Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

Summary

Vermi transgenici sono comunemente utilizzati in

Abstract

Il numero di laboratori che si servono libero nematode C. vita elegans è in rapida crescita. La popolarità di questo modello biologico è attribuita ad un tempo di generazione rapida e breve vita, la manutenzione facile e poco costoso, genoma completamente sequenziato, e vasta gamma di risorse RNAi e animali mutanti. Inoltre, l'analisi della C. elegans genoma ha rivelato una grande somiglianza tra vermi e vertebrati superiori, il che suggerisce che la ricerca di vermi potrebbe essere un'aggiunta importante a studi condotti nei topi tutto o in cellule in coltura. Un aspetto importante della ricerca e worm è la capacità di utilizzare animali transgenici per studiare la localizzazione dei geni e la funzione. Animali transgenici possono essere create sia tramite microiniezione della linea germinale verme o attraverso l'uso di bombardamento biolistic. Bombardamento è una tecnica più nuova ed è meno familiare ad una serie di laboratori. Qui descriviamo un semplice protocollo per generare i vermi transgenici dai bombardamenti biolistic con particelle d'oro con il Bio-Rad sistema PDS-1000. Rispetto a microiniezione del DNA in ermafrodita germinale, questo protocollo ha il vantaggio di non richiedere particolari competenze da parte dell'operatore per quanto riguarda l'identificazione o l'esecuzione di anatomia verme microiniezione. Ulteriori più linee transgeniche sono solitamente ottenuti da un singolo bombardamento. Anche in contrasto con microiniezione, bombardamento biolistic produce animali transgenici con entrambi gli array extracromosomico e transgeni integrato. La possibilità di ottenere integrato linee transgeniche possono evitare l'uso di protocolli mutageno di integrare DNA estraneo. In conclusione, bombardamento biolistic può essere un metodo interessante per la generazione di animali transgenici, soprattutto per gli investigatori non sono interessati a investire il tempo e lo sforzo necessario per diventare abili a microiniezione.

Protocol

Panoramica

Tradizionalmente vermi transgenici sono stati generati da microinjecting DNA transgene nel C. elegans germinale ^1,2,3,4. Anche se di successo, questo approccio richiede attrezzature specializzate e lo sviluppo di esperienza con l'anatomia vite senza fine e la tecnica di microiniezione. Più di recente bombardamento biolistic è stato sviluppato come un approccio alternativo che utilizza rivestite di DNA particelle d'oro per introdurre DNA estraneo nella linea germinale ^5,6. Questo approccio richiede investimenti meno tempo in termini di pratica per avere successo.

Il bombardamento biolistic di C. elegans per generare vermi transgenici è bassa efficienza a livello del worm individuo così il successo richiede una grande quantità di animali. Questi possono essere coltivate in diversi modi, ma usiamo le piastre uovo per ridurre il lavoro e numero di piatti coinvolti. Il nostro protocollo inizia con la preparazione di piatti uovo e vermi e poi si concentra sul protocollo bombardamento con il Bio-Rad PDS-1000/He sistema epta. Abbiamo adattato il nostro protocollo, in parte dal lavoro di Berezikov et al ^7.

Con i bombardamenti, il gene unc-119 è in genere utilizzato come marcatore per gli animali transgenici. Ceppi di vite senza fine portando questa mutazione sono gravemente scoordinato e poco movimento, sono losca in apparenza, e non sono in grado di formare le larve dauer ^8. Il dauer è uno stadio larvale alternativa che viene utilizzato per ritardare lo sviluppo di un adulto riproduttivo in condizioni avverse, e l'entrata in dauer è regolata da più geni ^9. Ceppi diversi portando il gene unc-119 sono disponibili presso il C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). L'originale DP38 ceppo (unc-119 (ED3)) comporta anche un estraneo Dauer-formazione costitutivo (daf-c) mutazione che potrebbe influenzare gli esperimenti a valle. Vari laboratori hanno outcrossed questa mutazione, e il ceppo HT1593 è disponibile presso il CGC. Troviamo che gli animali transgenici sono un po 'più facili da identificare con il ceppo DP38 e tendono ad utilizzare questo sforzo per la creazione di animali transgenici. Se necessario, utilizziamo HT1593 per outcross i vermi transgenici per rimuovere il daf-c mutazione. Ottenere il DP38 vermi a crescere è uno dei passi più lenti del protocollo in modo da mantenere uno stock di lastre in crescita durante la preparazione del transgeni.

