Изучение воздействия Матрица жесткости на клеточную функцию использования на основе акриламида Гидрогели

Summary

Влияние жесткости субстратов на клеточные функции могут быть смоделированы

Abstract

Ткань жесткость является важным фактором клеточной функции, а также изменения в ткани жесткость, как правило, связано с фиброзом, рак и сердечно-сосудистые заболевания ^1-11. Традиционные ячейки биологических подходов к изучению клеточной функции включают культивирования клеток на жесткой субстрата (пластиковой посуды или стекла покровные), который не может объяснить влияние упругой ECM или ECM изменения жесткости между тканями. Для моделирования в естественных условиях ткани соблюдением условий в пробирке, и мы, и другие используют ECM-покрытием гидрогелей. В нашей лаборатории, гидрогели на основе полиакриламида, который может имитировать спектр тканей податливости видел биологически ^12. "Реактивный" скользит крышка генерируются путем инкубации с NaOH с последующим добавлением 3-APTMS. Глутаральдегид используется для сшивки 3-APTMS и полиакриламидном геле. Решение акриламида (AC), бис-акриламида (Bis-AC) и персульфата аммония используется для полимеризации гидрогеля. N-гидроксисукцинимида (NHS) включается в решение переменного тока для сшивания ECM белка гидрогеля. После полимеризации гидрогеля, геля поверхность покрыта белков ECM выбора, такие как фибронектин, витронектин, коллаген и др.

Жесткость гидрогеля можно определить по реологии или атомно-силовой микроскопии (АСМ) и корректируется при изменении доли переменного тока и / или бис-AC в решение ^12. Таким образом, субстрат жесткости можно подобрать жесткость биологических тканей, которые также могут быть количественно, используя реологию или АСМ. Клетки могут быть посеяны на этих гидрогелей и культурной основе экспериментальных условиях требуется. Визуализация клеток и их восстановление для молекулярного анализа проста. В этой статье мы определяем мягких субстратах, как те, которые имеют модули упругости (Е) <3000 Паскаль и жесткие субстраты / тканей, как и с Е> 20 000 Паскаль.

Protocol

Подготовка

• Покровные необходимо обрабатывать в автоклаве.
• Стерильной дистиллированной или деионизированной воды должна быть использована для приготовления растворов и для стирки покровные.
• AC (40% вес / объем) и бис-AC (1% м / о) растворы стерилизуют путем фильтрации 0,2 мкм. Подготовка 10% персульфат аммония (APS; 100μg/ml воды) незадолго до использования и стерильный фильтр. Замените APS решение ежемесячно.
• Химические реагенты, такие как 3-APTMS, хлороформ, glutaradehyde, NHS, и SurfaSil которые не могут быть автоклавного хранятся в назначенный бутылки используются исключительно для подготовки гидрогелей.
• Для достижения наилучших результатов, гидрогели следует использовать в течение нескольких дней после инкубации в течение ночи с соответствующим белком ECM.
• Подготовка 10% SurfaSil решение в хлороформе (10 мл, как правило, достаточно для 20 лучших покровных) в 50 мл труба полипропиленовая Сокола до заливки гидрогеля. (Наши лаборатории обычно siliconizes верхней покровные течение 0,5% шаг инкубации глутаральдегида). Добавить покровные к трубке Сокол и рок, по крайней мере 10 мин. Декантируйте решение SurfaSil и воздух сухой покровные на Kimwipes в кабинете биологической безопасности, где гидрогелей будет подготовлен.
• Подготовка тепловых инактивированной BSA решение следующим образом: 20 мг / мл раствора жирных кислот БСА в ФСБ, инкубируют в 68 ° С на водяной бане 30 мин. Затем раствор стерильно фильтруют и хранят при температуре 4 ° C.

