Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

Summary

Трансгенные черви обычно используются в

Abstract

Число лабораторий, использующих бесплатный С. нематода жизни Элеганс быстро растет. Популярность этой биологической модели объясняется быстрое время генерации и короткий срок службы, легкий и недорогой технического обслуживания, полностью секвенированы генома, и массив RNAi ресурсов и мутантных животных. Кроме того, анализ C. Элеганс генома показало большое сходство между червями и высших позвоночных животных, что позволяет предположить, что исследования в червей могло бы стать важным дополнением к исследований, проведенных в целом мышей и культуре клеток. Мощная и важная часть червя исследования заключается в возможности использования трансгенных животных для изучения локализации генов и функции. Трансгенные животные могут быть созданы либо с помощью микроинъекции червь зародышевой линии или через использование biolistic бомбардировки. Бомбардировка является новой техникой и менее знакомые число лабораторий. Здесь мы опишем простой протокол для создания трансгенных червей biolistic бомбардировки частицами золота использованием Bio-Rad PDS-1000 системе. По сравнению с ДНК микроинъекции в гермафродита зародышевой линии, этот протокол обладает тем преимуществом, что не требует специальных навыков от оператора в отношении выявления червя анатомии или выполнение микроинъекции. Далее несколько трансгенных линий чаще всего получаются из одного бомбардировки. Кроме того, в отличие от микроинъекции, biolistic бомбардировки производит трансгенных животных с обоими внехромосомными массивы и интегрированных трансгены. Возможность получения интегрированной трансгенных линий может избежать использования мутагенных протоколов для интеграции чужеродной ДНК. В заключение biolistic бомбардировка может быть привлекательным методом для создания трансгенных животных, особенно для исследователей, не заинтересованы в инвестировании времени и усилий, необходимых, чтобы стать опытным специалистом в микроинъекции.

Protocol

Обзор

Традиционно трансгенных черви были порождены microinjecting трансгенной ДНК в C. Элеганс зародышевой линии ^1,2,3,4. Хотя успешные, этот подход требует специального оборудования и развитие опыта с анатомией червя и микроинъекции техники. Совсем недавно biolistic бомбардировки был разработан как альтернативный подход, который использует ДНК-частицы, покрытые золотом ввести чужеродной ДНК в зародышевой линии ^5,6. Этот подход требует меньше времени, инвестиций с точки зрения практики, чтобы стать успешным.

Biolistic бомбардировки C. Элеганс для создания трансгенных червей имеет низкую эффективность на уровне отдельных червя так успех требует большого количества животных. Они могут быть выращены в нескольких направлениях, но мы используем яйцо пластин для уменьшения работы и количество пластин участие. Наш протокол начинается с подготовки яйцо пластин и червей, а затем фокусируется на бомбардировку протокол, используя Bio-Rad PDS-1000/He гепта системы. Мы адаптировали наши протокола, в частности от работы Березиков и др. ^7.

При бомбардировке, UNC-119 гена, как правило, используется в качестве маркера для трансгенных животных. Worm штаммы несут эту мутацию серьезно несогласованных и едва двигаться, это унылый по внешнему виду, и не в состоянии сформировать Dauer личинки ^8. Dauer является альтернативным личиночной стадии, которая используется для задержки развития репродуктивных взрослых в неблагоприятных условиях, а также вступление в Dauer регулируется несколькими генами ^9. Несколько штаммов проведения UNC-119 гена можно получить C. Элеганс генетический центр (CGC, Minneapolis, MN). Оригинальные DP38 деформации (UNC-119 (ED3)) также несет в несвязанных Dauer формирования учредительных (DAF-в) мутации, которые могут повлиять вниз по течению экспериментов. Несколько лабораторий имеют outcrossed эта мутация, и HT1593 напряжение можно получить в КГК. Мы считаем, что трансгенные животные несколько легче идентифицировать себя с DP38 напряжения и, как правило, использование этого штамма для создания трансгенных животных. При необходимости, мы используем HT1593 на ауткросс трансгенных червей, чтобы удалить DAF-с мутацией. Получение DP38 червей расти является одним из самых медленных шагов в протоколе так мы поддерживаем запас растущей пластин при подготовке трансгены.

