Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

Summary

Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en

Abstract

El número de laboratorios que utilizan el nematodo C. vida libre elegans está creciendo rápidamente. La popularidad de este modelo biológico se atribuye a un tiempo de generación rápida y corta vida, fácil mantenimiento y bajo costo, el genoma secuenciado en su totalidad, y la variedad de recursos de ARN de interferencia y los animales mutantes. Además, el análisis de la C. elegans genoma revela una gran similitud entre los gusanos y los vertebrados superiores, lo que sugiere que la investigación en los gusanos podrían ser un complemento importante a los estudios realizados en ratones enteros o células cultivadas. Una parte muy importante de la investigación y el gusano es la capacidad de utilizar animales transgénicos para estudiar la localización de genes y su función. Los animales transgénicos pueden ser creadas a través de la microinyección de la línea germinal o gusano a través del uso de bombardeos biolística. El bombardeo es una técnica más reciente y menos conocida de una serie de laboratorios. A continuación se describe un protocolo sencillo para generar gusanos transgénicos por el bombardeo con partículas de oro biolística con el Bio-Rad PDS-1000 del sistema. En comparación con microinyección de ADN en la línea germinal hermafrodita, este protocolo tiene la ventaja de no requerir habilidades especiales de los operadores en lo que respecta a la identificación de la anatomía del gusano o la realización de la microinyección. Además varias líneas transgénicas se obtienen generalmente a partir de un bombardeo sola. También a diferencia de la microinyección, el bombardeo biolística produce animales transgénicos con ambas matrices extracromosómico y transgenes integrados. La capacidad de obtener integrada líneas transgénicas puede evitar el uso de protocolos mutagénico para integrar ADN ajeno. En conclusión, el bombardeo biolística puede ser un método atractivo para la generación de animales transgénicos, en especial para los investigadores no están interesados ​​en invertir tiempo y esfuerzo necesario para aprender a microinyección.

Protocol

Información general

Tradicionalmente los gusanos transgénicos fueron generados por la microinyección de ADN transgénico en el C. elegans germinal ^1,2,3,4. Mientras el éxito, este enfoque requiere de equipo especializado y el desarrollo de la experiencia con la anatomía del gusano y la técnica de microinyección. Más recientemente, el bombardeo biolística ha sido desarrollado como un enfoque alternativo que utiliza el ADN partículas recubiertas de oro para introducir ADN extraño en la línea germinal ^5,6. Este enfoque requiere menos inversión de tiempo en términos de práctica para tener éxito.

El bombardeo de biolística C. elegans para generar gusanos transgénicos tiene una eficiencia baja en el nivel de la lombriz individual para el éxito requiere una gran cantidad de animales. Estos se pueden cultivar en varias formas, pero nosotros usamos placas de huevo para reducir el trabajo y el número de placas en cuestión. Nuestro protocolo se inicia con la preparación de los platos de huevos y gusanos, y se centra en el protocolo mediante el bombardeo de Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Hemos adaptado nuestro protocolo, en parte, del trabajo de Berezikov et al ^7.

Con el bombardeo, el gen unc-119 se usa generalmente como un indicador de animales transgénicos. Cepas del gusano lleva esta mutación están muy coordinados y se mueven a duras penas, se regordete de aspecto, y son incapaces de formar larvas Dauer ^8. El Dauer es una etapa larval alternativo que se utiliza para retrasar el desarrollo de un adulto reproductivo en condiciones adversas, y la entrada en Dauer está regulado por múltiples genes ^9. Varias cepas portadoras del gen unc-119 están disponibles en el C. elegans Centro de Genética (CGC, Minneapolis, MN). El original DP38 cepa (UNC-119 (ED3)) también tiene una formación relacionada Dauer-constitutiva (daf-c) una mutación que pudiera afectar los experimentos posteriores. Varios laboratorios han outcrossed esta mutación, y la cepa HT1593 está disponible en la CGC. Nos encontramos con que los animales transgénicos son más fáciles de identificar con la cepa DP38 y tienden a usar esta cepa para la creación de animales transgénicos. Cuando es necesario, se HT1593 a la polinización cruzada de los gusanos transgénicos para eliminar la mutación daf-c. Obtener el DP38 gusanos para crecer es uno de los más lentos pasos del protocolo por lo que mantener un stock de placas de crecimiento, mientras que la preparación de los transgenes.