Процедура

1. Поместите слой парафильмом на нижней половине 150-мм чашки Петри.
2. Место до 9 25-мм покровные на вершине парафильмом и покрыть их с 1 мл 0,1 М NaOH. Инкубируйте в течение 3 мин, а затем аспирата с вакуумной линии.
3. Работа в химической капот, места 0,5 мл 3-APTMS на каждом покровное. Инкубируйте в течение 3 мин, а затем аспирата APTMS. Если вы будете ждать слишком долго, пена форме.
4. Промыть покровные раз с 20 мл деионизированной воды в том же блюде. Удалить из покровных блюдо использованием изогнутых щипцов и передавать их, с их лечение-вверх, к новому 150-мм блюдо. Вымойте покровные деионизированной водой в три раза, на рокера, в течение 10 минут каждого мытья. Если вы не в состоянии удалить все APTMS, он будет реагировать с глутаральдегида в следующий шаг и оставить белый осадок облачно (рис. 1).
5. Оттепель глутаральдегида (~ 10 мин до использования).
6. Использование изогнутых щипцов, передача покровные на чистое блюдо слоистых с парафильмом и аспирации любой оставшейся жидкости. Используйте линии вакуум или Kimwipe, чтобы уничтожить оставшуюся воду по мере необходимости.
7. Обложка каждого покровное полностью с 0,5 мл 0,5% глутарового альдегида в стерильной деионизованной водой и выдержать в течение 30 мин в химической капотом. Аспирируйте глутаральдегида. Промыть и мыть покровные, как в шаге 4. Сухие покровные полностью. [Вы можете остановиться здесь и оставить покровные течение нескольких недель в сухом месте].
8. Когда вы будете готовы подготовить гидрогели, использование изогнутых щипцов для передачи покровные, реактивной стороной вверх, к листу парафильмом, что был выявлен на поверхность биологических кабинета безопасности. Убедитесь, что покровные стояли на поверхности парафильмом.
9. Подготовка насыщенный раствор NHS в толуоле. (Растворите небольшое количество NHS в достаточном количестве толуола для конкретного эксперимента. Продолжайте добавлять NHS по кусочкам, пока NHS больше не растворяется. Насыщенного раствора, как правило, облачно и розовый).
10. Затем подготовить акриламида, бис-акриламид, воды и APS для достижения желаемого акриламида процентах. Добавить реагентов в микроцентрифужных трубы, как описано ниже, чтобы общий объем 0.8ml.
11. Затем, один аликвоту в то время, добавьте NHS и TEMED в 0,8 мл раствора переменного тока, вихрь кратко и немедленно влить 3-5 гели использовании 140 мкл на покровное в биологических капот безопасности. По возможности, все шаги, с этой точки должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности. [Примечание: различные покровные размера могут быть использованы основана на необходимости. Если 18-мм покровные используются, используйте ~ 33 мкл раствора переменного тока на покровное и 18-мм сверху покровное силиконовая.]
    

    	Бис-AC (%)
    	0,3 (жесткая)	0,15	0,06	0,03 (мягкая)
    	мкл	мкл	мкл	мкл
    Воды	402	522	594	618
    Переменный ток	150	150	150	150
    Бис-AC	240	120	48	24
    APS	8	8	8	8
    TEMED	1	1	1	1
    Государственная служба здравоохранения	228	228	228	228