Espressione del marcatore unc-119 insieme al gene di interesse permette una facile identificazione degli animali esprimono il transgene sulla base di salvataggio della motilità normale e dimensioni del corpo ^5. Il gene unc-119 può essere ottenuto da diverse fonti e vettori usando il DNA genomico unc-119, unc-119 promotore e cDNA, e il DNA genomico per i più piccoli la C. briggsiae gene vengono utilizzati ^8,10. Recentemente abbiamo descritto un protocollo semplice per aggiungere un unc-119 cassette a qualsiasi plasmide contenente un gene di resistenza all'ampicillina per ricombinazione omologa ¹¹ e un metodo per modificare fosmids verme per trasportare il gene unc-119 da Cre-lox ricombinazione di generare animali transgenici ^12. I plasmidi sono disponibili presso Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Mentre l'impegno necessario per l'esecuzione di un bombardamento singolo è significativo, ma gestibile, il lavoro aggiuntivo coinvolti nello svolgimento bombardamenti multipli su un singolo giorno è minimo. Di conseguenza, la produzione di routine grappolo di vermi transgenici per ridurre il lavoro necessario per generare ciascuno.

1. Piastra uovo Preparazione

Il unc-119 vermi mutanti sono difficili da crescere su piastre NGM standard perché con la loro mobilità ridotta tendono a morire di fame su parti di un piatto, mentre altre parti del piatto contengono ancora il cibo. Piastre uovo risolvere questo problema in quanto lo strato di spessore cibo su piatti d'uovo permette unc-119 vermi a strisciare più facilmente e di assolvere a tutti il piatto ^7. Le piastre uovo hanno anche il vantaggio di supportare la crescita di un gran numero di vermi in modo da poche piastre sono necessari ^13. Di solito 5 piatti uova sono sufficienti per crescere worm per un bombardamento. La ricetta qui sotto fa circa 50 piastre, ma può essere dimezzata per rendere meno se lo si desidera.

Le piastre uovo può diventare facilmente contaminati in modo da utilizzare sia gli antibiotici e farmaci antifungini nei piatti e utilizzare solo uova di prodotti dal trattamento di ipoclorito per la semina delle piastre.

1 ° giorno:

1. Preparare LB (400 ml) in una bottiglia da 500 ml. Autoclave per 20 min.
2. Versare ~ 50 10 centimetri piastre NGA con 1 litro SNG con il 2% agar. Noi aggiungiamo nistatina 10 ml per litro e streptomicina a 200 mg / ml ^13.
3. Crescere una cultura durante la notte 40 mL di OP50-1 a LB con 200 mg / ml streptomicina. Questo ceppo è streptomicina resistente e disponibile da CGC.
4. Autoclave una bottiglia di 500 ml pergiorno successivo.

2 ° giorno:

1. Separare i tuorli di 10 uova di gallina nella bottiglia sterile. Usiamo un separatore tuorlo (disponibile nei negozi per la casa, tra cui Target). Shake.
2. Portare il volume di 400mL con LB. Scuotere
3. Incubare a 60 ° C per 1 ora.
4. Raffreddare a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 40 ml di OP50-1. Scuotere
6. Distribuire 5-8 ml di miscela per piastra.
7. Lasciare le piastre a stabilirsi a temperatura ambiente per una notte.

Giorno 3:

1. Delicatamente versare il liquido rimanente dalle piastre. Lasciare asciugare con coperchi su a temperatura ambiente per una notte.

4 ° giorno:

1. Mettere le piastre in una scatola o sacchetto di plastica e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Queste placche sembrano essere OK per l'uso per 1-2 mesi.

2. Semina Piastre Egg

1. Espandere il DP38 vermi 6 centimetri piatti NGA con l'aggiunta di concentrato OP50 alle piastre di recente fame. Per un solo bombardamento, usiamo ~ 6 piatti piccoli semi di 5 piatti all'uovo. Per i bombardamenti più, usiamo le piastre di piccole e invece arricchito di semi 2 piastre peptone prima di seminare le piastre uovo.
2. Isolare le uova dal DP38 worm attraverso l'uso di ipoclorito di ^13,14. Risospendere le uova in sterili buffer S-basale o M9 ^13,14.
3. Aggiungere le uova (> 10.000 per piastra) per il numero appropriato di piatti all'uovo. Crescono i vermi su piatti d'uovo a 20 ° C per 7-10 giorni da utilizzare per il bombardamento. Le piastre saranno pronti per l'uso una volta che il worm hanno iniziato a cancellare il cibo dalle piastre. Questi piatti sono davvero duri a morire di fame e in crescita per periodi più lunghi migliorerà la resa worm.

Bombardamento

Prepariamo le riserve auree in anticipo e tenerlo conservato a 4 ° C per l'uso. Sono necessari anche senza macchia e macchiato 10 centimetri piatti NGA. Le piastre senza macchia deve essere versata in anticipo e lasciati asciugare completamente per facilitare l'assorbimento del liquido aggiunto con i vermi.

Il giorno del bombardamento, laviamo via i vermi prima poi iniziare a preparare il DNA particelle rivestite d'oro. Poi aggiungiamo i vermi alle piastre senza macchia NGA e finire il lavaggio delle particelle d'oro e di trasferirli al macrocarriers.