Выражение UNC-119 вместе с маркером гена позволяет легко идентифицировать животных выразив трансгенов на основе спасения нормальную подвижность и размеры тела ^5. UNC-119 ген может быть получена из нескольких источников, и векторов с использованием UNC-119 геномной ДНК, UNC-119 промотора и кДНК и геномной ДНК для меньших C. briggsiae гена используются ^8,10. Мы недавно описан простой протокол, чтобы добавить UNC-119 кассета для любой плазмиды, содержащей ген устойчивости к ампициллину путем гомологичной рекомбинации ¹¹ и метод для изменения червь fosmids осуществлять UNC-119 гена Cre-LOX рекомбинации для получения трансгенных животных ^12. Плазмид можно получить Addgene Inc (Кембридж, Массачусетс).

Хотя усилия, связанные с выполнением одного бомбардировки значительна, но управляемым, дополнительных работ, участвующих в выполнении нескольких бомбардировок в один день является минимальным. Следовательно, мы обычно кластер производства трансгенных червей, чтобы уменьшить работу, участвующими в подготовке каждого из них.

1. Яйцо пластина подготовка

UNC-119 мутанта черви трудно выращивать на стандартных пластинах NGM, потому что с их ограниченной способностью к передвижению, они, как правило, голодать на части пластины в то время как другие части пластины по-прежнему содержат пищу. Яйцо пластин решить эту проблему, как толстый слой пищи на яйцо пластин позволяет UNC-119 червей ползать легче и принять на себя все пластины ^7. Яйцо пластин также в пользу поддержки роста большое количество червей так меньше пластин необходимы ^13. Обычно 5 пластин яйца достаточно, чтобы выращивать червей для одного бомбардировки. Рецепт ниже делает примерно 50 пластин, но может быть вдвое меньше, чтобы при желании.

Яйца пластины может стать легко загрязняется, поэтому мы используем как антибиотики и противогрибковые препараты в тарелки и использовать только яйца порожденный гипохлорита лечения для посева пластин.

День 1:

1. Подготовка LB (400 мл) в 500 мл бутылки. Автоклав для 20мин.
2. Налейте ~ 50 10 см NGA пластин с использованием 1 литр NGA с 2% агара. Добавим, нистатин 10 мл на литр и стрептомицин до 200 мкг / мл ^13.
3. Расти 40 мл ночной культуры в OP50-1 в LB 200 мкг / мл стрептомицина. Этот штамм стрептомицин устойчивы и доступны из CGC.
4. Автоклав 500 мл бутылкина следующий день.

День 2:

1. Отдельный желтки от 10 куриных яиц в стерильные бутылки. Мы используем сепаратор желток (продается в магазинах бытовой, в том числе целевых). Shake.
2. Довести объем до 400 мл с LB. Трясти
3. Инкубировать при 60 ° С в течение 1 часа.
4. Остудить до комнатной температуры.
5. Добавить 40 мл OP50-1. Трясти
6. Распространение 5-8 мл смеси на чашку.
7. Разрешить пластин, чтобы поселиться в комнатной температуре на ночь.

День 3:

1. Аккуратно слить оставшуюся жидкость из пластин. Дайте высохнуть с крышками на ночь при комнатной температуре.

День 4:

1. Положите пластины в коробку или полиэтиленовый пакет и хранить при 4 ° С до необходимости. Эти плиты по всей видимости, в порядке, чтобы использовать в течение 1-2 месяцев.

2. Посев Яйцо Плиты

1. Развернуть DP38 червей на 6 см пластин NGA добавлением концентрированного OP50 в последнее время голода пластин. Для одного бомбардировки, мы используем ~ 6 небольших пластин семян 5 пластин яйцо. Для нескольких бомбардировок, мы используем небольшие пластины вместо семян 2 обогащенного пептон пластин перед посевом яйцо пластин.
2. Изолировать яйца из DP38 червей путем использования гипохлорита ^13,14. Ресуспендируют яйца в стерильные S-базальной или M9 буферов ^13,14.
3. Добавьте яйца (> 10000 в табличке) на соответствующее количество яйцо пластин. Расти червей на яйцо пластин при 20 ° С в течение 7-10 дней, чтобы использовать для бомбардировки. Пластины будут готовы к использованию как только черви начали очищать пищу от пластины. Эти плиты действительно трудно голодать и выращивание для более длительные улучшит червь доходности.

Бомбардировка

Мы готовим золотой запас заранее и держать его хранить при температуре 4 ° С для использования. Также необходимо, так это незапятнанным и пятнистых 10 см NGA пластин. Незапятнанным пластины должны быть налил заблаговременно и позволило тщательно высушите чтобы облегчить поглощение жидкости добавил с червями.

В день бомбардировки, мы смыть червей первой затем начать подготовку ДНК-частиц, покрытых золотом. Затем мы добавляем червей незапятнанным пластин NGA и закончить мытье золота частиц и передачи их в macrocarriers.