Expresión del marcador de UNC-119 junto con el gen de interés permite una fácil identificación de los animales que expresan el transgén basado en el rescate de la motilidad normal y el tamaño del cuerpo ^5. La UNC-119 genes se pueden obtener de varias fuentes y vectores utilizando el ADN genómico unc-119, unc-119 y promotor de cDNA y el ADN genómico de los más pequeños C. briggsiae gen se utilizan ^8,10. Recientemente hemos descrito un protocolo simple de añadir un cassette de UNC-119 a cualquier plásmido que contiene un gen de resistencia a la ampicilina por recombinación homóloga ¹¹ y un método para modificar fosmids gusano para transportar el gen unc-119 por Cre-lox de recombinación para generar animales transgénicos ^12. Los plásmidos están disponibles en Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Mientras que el esfuerzo en la realización de un bombardeo solo es significativa pero manejable, el trabajo adicional que supone realizar bombardeos múltiples en un solo día es mínima. En consecuencia, de manera rutinaria cluster de la producción de gusanos transgénicos para reducir el trabajo necesario para la generación de cada uno.

1. Huevo Preparación Plate

Los gusanos unc-119 mutantes son difíciles de cultivar en placas NGM estándar, ya que con sus problemas de movilidad tienden a morir de hambre en las partes de una placa, mientras que otras partes de la placa todavía contienen los alimentos. Platos de huevo resolver este problema ya que la capa gruesa de alimentos en los platos de huevos permite unc-119 lombrices para rastrear más fácilmente y para hacerse cargo de toda la plata ^7. Las placas de huevo también tiene la ventaja de apoyar el crecimiento de un gran número de gusanos que menos se necesitan ¹³ planchas. Por lo general, cinco platos de huevo son suficientes para criar gusanos de un bombardeo. La receta a continuación hace unos 50 platos, pero pueden reducirse a la mitad para hacer menos, si lo desea.

Las placas de huevo puede llegar a ser fácilmente contaminados por lo que usamos los antibióticos y antifúngicos en las placas y sólo utilizar los huevos generados por el tratamiento de hipoclorito para la siembra de las placas.

Día 1:

1. Prepare LB (400 ml) en una botella de 500 ml. Autoclave de 20 minutos.
2. Vierta ~ 50 10 cm placas de redes de próxima generación con un litro redes de próxima generación con 2% de agar. Añadimos nistatina 10 ml por litro y la estreptomicina a 200 mg / ml ^13.
3. Cultivar una cultura de 40 ml durante la noche del OP50-1 en LB con 200 mg / ml de estreptomicina. Esta variedad es resistente a la estreptomicina y la disposición de CGC.
4. Autoclave de una botella de 500 ml paraal día siguiente.

Día 2:

1. Yemas por separado de 10 huevos de gallina en el frasco estéril. Nosotros utilizamos un separador de yema de huevo (disponible en tiendas para el hogar, incluyendo a Target). Shake.
2. Alcanzar un volumen de 400 ml con LB. Movimiento
3. Se incuba a 60 ° C durante 1 hora.
4. Enfriar a temperatura ambiente.
5. Añadir 40 ml de OP50-1. Movimiento
6. Distribuir 5.8 mL de la mezcla por placa.
7. Permita que las placas para ubicarse en la temperatura ambiente durante la noche.

Día 3:

1. Suavemente vierta el líquido residual de las placas. Deje que se seque con tapas de noche a temperatura ambiente.

Día 4:

1. Ponga las placas en una caja o bolsa de plástico y se almacenan a 4 ° C hasta que se necesite. Estas placas parecen estar bien usar durante 1-2 meses.

2. La siembra de las placas de huevo

1. Ampliar el DP38 gusanos de 6 cm placas de redes de próxima generación mediante la adición de concentrados OP50 a las placas recientemente muerto de hambre. Para un solo bombardeo, usamos ~ 6 platos pequeños para las placas de semillas de huevo 5. De bombardeos múltiples, usamos las planchas menores de dos placas en lugar de semillas enriquecidas peptona antes de la siembra de las placas de huevo.
2. Aislar a los huevos de los gusanos a través del DP38 el uso de hipoclorito de ^13,14. Resuspender los huevos estériles en buffers S-basal o M9 ^13,14.
3. Añadir los huevos (> 10.000 por placa) con el número adecuado de placas de huevo. Crecen los gusanos en los platos de huevos a 20 ° C durante 7-10 días de uso para el bombardeo. Las placas estarán listas para usar una vez que los gusanos han comenzado a limpiar la comida de los platos. Estas placas son muy difíciles de matar de hambre y cada vez durante más tiempo que mejora el rendimiento del gusano.

Bombardeo

Preparamos las existencias de oro antes de tiempo y mantenerla almacenada a 4 ° C para su uso. También se necesitan no están manchados y moteados 10 cm placas de redes de próxima generación. Las placas deben ser sin mancha derramada con suficiente antelación y se deja secar por completo para facilitar la absorción del líquido añadido con los gusanos.

