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Summary
유전자 변형 벌레는 일반적으로 사용됩니다
Abstract
무료 생활 선충류의 C.를 사용하는 실험실의 개수 엘레간스이 급속도로 성장하고있다. 이 생물 학적 모델의 인기는 빠른 세대 시간과 짧은 수명, 간단하고 저렴한 유지 보수, 완전 합성 게놈과 RNAi 자원과 돌연변이 동물의 배열에 따라 결정됩니다. C.의 또한, 분석 엘레간스 게놈은 벌레의 연구는 전체 생쥐이나 교양 세포에서 수행한 연구에 중요한 부가 될 수 있다고 제안 웜 이상의 척추 동물 사이 좋은 유사를 공개했다. 웜 연구의 강력하고 중요한 부분은 유전자 현지화 및 기능을 연구하기 위해 유전자 변형 동물을 사용하는 능력입니다. 유전자 변형 동물 중 웜 germline의 microinjection을 통해 또는 biolistic 폭격의 사용을 통해 만들 수 있습니다. 폭격 새로운 기술이며, 실험실의 숫자로 덜 익숙한 것입니다. 여기서 우리는 바이오 래드 PDS - 1000 시스템을 사용 금 입자와 충돌하여 biolistic 유전자 변형 벌레를 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 남녀 추니 germline로의 DNA microinjection에 비해,이 프로토콜은 웜 해부학을 식별하거나 microinjection을 수행 관련하여 운영자로부터 특별한 기술을 필요로하지 않는 장점이 있습니다. 또한 여러 형질 라인은 일반적으로 하나의 충격에서 얻을 수 있습니다. 또한 microinjection에 대조적으로, biolistic 폭격 extrachromosomal 배열과 통합 transgenes 모두 유전자 변형 동물을 생산하고 있습니다. 통합 형질 라인을 얻을 수있는 능력은 외국 DNA를 통합하는 mutagenic 프로토콜의 사용을 피할 수 있습니다. 결론적으로, biolistic 폭격 특히 microinjection에 숙련되기 위해 필요한 시간과 노력을 투자에 관심이없는 조사에 대해, 유전자 변형 동물의 생성을 위해 매력적인 방법으로하실 수 있습니다.
Protocol
개요
전통적으로 유전자 변형 벌레는 C.에 transgene DNA를 microinjecting에 의해 생성되었습니다 엘레간스 germline 1,2,3,4. 성공하는 동안,이 방식은 전문적인 장비와 웜 해부학과 microinjection 기술과 경험의 개발이 필요합니다. 최근 biolistic 폭격은 germline 5,6로 외국의 DNA를 소개하는 DNA - 코팅 금 입자를 사용하는 다른 접근법으로 개발되었습니다. 이러한 접근 방식을 지배할 수 있도록 실천의 관점에서 적은 시간 투자를 필요로합니다.
C.의 biolistic 충격 성공 동물의 대량이 필요하므로 유전자 변형 벌레를 생성하는 엘레간스은 개별 웜의 수준 낮은 효율성있다. 이러한 여러 가지 방법으로 성장하지만, 우리는 참여 접시의 작품과 전화 번호를 줄이기 위해 계란 접시를 사용하실 수 있습니다. 우리 프로토콜은 계란 접시 및 웜의 준비로 시작하고 다음 바이오 래드 PDS-1000/He Hepta 시스템을 사용하여 충격 프로토콜에 중점을 둡니다. 우리는 Berezikov 외 7 직장에서 일부의 프로토콜을 적응.
폭격으로 UNC - 119 유전자는 일반적으로 유전자 변형 동물에 대한 표지로 사용됩니다. 이 변이를 가지고 웜 변종이 심각하게 uncoordinated하고 거의 이동 외모 땅딸막한하고 있으며, dauer의 애벌레 8 양식 수 없습니다. dauer은 불리한 조건에서 생식 성인에 개발을 지연하는 데 사용되는 대체 애벌레 단계이며, dauer에 항목이 여러 유전자 9 규제입니다. UNC - 119 유전자를 가지고 몇 가지 계통 C.에서 구할 수 있습니다 엘레간스 유전학 센터 (CGC, 미네 아 폴리스, MN). 원래 DP38 스트레인 (UNC - 119 (ed3)가)도 하류 실험에 영향을 미칠 수있는 관련이없는 dauer - 형성 제정 (DAF - C) 변이를 수행합니다. 여러 실험실이 변이를 outcrossed 있고, HT1593 긴장이 CGC에서 구할 수 있습니다. 우리는 유전자 변형 동물이 다소 DP38 변형들과 자신을 동일시하기 쉽게하고 유전자 변형 동물을 만드는이 변형을 사용하는 경향이 것을 발견했습니다. 필요한 경우, 우리는 DAF - C 변이를 제거하는 유전자 변형 벌레를 outcross하는 HT1593을 사용합니다. transgenes을 준비하는 동안 우리는 성장 접시의 재고를 유지하므로 DP38 벌레가 성장하기 것은 프로토콜에 가장 느린 단계 중 하나입니다.