Подготовка Золотой частицы:

1. Взвесьте 60 мг золота частиц в 1.7mL трубку и замочить в 70% этанола для 15мин. Спиновые кратко для осаждения частиц золота.
2. Промыть 3 раза в стерильной воде и спин кратко каждый раз собирать золото.
3. Ресуспендируют золота в 1 мл 50% стерильного глицерина. Это частицы золотого запаса раствора и могут храниться в течение месяца при 4 ° C.

Worms:

1. Float DP38 червей с яйцом пластин с S-базальной или M9 буфера и перенести их на 50 мл коническую трубку.
2. Хранить трубы на скамейке, пока черви находятся в нижней части. Затем аспирата буфера и добавить свежий S-базальной или М9. Вымойте 2 или 3 раза, до заполнения буфера относительно свободными от мусора. Хранить червей на этот шаг, пока ДНК покрытие будет завершена.
3. Аспирацию и оставьте примерно 2-3 мл червей в буфер на бомбардировку. Трансфер в 10 см незапятнанным пластины NGA на льду. Важно минимизировать объем переданных в качестве пластины NGA должны полностью высохнуть перед бомбардировкой. Будьте уверены, чтобы покрыть всю поверхность пластины с червями.
4. Разрешить пластине высохнуть на льду. Лед не позволит червей от слипания при высыхании.

Этот шаг важен: пластинка должна быть сухой и червей равномерно рассеяны на тарелке NGA. Хранение червей на льду мешает им двигаться на тарелку и агрегирования на сваях.

Препарата ДНК (для одного бомбардировки):

1. Смешайте в 1.7mL трубки:
   • 50 мкл золотых частиц. Ресуспендируют тщательно перед добавлением.
   • 50 мкл ДНК (10-15ug). Мы видим большой разницы между круговой или линейной ДНК. Обычно мы используем Qiagen midiprep картриджи для очистки ДНК (Qiagen Inc, Валенсия, Калифорния).
   • 50 мкл 2,5 М CaCl _2. Это решение является стабильной в течение нескольких недель при комнатной температуре.
   • 20 мкл 0,1 М спермидина.
     
     Спермидина неустойчив в водном растворе. Мы делаем 70μl аликвоты спермидина и хранить при температуре -20 ° C. Затем мы добавляем 1 мл воды прямо перед использованием, чтобы получить 0,1 М раствора. Это решение должно быть готово свежей для каждого бомбардировки.
     
     Мы обычно вихрь золотых частиц в 1.7mL трубки на низкой скорости, а затем добавить CaCl _2, ДНК и спермидина / протамин по каплям при вортексе. Для людей, которые трансфицированных фосфата кальция эта техника знакома.
     
     Мы также использовали протамина вместо спермидина с очень хорошими результатами ^15. Мы готовим свежее решение (1mg/mL) в воде и нам50 мкл электронной вместо 20 мкл спермидина. Если мы используем протамин, мы обычно инкубировать смеси при комнатной температуре в течение 10 минут вместо размещения на льду. Протамина не должны хранить в замороженном состоянии и представляет собой порошок, а не жидкости.
2. Выдержите смесь на льду в течение 30 минут, и периодически смесь держать золотых частиц во взвешенном состоянии. Затем спина кратко и аспирации супернатант.
3. Промыть 300 мкл 70% этанола. Спиновые кратко.
4. Промыть 1 мл 100% этанола. Спиновые кратко.
5. Ресуспендируют в 170μl 100% этанола.

Подготовка macrocarriers:

1. Промыть 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) в 2-пропанола. Положите их на папиросную бумагу и дайте им высохнуть при комнатной температуре.
2. Добавить 20 мкл ДНК / золото смеси в центр каждого macrocarrier. Убедитесь, что вихрь перед пипетирования держать золото во взвешенном состоянии.
3. Пусть этанола испаряется.

3. Бомбардировка

Будьте уверены, чтобы выполнить пустой бомбардировки до начала эксперимента, чтобы избавиться гелия через систему.