12. Быстро место силиконизированный 25-мм покровным друг на гель до его начала к полимеризации. Добавление верхнего покровного должны позволить переменного тока, чтобы полностью покрыть дно покровное. Выдержите эту «сэндвич» при комнатной температуре до AC полимеризуется. (Проверьте остаточную решение ВС в микроцентрифужных трубки для определения момента полимеризации не произошло. Обычно несколько минут для жестких гелей и немного дольше для мягкие будет достаточно.).
13. Тщательно подберите сэндвич (стерильные перчатки!) И сдвиньте с верхней покровное, пока не свесы полимеризованного геля. После этого можно вырвать его с гелем. Если вы будете ждать слишком долго, прежде чем снимать верхний покровное, гель рип качестве покровного удаляется.
14. Откажитесь от верхнего покровного. Место нижней гель-покровные (здесь и далее гидрогель) в 6-луночных планшетах с 2 мл PBS / хорошо. PBS может быть добавлено до или после гель-покровное в каждую лунку. Вымойте гидрогели с PBS в три раза, на рокера, 5 мин на мытье.
15. Повторите шаги 11-14 до необходимого количества гидрогели были подготовлены.
16. Обложка каждого гидрогеля с 2 мл фибронектина решения (3 мкг / мл в PBS) или другой белок ECM (см. Клейн и др. ^13. Подробнее.). Белком ECM становится ковалентно связаны с гидрогеля при инкубации в течение ночи при температуре 4 ° C.
17. Аспирируйте решение ECM и блокировать непрореагировавшего NHS с 1mg/ml тепла инактивированной жирных кислот в сыворотке крови BSA-свободные средства массовой информации, по крайней мере 30 мин при 37 ° С в клеточной культуре инкубатора. Промыть гидрогелей раз стерильной PBS или средней культуре клеток.
18. Пластина клеток в соответствующей культуральной среде, содержащей FBS. Число клеток посеяны на гидрогель должен определяться пользователем исходя из степени клеточного распространения и слияния, необходимых для экспериментов. Примерно 10 ^{5 клеток} обычно достаточно для западных промокательной и КПЦР анализа.
19. После инкубационного периода, белок клетки или мРНК может быть извлечена. Покровные стекла осторожно удаляются с скважин с использованием изогнутых щипцов и помещен (ячейка стороной вниз) в верхней части 100 мкл капель лизирующего буфера, которые были разнесены (2-3см) вдоль листа парафильмом на лабораторном столе. (Мы используем стандартный SDS буфера образца и TRIzol, соответственно, для подготовки образцов для западных промокательной и изолировать РНК КПЦР.) Инкубируйте клетки с лизис буфера ровно одну минуту. Удалить покровные и передача буфера для лизиса микроцентрифужных трубки. Кроме РНК для извлечения только, пользователь может передавать друг гидрогеля на новый 6-луночного планшета и добавьте 1 мл TRIzol / лунку. Инкубируйте в течение 3 минут и удалить TRIzol решение для хранения в микроцентрифужных трубки.

Дополнительная информация о процедурах, таких как иммунофлюоресценции, BrdU окрашивание, трансфекции, и т.д. для клетки посеяны на гидрогелей описан в Кляйн и др.. 2007 ^13.

Представитель Результаты

Тщательное мытье покровные после добавления APTMS является важным шагом в создании "реактивный" покровные. Если не удается удалить APTMS полностью, он будет реагировать с глутаральдегида в следующий шаг и производить белый осадок облачно как показано на Рисунке 1A. На рисунке 1б показана правильно стирать и сушить покровное. Если осадок развивается, вся процедура должна быть перезапущена с самого начала в качестве покровного больше не пригодной к использованию.

После образования гидрогеля и покрытия с белками ECM в одночасье, клетки могут быть посеяны на следующий день. Как показано на рисунке 2 показано, существует четкое различие между сотовыми распространяется на жесткие по сравнению с мягкими гидрогелей. Как можно видеть по фаллоидином окрашивания в мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), клетки распространяются в большей степени от жесткой по сравнению с мягкими гидрогелей. В самом деле, большинство клеток присоединения к мягкой гидрогель будет оставаться компактными и приложите менее эффективно.

Хотя только морфологию MEF показано на рисунке 2, разница в ячейке распространения согласуется в нескольких других клеточных линий испытания ^11-12,14.

Секреты успеха

1. Как только процедура будет запущен, это очень важно, чтобы покровные с "реактивной" стороной вверх и иметь в виду, какая сторона была покрыта.
2. Перчатки должны носить в любое время, в течение процедуры для обеспечения рабочей среды, максимальную стерильность.
3. Большинство первые шаги осуществляются между химической вытяжной шкаф и лабораторном столе. Все шаги после удаления избытка глутаральдегида от покровных должны быть выполнены по биологической кабинета безопасности.
4. Из-за различий в клеточной spreaдинь (рис. 2), мы рекомендуем посев в два раза число клеток на мягких гидрогелевых по сравнению с жесткими гидрогелей.
5. Процесс полимеризации переменного тока очень быстро. Для пользователей-новичков, можно уменьшить количество APS или TEMED в решение продлить процесс полимеризации. Не пытайтесь готовить больше, чем несколько покровных в одно время.
6. В клеточном цикле исследований, в которых синхронизации в G0 не требуется, мы обычно сыворотки голодать клеток в пластиковой посуды культуры, trypsinize клеток и повторно задать их на гидрогелей различных податливости в присутствии митогены (ФБС и / или факторы роста). Эта процедура гарантирует, что начиная населения G0-синхронизированных клетках одинаков для всех образцов. Тем не менее, для многих исследований передачи сигнала, требуемого периода стимуляции митогеном не может быть достаточно длинным, чтобы для крепления и распространения клеток. В этом случае, мы сыворотки голодать клеток на гидрогели, а затем непосредственно стимулируют их митогеном.