관심의 유전자와 함께 UNC - 119 마커의 표현이 정상적인 운동성 및 신체 크기 5 구조에 따라 transgene을 표현하는 동물을 쉽게 확인하실 수 있습니다. UNC - 119 유전자는 작은 C. 여러 소스와 벡터 UNC - 119 게놈 DNA를 사용하여 UNC - 119 발기인 및 cDNA, 그리고 게놈 DNA에서 얻을 수 있습니다 briggsiae 유전자는 8,10를 사용하고 있습니다. 우리는 최근 동종 재조합 11 유전자 변형 동물에게 12을 생성하는 Cre 호텔 - 훈제 연어의 재조합에 의해 UNC - 119 유전자를 수행하는 웜 fosmids를 수정하는 방법으로 암피실린 저항 유전자를 포함하는 플라스미드에 UNC - 119 카세트를 추가하는 간단한 프로토콜을 설명했다. plasmids은 Addgene 주식 회사 (캠브리지, MA)에서 사용할 수 있습니다.
하나의 폭격을 수행 관련된 노력이 중요하지만, 관리하는 동안, 하루에 여러 bombardments 수행에 관련된 추가 작업을 최소화합니다. 따라서, 우리는 정기적으로 각 생성에 관련된 작업을 감소하기 위해 유전자 변형 벌레의 생산 클러스터.
1. 에그 플레이트 준비
UNC - 119 돌연변이 웜 때문에 그들은 접시의 다른 부분은 여전히 음식을 포함하는 동안 접시의 부품에 굶어하는 경향들이 장애인 이동성 표준 NGM 접시에 성장 어렵습니다. 계란 접시에 두꺼운 식품 레이어가 UNC - 119 웜보다 쉽게 크롤 링하고 모든 접시 7 대신할 수로 에그 번호판이 문제를 해결. 계란 접시는 또한 적은 접시가 13 필요하므로 벌레 다수의 성장을 지원하는 혜택을했습니다. 보통 5 계란 접시 하나 폭격을 위해 벌레를 성장하기에 충분합니다. 아래의 제조법은 약 50 접시하게하지만, 원하는 경우에는 적은 수 있도록 halved 수 있습니다.
우리가 접시에 항생제와 antifungal 약물 모두를 사용하고 오직 접시 시딩에 대한 차아 염소 산염 처리에 의해 생성된 계란을 사용하므로 계란 접시 쉽게 오염이 될 수 있습니다.
1 일 :
- 500mL 병 속에 LB (400 ML)를 준비합니다. 20 분 대한 압력솥.
- 2 % 한천과 1리터 팡가를 사용하여 ~ 50 10cm 팡가 번호판을 붓고. 우리는 200 μg / ML 13 리터와 스트렙토 마이신 당 nystatin 10 ML를 추가합니다.
- 200 μg / ML 스트렙토 마이신과 LB에 OP50 - 1의 40 ML 야간 문화를 성장. 이 변형은 스트렙토 마이신 저항과 CGC에서 사용할 수 있습니다.
- 의 500mL 병 압력솥다음날.
일 2 :
- 멸균 병에 10 닭고기 계란 별도의 yolks. 우리는 노른자 구분 (대상을 포함한 가정용 매장에서 사용 가능)을 사용합니다. 흔들어.
- LB와 400mL에 볼륨을 가져와. 악수
- 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다.
- 실내 온도 쿨.
- OP50 - 1 40mL를 추가합니다. 악수
- 판 당 혼합물의 5-8 ML를 배포합니다.