1. Включите вакуумный насос и закрыть ловушку вакуумного насоса. Мы используем масла вакуумного насоса.
2. Включите гелия танк. Убедитесь, что давление ≥ 2200psi.
3. Влажные диск разрыв (1350 фунтов на квадратный дюйм) в 2-пропанол, размещение в сохранении колпачок для гепта адаптера.
4. Винт адаптера в PDS-1000 система и затяните с помощью прилагаемого динамометрическим ключом.
5. Место 7 macrocarriers в держатель и место их с помощью прилагаемого инструмента. Затем положите экран гепта остановиться и нижней на держатель. Переверните держатель снова и место на второй полке сверху. Стороне золотой пятнистая macrocarriers должна быть обращена вниз, в этой точке.
6. Совместите отверстия в верхней части macrocarrier держатель выходы адаптера гепта.
7. Место пластины NGA покрытые червями (крышку) на нижней полке при облучении камеры.
8. Полностью открытая вакуум расхода ручку на PDS-1000. Пресс вакцины кнопку, пока камеры достигает 26 В рт. Затем переключитесь на удержание для поддержания вакуума.
9. Нажмите и удерживайте кнопку, пока огонь диск разрывов. Это случится, когда давление достигает 1350psi. Иногда это занимает 5-20 секунд, чтобы произойти. Отпустите кнопку.
10. Выпуск вакуум из камеры (вентиляционные позиции), и удалить пластину.
11. Включите вакуум и гелий прочь.
12. Пожар в несколько раз, пока линия не содержит гелий (гелий язык должен отмечать 0 фунтов на квадратный дюйм).
13. Выключите PDS-1000 системе.

Worm восстановления после бомбардировки:

1. Оставьте бомбардировке пластины при температуре 20 ° С в течение 20 минут.
2. Float червей пластина с 10 мл S-базальной или M9 буфера.
3. Положите 0,5 мл червей на 20 - 10 см пятнистый NGA пластин.
4. Оставить при 20 ° С или при комнатной температуре (22-24 ° С) в течение 2 недель перед проверкой спас червей.
5. Экран для червей с UNC-119 (+) фенотип с рассекает микроскопом. Оптимальное время для скрининга после пластин с голоду так спас черви выживания преимущество по сравнению с не-спас червей.
6. Создание одного человека от каждой линии 10 см пластины, которые содержали спас червей.

4. Представитель Результаты

Успех протокола в отношении получения трансгенных животных зависит от конкретного трансгена. Для промоутера: трансгены GFP репортер мы получили до 20 линий. Более типичный результат 3-10 линий. До 30% от трансгенных линий комплексных линий, но это случайное, и мы будем выполнять несколько бомбардировок на один день, если интегрированной линии особенно желательно.

Discussion

Biolistic бомбардировки простой метод введения чужеродной ДНК в многих организмов, в том числе С. Элеганс ^1,5,6,7,16. Он опирается на золоте частиц, образующих комплекс с ДНК в присутствии CaCl _2. Катионные полиамины, такие, как спермидина, защищают ДНК от деградации нуклеазой в естественных условиях. С спермидина является лабильной молекулы, важно хранить его в небольшой порции при температуре -20 ° С, и сделать решение непосредственно перед выполнением бомбардировки. Как мы указали в протоколе бомбардировки, протамин может быть использован вместо спермидина для доставки чужеродной ДНК ^15. Протамина имеет преимущество, что они более стабильны при комнатной температуре и быть порошок вместо вязкой жидкости.

UNC-119 спасательных ген может быть размещен либо в цис на одной плазмиды в качестве трансгенов или на отдельных плазмид, который смешивается с трансгенной перед покрытием частицы золота. В то время как смешивание одного или более плазмид, как правило, успешно, мы и другие обнаружили, что бомбардировка червей с несколькими плазмид может создать трансгенных животных, несущих некоторых, но не все плазмиды ^6,11. Для облегчения размещения UNC-119 гена трансгенов плазмиды, мы недавно описан протокол, используя гомологичной рекомбинации, чтобы вставить UNC-119 гена в геном устойчивости к ампициллину почти всех плазмид ^11.

Кроме того, для облегчения перемещения трансгенов из DP38 перелить в червь штаммов отсутствует UNC-119 мутаций, мы также вызвала плазмиду с UNC-119, слитый с mCherry ^11. Пан-нейронов mCherry флуоресценции может быть использована для отслеживания наличия трансгенов в различных генетических фоны ^11.

Некоторые трансгенов может быть трудно обнаружить после облучения из-за слабого выражение или стадии конкретных выражений. Наличие трансгенов могут быть проверены часто через использование ПЦР с использованием трансгенных червей. Для трансгенов со слабыми выражение, выполняя дополнительную бомбардировки могут привести к идентификации линий с более сильным выражением. С другой стороны, использование соединений или конфокальной микроскопии часто может помочь с визуализацией выражение флуоресцентных белков.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556