Рисунок 1А. Неправильно мыть покровное. После добавления APTMS, покровное промывали в течение 1-2 минут перед добавлением глутаральдегида решение. Осадок на покровное, которые не были вымыты согласно шаги, описанные в процедуре.

Рисунке 1b. Правильно мыть покровное. После добавления APTMS, покровное промывали три раза по 10 минут перед добавлением глутаральдегида решение. Нет осадок на покровное.

Рисунок 2. Морфология клеток на гидрогелей различной жесткости. Основанная MEFs были посеяны на фибронектин покрытием гидрогелей высокой или низкой жесткости в течение 9 часов. После инкубационного периода, клетки фиксируют, проницаемыми и окрашивали FITC-фаллоидином, который связывается с F-актина. MEFs на высокой жесткостью гели выставку напряжение волокон и хорошо распространяется по сравнению с теми посеяны на низких гидрогелей жесткости. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 3. Представитель количественный ПЦР результате мыши циклин D1 уровни мРНК. Сыворотка от голода мышиных эмбриональных фибробластов высевали на высокий (3% акриламида) или низкий (0,3% акриламида) гидрогелей жесткость и стимулировали с 10% FBS в течение 9 часов. После экстракции РНК в реальном времени, количественный анализ ПЦР проводили для циклин D1 мРНК (нормированная на 18S РНК). G0 представляет циклин D1 мРНК из покоящихся клетках. Циклин D1 уровни мРНК значительно увеличиться на жесткой гидрогели, но не на мягких гидрогелей. Данные средний + / - SD дубликатов реакции ПЦР.

Discussion

Одним из важнейших элементов процесса полимеризации гидрогеля, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которая позволит клеткам связываться с покровным стеклом, а не ECM-покрытием гидрогеля себя. Это можно предотвратить, тщательно пипетирования полимеризации в растворе после вортексе и визуально убедившись, что нет воздушных пузырей попасть в ловушку геля. Мы всегда рекомендуем подготовку дополнительных "реактивный" покровные и гидрогелей для обеспечения наличия достаточного для экспериментов.

Особое внимание должно быть уделено всякий раз, когда гель промывают PBS. Процесс всасывания должны избегать близкого контакта с гидрогеля себя как она может попасть и рвется. Самый безопасный способ для аспирации жидкости без возмущающих гидрогелей является кончик пластины в то время как отсасывание.

Трудно получить полностью уровня гидрогелей, и микроскопические различия в гидрогеля толщиной может привести к неровной поверхности, что сделать это трудно фокусировать изображение по всему полю зрения. Можно сосредоточиться на относительно небольшие площади, и мы находим, что этот подход является достаточным для большинства фазового контраста и epifluorescence приложений, как показано на рис. 2. Проблема становится все более серьезными, как увеличение увеличивается, так с высоким разрешением анализы, такие как совместное локализации белков лучше всего анализировать как оптические ломтики от конфокальной микроскопии. Конфокальной микроскопии с использованием стандартных процедур, но гидрогеля, возможно, должны быть обращены на покровное, а не слайд, чтобы приспособить рабочее расстояние целей в перевернутом конфокальной микроскопии.

Это, в пробирке системы полиакриламидном геле способна моделирования различных физиологических условиях жесткости ECM. ECM соответствии варьируется среди нормальных тканей, а также изменения жесткости также обнаружены патологически. Как таковой, этот гидрогель система может быть ценным в анализе пробирке для исследования, как изменения влияют на жесткость ECM прогрессирования заболевания.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Store at -20°C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Store at room temperature
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Store at room temperature
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Store at 4°C Replace monthly
Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Store at 4°C
Coverslips (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Coverslips (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D