En el día de los bombardeos, que lavar los gusanos primero y luego comenzar a preparar el ADN de las partículas recubiertas de oro. A continuación, añadir a los gusanos a la mancha placas de redes de próxima generación y terminar de lavar las partículas de oro y su transferencia a la macrocarriers.

Preparación de partículas de oro:

1. Pesar 60 mg de partículas de oro en un tubo de 1.7mL y de inmersión en etanol al 70% durante 15 min. Girar brevemente para precipitar las partículas de oro.
2. Lavar 3 veces en agua estéril y girar durante unos instantes para recoger el oro.
3. Resuspender el oro en 1 ml de 50% de glicerol estéril. Este es el oro de la solución madre de partículas y pueden ser almacenados durante meses a 4 ° C.

Worms:

1. Flotar el DP38 gusanos de las placas de huevo con tampón S-basal o M9 y transferirlos a un tubo de 50 ml cónicos.
2. Mantener los tubos en el banco hasta que los gusanos se encuentran en la parte inferior. Y aspirar el buffer y añadir nuevos S-basal o M9. Lavar 2 o 3 veces, hasta memoria es relativamente libre de residuos. Mantenga a los gusanos en este paso hasta que el recubrimiento del ADN se ha completado.
3. Aspirar y dejar unos 2-3 ml de gusanos en el buffer por los bombardeos. Pasar a un plato de 10 cm sin mancha redes de próxima generación en el hielo. Es importante reducir al mínimo el volumen transferido en la placa de redes de próxima generación tendrá que secar por completo antes del bombardeo. Asegúrese de cubrir toda la superficie de la placa con los gusanos.
4. Permitir que se seque la placa sobre el hielo. El hielo se evitará que los gusanos se acumulen durante el secado.

Este paso es importante: la placa debe estar seca y los gusanos distribuidas uniformemente en la placa de NGA. Mantener a los gusanos en el hielo les impide moverse en el plato y agregar en pilas.

Preparación del ADN (para un bombardeo):

1. Mezclar en un tubo de 1.7mL:
   • 50μl partículas de oro. Resuspender bien antes de añadir.
   • 50μl de ADN (10-15ug). Vemos una pequeña diferencia entre el ADN circular o lineal. Por lo general se utiliza cartuchos de Qiagen Midiprep de purificación de ADN (Qiagen Inc, Valencia, CA).
   • 50μl 2,5 M de CaCl _2. Esta solución es estable durante varias semanas a temperatura ambiente.
   • 20μl 0,1 M espermidina.
     
     La espermidina es inestable en solución acuosa. Hacemos alícuotas de 70μl espermidina y almacenar a -20 ° C. A continuación, añadir 1 ml de agua justo antes de su uso para obtener una solución 0,1 M. Esta solución debe prepararse para cada bombardeo.
     
     Por lo general, el vórtice partículas de oro en un tubo de 1.7mL a una velocidad baja y agregue el _CaCl2, ADN y espermidina / gota a gota, mientras que la protamina agitación. Para las personas que han transfectadas con fosfato de calcio esta técnica es familiar.
     
     También hemos utilizado protamina en lugar de la espermidina con muy buenos resultados ^15. Se prepara una solución fresca (1mg/ml) en el agua y nosotrose 50μl en lugar de la 20μl de la espermidina. Si usamos la protamina, por lo general se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos en lugar de colocar en el hielo. Protamina no deben mantenerse congelados y es un polvo en lugar de un líquido.
2. Incubar la mezcla en hielo durante 30 minutos, y periódicamente se mezclan para mantener las partículas de oro en suspensión. A continuación, girar brevemente y aspirar el sobrenadante.
3. Lavar con 300μl etanol al 70%. Girar brevemente.
4. Lavar con 1 ml de etanol al 100%. Girar brevemente.
5. Resuspender en 170μl etanol al 100%.

Preparación de macrocarriers:

1. Enjuague 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en 2-propanol. Ponerlas sobre un papel absorbente y dejar secar a temperatura ambiente.
2. Añadir 20μl de la mezcla de ADN / oro en el centro de cada macrocarrier. Asegúrese de hacer vórtice antes de pipetear para mantener el oro en suspensión.
3. Deje que el etanol se evapore.

3. Bombardeo

Asegúrese de realizar un bombardeo en blanco antes de que el experimento para eliminar el helio en el sistema.