- 접시가 하룻밤 실온에서 정착하도록 허용합니다.
3 일 :
- 부드럽게 접시에 남아있는 액체를 부어. 하룻밤 상온에서에서 뚜껑과 건조하도록 허용합니다.
일 4 :
- 필요한 ° C까지 4 상자나 비닐 봉지와 가게에 접시를 넣어. 이 번호판은 1-2 개월 동안 사용하도록 확인하는 나타납니다.
2. 에그 플레이트을 심는
- 최근에 굶주린 접시에 집중 OP50을 추가하여 6cm 팡가 플레이트에 DP38 벌레를 확장합니다. 하나의 충격에 대해서는 종자 5 계란 접시에 작은 접시 ~ 6을 사용합니다. 여러 bombardments을 위해, 우리는 계란 접시을 심는 전에 대신 씨앗이 풍부한 펩톤 플레이트에있는 작은 접시를 사용합니다.
- 차아 염소 산염 13,14의 사용을 통해 DP38 웜에서 계란을 분리. 무균 S - 기초 또는 M9 버퍼 13,14에 계란을 Resuspend.
- 계란 접시의 해당 번호로 달걀 (플레이트 당> 10,000) 추가합니다. 충격에 사용할 7-10일 20 ° C에서 계란 접시에있는 벌레를 성장. 번호판이 벌레는 접시에서 음식을 취소하고 일단 시작되면 사용할 수 있습니다. 이 번호판은 굶어과 이상에 대한 기간이 증가하면 웜 수율을 개선하는 것입니다 정말 열심히하고 있습니다.
충격
우리는 미리 황금 주식을 준비하고 ° C 사용을위한 4 저장되어 유지. 또한 필요는 얼룩이없는 그리고 10cm 팡가 번호판을 발견하고 있습니다. 얼룩이없는 접시는 사전에 잘 붓고 철저하게 벌레와 함께 추가된 액체의 흡수를 용이하게하기 위해 건조 허용해야합니다.
처음엔 DNA - 코팅 금 입자를 준비 시작 폭격의 날, 우리는 벌레를 씻어. 우리는 다음 얼룩이없는 팡가 플레이트에 벌레를 추가하고 금 입자를 세척하고 macrocarriers에게 전송 완료.
골드 입자 준비 :
- 1.7mL 튜브에 금 입자의 60mg을 무게와 15에 대한 70 %의 에탄올에 만끽해보세요. 금 입자를 침전하기 위해 간단히 스핀.
- 무균 물에 3 번 세척하고 금괴를 수집하기 위해 간단히 때마다 스핀.
- 50% 무균 글리세롤의 1mL에 금을 Resuspend. 이것은 주식 골드 입자 솔루션이며, 4 개월 동안 저장할 수 있습니다 ° C.
웜 :
- S - 기초 또는 M9 버퍼와 함께 계란 접시에서 DP38 벌레를 플로트와 50mL 원뿔 관에게 전송할 수 있습니다.
- 웜은 아래에까지 벤치에 튜브를 유지. 다음 버퍼를 대기음 신선한 S - 기초 또는 M9를 추가합니다. 버퍼 조각이 비교적 명확 때까지, 2 또는 3 번 씻으십시오. DNA를 코팅이 완료될 때까지이 단계에서 웜 보관하십시오.
- 기음과 폭격 당 버퍼에 벌레 약 2-3 ML 두십시오. 얼음 10cm 얼룩이없는 팡가 플레이트로 전송. 팡가 플레이트가 충돌하기 전에 완전히 건조해야합니다로 전송 볼륨을 최소화 중요합니다. 벌레와 함께 접시의 전체 표면을 커버해야합니다.
- 접시 얼음 건조하도록 허용합니다. 얼음이 건조하는 동안 clumping에서 벌레를 방지할 수 있습니다.
이 단계는 중요합니다 : 접시는 건조해야하며 벌레가 균일하게 팡가 판에 분산. 얼음 벌레를 유지하면 접시 더미로 이동하고 통합에서 그들을 방지합니다.
DNA 준비 (한 충격에 대한)
- 1.7mL 튜브에 혼합 :
- 50μl 금 입자. 추가하기 전에 철저히 Resuspend.