Particelle d'oro preparazione:

1. Pesare 60 mg di particelle d'oro in un tubo 1.7mL e immergersi nel 70% di etanolo per 15 minuti. Spin brevemente a precipitare le particelle d'oro.
2. Lavare 3 volte in acqua sterile e girare per un breve istante per raccogliere l'oro.
3. Risospendere l'oro in 1 ml di 50% glicerolo sterile. Questo è l'oro soluzione stock delle particelle e può essere conservato per mesi a 4 ° C.

Worms:

1. Float il DP38 vermi fuori i piatti uovo con tampone S-basale o M9 e trasferirli in una provetta da 50mL conica.
2. Mantenere i tubi in panchina fino a quando i vermi sono sul fondo. Poi aspirare il tampone e aggiungere nuovi S-basale o M9. Lavare per 2 o 3 volte, fino a esaurimento buffer è relativamente chiaro di detriti. Tenere il worm in questo passaggio fino a quando il rivestimento del DNA è stata completata.
3. Aspirare e lasciare circa 2-3 mL di vermi in un tampone per bombardamento. Trasferire in una tavola 10 centimetri senza macchia NGA sul ghiaccio. E 'importante ridurre al minimo il volume trasferita come la piastra di NGA dovrà asciugare completamente prima di bombardamento. Assicurarsi di coprire l'intera superficie del piatto con i vermi.
4. Lasciare piatto ad asciugare su ghiaccio. Il ghiaccio impedirà i vermi di aggregazione durante l'asciugatura.

Questo passaggio è importante: la piastra deve essere asciutto e il worm uniformemente dispersi sul piatto NGA. Mantenere i vermi sul ghiaccio impedisce loro di muoversi sul piatto e aggregando in pile.

Preparazione del DNA (per un bombardamento):

1. Mescolare in un tubo 1.7mL:
   • 50μl particelle d'oro. Risospendere accuratamente prima di aggiungere.
   • 50μl del DNA (10-15ug). Vediamo poca differenza tra il DNA circolare o lineare. Di solito si usa cartucce midiprep Qiagen per la purificazione del DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. Questa soluzione è stabile per diverse settimane a temperatura ambiente.
   • 20μl 0.1M spermidina.
     
     La spermidina è instabile in soluzione acquosa. Facciamo aliquote spermidina 70μl e conservare a -20 ° C. Siamo quindi aggiungere 1 ml di acqua a destra prima dell'uso per ottenere una soluzione 0,1 M. Questa soluzione deve essere preparata fresca ogni bombardamento.
     
     Di solito vortice le particelle d'oro in un tubo 1.7mL a bassa velocità e quindi aggiungere il CaCl _2, del DNA e spermidina / protamina goccia a goccia, mentre vortex. Per le persone che hanno transfettate con fosfato di calcio questa tecnica è familiare.
     
     Abbiamo anche usato al posto di protamina spermidina con ottimi risultati ^15. Prepariamo una soluzione fresca (1mg/mL) in acqua e noie 50μl invece del 20μl di spermidina. Se usiamo protamina, di solito incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti invece di mettere sul ghiaccio. Protamina non ha bisogno di essere tenuti congelati ed è una polvere invece di un liquido.
2. Incubare la miscela in ghiaccio per 30min, e periodicamente mix di tenere le particelle d'oro in sospensione. Poi girare brevemente e aspirare il surnatante.
3. Lavare con 300μl etanolo al 70%. Spin brevemente.
4. Lavare con 1 ml di etanolo al 100%. Spin brevemente.
5. Risospendere in 170μl di etanolo al 100%.

Preparazione del macrocarriers:

1. Risciacquare 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-propanolo. Metterle su una carta assorbente e lasciarli asciugare a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 20μl di DNA / oro miscela al centro di ogni macrocarrier. Assicurati di destra vortex prima pipettaggio per mantenere l'oro in sospensione.
3. Lasciate evaporare l'etanolo.

3. Bombardamento

Assicurarsi di effettuare un bombardamento vuoto prima dell'esperimento per irrigare elio attraverso il sistema.