1. Encienda la bomba de vacío y una trampa cerca de la bomba de vacío. Usamos una bomba de vacío libre de aceite.
2. A su vez en el tanque de helio. Comprobar que la presión es ≥ 2200psi.
3. Disco de ruptura mojado (1350 psi) en 2-propanol, colocando en la retención de la tapa para hepta adaptador.
4. Atornillar el adaptador en PDS-1000 del sistema y apriete con la llave de par suministrado.
5. Lugar el 7 macrocarriers en el soporte y el asiento con la herramienta suministrada. A continuación, poner una pantalla de detención hepta y el fondo sobre el agricultor. Da la vuelta al titular y colóquelo en el segundo estante de arriba. El lado de oro manchado del macrocarriers debe estar mirando hacia abajo en este punto.
6. Alinear los agujeros en la parte superior del soporte macrocarrier con las salidas del adaptador hepta.
7. Coloque la placa de redes de próxima generación recubierto de gusanos (de tapa) en el estante más bajo en la cámara de bombardeo.
8. Completamente abierto el vacío caudal mando de la PDS-1000. Pulse el botón de vacunas hasta la cámara alcanza los 26 en Hg. Luego cambiar a mantener la posición de mantener el vacío.
9. Presione y mantenga presionado el botón de disparo hasta que se rompe el disco. Esto sucederá cuando la presión alcanza 1350psi. A veces esto toma 20.5 segundos en ocurrir. Suelte el botón.
10. De liberación de vacío de la cámara (posición de ventilación), y retire la placa.
11. A su vez de vacío y de helio.
12. El fuego varias veces hasta que la línea no contiene helio (helio indicador debe marcar 0 psi).
13. Apague el sistema PDS-1000.

Gusano de recuperación después del bombardeo:

1. Dejar la placa bombardeada a 20 ° C durante 20 minutos.
2. Flotan los gusanos de la placa con 10 ml de tampón S-basal o M9.
3. Poner gusanos 0,5 ml de 20 a 10 cm descubierto placas NGA.
4. Deja a 20 ° C de temperatura o ambiente (22-24 ° C) durante aproximadamente 2 semanas antes de comprobar si los gusanos rescatados.
5. Pantalla de gusanos con el fenotipo de la UNC-119 (+) con un microscopio de disección. El momento óptimo para la investigación es después de las placas han muerto de hambre ya que los gusanos se han rescatado más de ventaja en la supervivencia no rescató a los gusanos.
6. Generar una línea individual de cada placa de 10 cm que contenían gusanos rescatados.

4. Resultados representante

El éxito del protocolo en lo que respecta a la obtención de animales transgénicos depende del transgén en particular. Para el promotor: transgenes GFP reportero que hemos obtenido hasta 20 líneas. Un resultado más típico es de 3-10 líneas. Hasta el 30% de las líneas transgénicas son líneas integradas, pero esto es al azar y que llevará a cabo bombardeos múltiples en un solo día, si una línea integrada es especialmente deseada.

Discussion

Biolística bombardeo es un método sencillo para introducir ADN extraño en muchos organismos, incluyendo C. elegans ^1,5,6,7,16. Se basa en las partículas de oro formando un complejo con el ADN en presencia de _CaCl2. Poliaminas catiónicas, tales como la espermidina, proteger el ADN de la degradación de la nucleasa en vivo. Dado que la espermidina es una molécula inestable, es importante guardarla en pequeñas alícuotas a -20 ° C, y que la solución adecuada antes de realizar el bombardeo. Como se describió en el protocolo de bombardeo, la protamina puede utilizarse en lugar de la espermidina para entregar ADN extraño ^15. Protamina tiene la ventaja de ser más estable a temperatura ambiente y ser un polvo en lugar de un líquido viscoso.

La UNC-119 genes de rescate puede ser colocado en la CEI sobre el mismo plásmido como el transgén o en un plásmido separado que se mezcla con el transgén antes de recubrir las partículas de oro. Mientras que la mezcla de uno o más plásmidos suele tener éxito, nosotros y otros han encontrado que el bombardeo de los gusanos con múltiples plásmidos pueden crear animales transgénicos que llevan a algunos, pero no todos los ^6,11 de los plásmidos. Para facilitar la colocación del gen unc-119 en el transgén plásmido, descrito recientemente un protocolo de uso de la recombinación homóloga para insertar el gen unc-119 en el gen de resistencia a la ampicilina de casi todos los ¹¹ plásmidos.

Además, para facilitar el movimiento de transgenes la cepa DP38 en cepas de gusanos que carecen de la mutación unc-119, también genera un plásmido con unc-119 fundido a mCherry ^11. La fluorescencia pan-neuronal mCherry se puede utilizar para rastrear la presencia del transgén en una variedad de orígenes genéticos ^11.

Algunos transgenes pueden ser difíciles de detectar después del bombardeo por la expresión débil o una expresión determinada etapa. La presencia del transgén se puede verificar a menudo mediante el uso de PCR utilizando los gusanos transgénicos. De transgenes con expresión débil, realizando bombardeos adicionales puede conducir a la identificación de las líneas con mayor expresión. Como alternativa, el uso de un compuesto o un microscopio confocal a menudo puede ayudar a visualizar la expresión de proteínas fluorescentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556