक्रोस्कोपी मानक प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है, लेकिन बजाय एक स्लाइड coverslip पर उल्टे क्रम में hydrogel जरूरत उद्देश्यों की एक औंधा confocal खुर्दबीन में काम दूरी को समायोजित कर सकते हैं.
इन विट्रो polyacrylamide जेल प्रणाली में यह विभिन्न शारीरिक ECM कठोरता शर्तों मॉडलिंग करने में सक्षम है . ECM अनुपालन सामान्य ऊतकों के बीच बदलता है, और कठोरता में परिवर्तन भी pathologically पता चला रहे हैं. जैसे, इस hydrogel प्रणाली एक मूल्यवान जांच कैसे ECM जकड़न में बदलाव रोग की प्रगति को प्रभावित करने के लिए इन विट्रो परख में किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम है हमारी प्रयोगशाला के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Store at room temperature |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
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