1. Accendere la pompa del vuoto e chiudere trappola pompa del vuoto. Noi utilizziamo un olio privo di pompa a vuoto.
2. Accendere il serbatoio di elio. Controllare che la pressione è ≥ 2200psi.
3. Disco di rottura bagnato (1350 psi) in 2-propanolo, mettendo a mantenere tappo per epta adattatore.
4. Vite di adattatore in PDS-1000 il sistema e serrare con la chiave dinamometrica in dotazione.
5. Posizionare i 7 macrocarriers nel supporto e farli sedere con lo strumento in dotazione. Poi mettere una schermata di arresto epta e il fondo al titolare. Capovolgere il supporto sul luogo e sul secondo scaffale dall'alto. Il lato d'oro macchiato del macrocarriers deve essere rivolto verso il basso, a questo punto.
6. Allineare i fori nella parte superiore del titolare macrocarrier con le prese dell'adattatore epta.
7. Posizionare la piastra NGA rivestito con vermi (off coperchio) nel ripiano più basso in camera di bombardamento.
8. Aprire completamente il flusso manopola vuoto sul PDS-1000. Premere il pulsante vac camera arriva fino a 26 in Hg. Poi passare a mantenere la posizione per mantenere il vuoto.
9. Tenere premuto il pulsante di fuoco fino a rotture del disco. Questo avverrà quando la pressione raggiunge 1350psi. A volte questo richiede 50-20 secondi per verificarsi. Rilasciare il pulsante.
10. Rilascio del vuoto da camera (posizione sfiato), e rimuovere la piastra.
11. Girare a vuoto e si spegne elio.
12. Fuoco più volte fino a quando la linea non contiene elio (elio indicatore dovrebbe segnare 0 psi).
13. Spegnere il sistema PDS-1000.

Recupero verme dopo bombardamento:

1. Lascia la piastra bombardato a 20 ° C per 20 minuti.
2. Galleggiante i vermi dalla piastra con 10 mL di tampone di S-basale o M9.
3. Mettere 0,5 ml worm il 20 - 10 cm macchiato piatti NGA.
4. Lasciare a 20 ° C di temperatura o una stanza (22-24 ° C) per circa 2 settimane prima di verificare per i vermi in salvo.
5. Schermo per i vermi con l'unc-119 (+) fenotipo con un microscopio da dissezione. Il momento ottimale per lo screening è dopo le piastre morti di fame da quando i vermi hanno salvato vantaggio di sopravvivenza per il mancato soccorso vermi.
6. Generare una singola linea di ogni tavola 10 cm, che conteneva i vermi in salvo.

4. Rappresentante Risultati

Il successo del protocollo per quanto riguarda l'ottenimento di animali transgenici dipende dal transgene particolare. Per promotore: transgeni GFP giornalista che abbiamo ottenuto fino a 20 linee. Un risultato più tipico è di 3-10 righe. Fino al 30% delle linee transgeniche sono linee integrate, ma questo è casuale e ci si esibiranno bombardamenti multipli in un solo giorno, se una linea integrata è particolarmente desiderata.

Discussion

Bombardamento Biolistic è un metodo semplice per introdurre DNA estraneo in molti organismi, tra cui C. elegans ^1,5,6,7,16. Si basa su particelle d'oro che formano un complesso con il DNA in presenza di CaCl _2. Poliammine cationiche, come spermidina, proteggere il DNA dalla degradazione nucleasi in vivo. Dal momento che spermidina è una molecola labile, è importante conservarlo in piccole aliquote a -20 ° C, e fare la giusta soluzione prima di eseguire il bombardamento. Come abbiamo descritto nel protocollo bombardamento, protamina può essere usato al posto di spermidina per fornire DNA estraneo ^15. Protamina ha il vantaggio di essere più stabile a temperatura ambiente e di essere una polvere, invece di un liquido viscoso.

Il gene unc-119 di salvataggio può essere posizionato sia in cis sul plasmide stesso del transgene o su un plasmide separato che viene miscelato con il transgene prima del rivestimento delle particelle d'oro. Mentre la miscelazione di una o più plasmidi di solito è successo, noi e altri hanno scoperto che il bombardamento di vermi con plasmidi multiple possono creare animali transgenici portatori alcuni, ma non tutti i plasmidi ^6,11. Per facilitare posizionando il gene unc-119 sul transgene plasmide, abbiamo recentemente descritto un protocollo utilizzando la ricombinazione omologa per inserire il gene unc-119 nel gene di resistenza all'ampicillina di quasi tutti i plasmidi ^11.

Inoltre, per facilitare transgeni in movimento dal ceppo DP38 in ceppi manca il verme unc-119 mutazione, abbiamo anche generato un plasmide con unc-119 fuso a mCherry ^11. Il pan-neuronale fluorescenza mCherry può quindi essere utilizzata per monitorare la presenza del transgene in una varietà di background genetico ^11.

Alcuni transgeni potrebbe essere difficile da rilevare dopo il bombardamento a causa di espressione debole o un'espressione specifica fase. La presenza del transgene può essere verificata spesso attraverso l'uso di PCR con i vermi transgenici. Per i transgeni con espressione debole, eseguendo bombardamenti aggiuntivi possono condurre all'identificazione di linee con forte espressione. In alternativa, l'uso di un composto o di un microscopio confocale spesso può aiutare a visualizzare l'espressione di proteine ​​fluorescenti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556