- 50μl DNA (10 - 15ug). 우리는 원형 또는 선형의 DNA 사이의 작은 차이를 참조하십시오. 보통 우리는 (Qiagen 주식 회사, 발렌시아, CA) DNA의 정화를 위해 Qiagen midiprep 카트리지를 사용합니다.
- 50μl 2.5M CaCl 2. 이 솔루션은 실온에서 몇 주 동안 안정합니다.
- 20μl 0.1M spermidine.
spermidine은 수용액에서 불안정합니다. 우리는 -20 ° C.에 70μl spermidine의 aliquots 및 저장을 우리는 다음 0.1M 솔루션을 얻기 위해 바로 사용하기 전에 물을 1mL 추가할 수 있습니다. 이 솔루션은 각 폭격 신선한 준비하셔야합니다.
vortexing하면서 우리는 일반적으로 와동 다음 골드 낮은 속도로 1.7mL 튜브 입자 및 CaCl 2, DNA와 spermidine / 프로타민 dropwise를 추가합니다. 인산 칼슘과 transfected 가지고있는 사람들에게이 기술은 잘됩니다.
우리는 아주 좋은 결과를 15 대신 spermidine의 프로타민에도 사용합니다. 우리는 물 속에 새로운 솔루션 (1mg/mL)를 준비하고 우리가E 50μl 대신 spermidine의 20μl. 우리가 프로타민 사용하는 경우, 우리는 일반적으로 대신 얼음에 넣어 10 분 동안 상온에서 혼합을 품어. 프로타민는 냉동 보관을하지 않아도 및 분말 액체 대신합니다.
- 30 분 대한 얼음 혼합물을 품어하고, 주기적으로 정지에서 금 입자를 유지 섞는다. 그렇다면 간단히 회전 및 뜨는을 대기음.
- 300μl 70 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀.
- 1mL 100 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀.
- 170μl 100 % 에탄올에 Resuspend.
macrocarriers의 준비 :
- 2 프로파놀 7 macrocarriers을 (바이오 - 래드 연구소, 헤라클레스, CA) 린스. 조직 종이에 넣고 실온에서 그들을 말리면.
- 각 macrocarrier의 중심에 DNA / 골드 혼합의 20μl를 추가합니다. 정지에있는 금괴를 유지하는 pipetting 전에 와동 오른쪽해야합니다.
- 에탄올이 증발하자.
3. 충격
실험 시스템을 통해 헬륨을 내리려고하기 전에 빈 폭격을 수행할 수 있어야합니다.
- 진공 펌프와 가까운 진공 펌프 트랩을 켜십시오. 우리는 석유가없는 진공 펌프를 사용합니다.
- 헬륨 탱크를 켜십시오. 그 압력이 2200psi입니다 ≥ 확인하십시오.
- 2 프로파놀에 젖은 파열 디스크가 (1350 PSI), hepta 어댑터에 뚜껑을 유지에 배치.
- PDS - 1000 시스템에 어댑터를 나사와 공급 토크 렌치로 조입니다.
- 홀더 및 좌석 그들 제공된 도구로 7 macrocarriers를 놓습니다. 다음 소유자에 hepta 정지 화면과 바닥을 넣어. 위에서 두 번째 선반에 이상 홀더와 장소를 뒤집기. macrocarriers의 황금 발견 측면이 시점에서 아래로 향하게해야합니다.
- hepta 어댑터의 콘센트와 macrocarrier 홀더의 상단에있는 구멍을 맞춥니다.
- 충격 챔버에서 가장 낮은 선반에 벌레 (덮개 해제)로 코팅 팡가 접시를 놓습니다.
- 완전히 PDS - 1000에 진공 흐름 속도 노브를 엽니다. 챔버는 HG 26에 도달할 때까지 VAC 버튼을 누르십시오. 다음 진공을 유지하기 위해 위치를 고수로 전환합니다.
- 디스크 파열까지 화재 버튼을 누르고 있습니다. 압력이 1350psi에 도달하면 이런 현상이 발생합니다. 때로는 이것이 발생하는 5-20초 걸립니다. 단추를 놓습니다.
- 챔버 (환기 위치)에서 진공을 출시하고, 플레이트를 제거합니다.
- 진공 및 헬륨 꺼.
- 라인 헬륨 (헬륨 게이지가 0 PSI를 표시한다)가 포함되어 있지 않습니다 때까지 여러 번 화재.
- PDS - 1000 시스템을 끄십시오.
충격 후 웜 복구 :
- ° C 20 분 20 포격 접시를 남겨주세요.
- 10 ML S - 기초 또는 M9 버퍼 접시에서 벌레를 플로트.
- 10cm 발견 팡가 플레이트 - 20 0.5mL 벌레를 넣어.
- 약 2 주 동안 ° C 또는 객실 온도 (22-24 ° C) 구조 벌레에 대한 확인하기 전에 20 둡니다.
- 해부 현미경으로 UNC - 119 (+) 표현형과 벌레에 대한 화면. 구조 웜이 아닌 구조의 웜 이상 생존 이점을 가지고 이후 플레이트가 굶어 죽었 후 심사를위한 최적의 시간입니다.
- 구조 벌레를 포함된 각 10cm 접시에서 한 개인의 라인을 생성합니다.
4. 대표 결과
유전자 변형 동물을 얻기에 관해서와 프로토콜의 성공은 특정 transgene에 따라 달라집니다. 발기인의 경우 : GFP의 기자 transgenes 우리 20 라인까지 취득했습니다. 보다 일반적인 결과는 3-10 행이다. 최대 형질 라인의 30 %에 통합 라인은 있지만, 이것은 임의이며 통합된 라인이 특히 필요한 경우 우리가 하루에 여러 bombardments을 수행합니다.
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Discussion
Biolistic 폭격 C. 포함한 많은 생물에 외국의 DNA를 소개하는 간단한 방법입니다 엘레간스 1,5,6,7,16. 그것은 CaCl 2의 면전에서 DNA와 복잡한를 형성 금 입자에 의존하고 있습니다. 같은 spermidine과 같은 양이온 polyamines은 생체내의 nuclease 저하로부터 DNA를 보호합니다. spermidine는 불안 정한 분자이기 때문에, 그것은 -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장하고, 바로 폭격을 수행하기 전에 솔루션을 확인하는 것이 중요합니다. 우리가 폭격 프로토콜에 설명한 바와 같이, 프로타민 외국 DNA 15을 제공하는 대신 spermidine의 사용할 수 있습니다. 프로타민은 상온에서보다 안정되고 대신 점성 액체 분말되는 장점이 있습니다.
UNC - 119 구조 유전자는 transgene 같은 플라스미드 또는 이전 코팅 골드 입자를 transgene와 함께 혼합되어 별도의 플라스미드에 CIS에서 어느 위치 수 있습니다. 하나 이상의 plasmids의 혼합은 일반적으로 성공하지만, 우리와 다른 여러 plasmids과 벌레의 폭격 몇 가지를 들고 유전자 변형 동물을 만들 수 것으로 나타났습니다, 전부는 아니지만 plasmids은 6,11. 플라스미드 transgene에 UNC - 119 유전자를 삽입 촉진하기 위해, 우리는 최근 거의 모든 plasmids 11 암피실린 저항 유전자에 UNC - 119 유전자를 삽입하는 상동 재조합을 사용하여 프로토콜을 설명했다.
또한, UNC - 119 돌연변이 부족한 웜 변종에 DP38 부담에서 이동 transgenes을 촉진하기 위하여, 우리는 mCherry 11 융합 UNC - 119와 플라스미드를 생성. 판 -의 연결 mCherry의 형광 그러면 유전 배경 11 다양한 transgene의 존재를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
일부 transgenes는 약한 표현이나 무대 특정 표현에 의한 폭격 이후 감지하기 어려울 수 있습니다. transgene의 존재는 유전자 변형 벌레를 사용하여 PCR의 사용을 통해 자주 확인하실 수 있습니다. 약한 표정으로 transgenes 경우, 추가 bombardments를 수행하는 것은 강한 표현과 라인의 신분으로 이어질 수 있습니다. 반면, 화합물이나 공촛점 현미경의 사용은 종종 형광 단백질의 표현을 시각과 함께 도움을 줄 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 ALF에 피츠버그, NIH 교부금 AG028977 대학에서 씨앗 기금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamine | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| PDS-1000/He Hepta System | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 |
References
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미생물학 제 42 C. 엘레간스 유전자 변형 동물 재조합 DNA UNC - 119 microparticle 충격 transgeneErratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012.
Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect. The volume has been corrected from:
The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 70μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.
to:
The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 16μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.
