Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

Summary

Worms transgênicos são comumente usados ​​em

Abstract

O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados ​​em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.

Protocol

Visão global

Worms tradicionalmente transgênicos foram gerados por microinjecting DNA transgene no C. elegans germline ^1,2,3,4. Embora bem-sucedida, esta abordagem necessários equipamentos especializados eo desenvolvimento de experiência com a anatomia verme e da técnica de microinjeção. Mais recentemente bombardeio biobalística foi desenvolvido como uma abordagem alternativa que usa partículas de DNA revestido de ouro para introduzir DNA estranho no ^5,6 germinativas. Essa abordagem requer menos investimento de tempo em termos de prática para se tornar bem sucedido.

O bombardeio de biobalística C. elegans para gerar worms transgênico tem baixa eficiência ao nível do worm individuais para o sucesso requer uma grande quantidade de animais. Estes podem ser cultivadas em várias maneiras, mas nós usamos placas de ovos para reduzir o trabalho eo número de placas envolvidas. Nosso protocolo começa com a preparação de placas de ovos e vermes e, em seguida, centra-se no protocolo de bombardeamento utilizando o Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Nós adaptamos nosso protocolo, em parte, obra de Berezikov et al ^7.

Com o bombardeio, o gene unc-119 é normalmente usado como um marcador para animais transgênicos. Worm cepas carregando essa mutação são severamente descoordenado e pouco movimento, são dumpy na aparência, e são incapazes de formar Dauer larvas ^8. A Dauer é uma fase larval alternativo que é usado para retardar o desenvolvimento de um adulto reprodutivo em condições adversas, ea entrada em Dauer é regulada por múltiplos genes ^9. Várias linhagens com o gene unc-119 estão disponíveis no C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). A cepa DP38 original (unc-119 (ED3)) também traz uma formação constitutiva Dauer-independentes (daf-c) mutação que poderia afetar experimentos a jusante. Vários laboratórios têm outcrossed esta mutação, ea tensão HT1593 está disponível a partir da CGC. Descobrimos que os animais transgênicos são um pouco mais fácil de identificar com a cepa DP38 e tendem a utilizar esta cepa para a criação de animais transgênicos. Quando necessário, usamos HT1593 para outcross os vermes transgênicos para remover a mutação daf-c. Obtendo o DP38 worms para crescer é um dos passos mais lentos no protocolo para que manter um estoque de placas de crescimento durante a preparação do transgenes.

Expressão do marcador unc-119 junto com o gene de interesse permite a fácil identificação dos animais expressando o transgene com base no resgate da motilidade normal e tamanho do corpo ^5. O gene unc-119 pode ser obtido de diversas fontes, e vetores utilizando o DNA genômico unc-119, unc-119 promotor e cDNA e DNA genômico para o menor C. briggsiae gene são utilizados ^8,10. Recentemente, descreveu um protocolo simples para adicionar um cassete unc-119 a qualquer plasmídeo contendo um gene de resistência a ampicilina por recombinação homóloga ¹¹ e um método para modificar fosmids worm para transportar o gene unc-119 por Cre-lox recombinação para gerar animais transgênicos ^12. Os plasmídeos estão disponíveis a partir Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Enquanto o esforço envolvido na realização de um bombardeio único é significativo, mas controlável, o trabalho adicional envolvido na realização de bombardeios múltiplas em um único dia é mínima. Consequentemente, nós rotineiramente agrupar a produção de transgênicos worms para diminuir o trabalho envolvido na geração de cada um.

1. Ovo Preparação Placa

Os vermes unc-119 mutantes são difíceis de crescer em placas NGM padrão, pois com sua mobilidade prejudicada eles tendem a morrer de fome em partes de um prato, enquanto outras partes da placa ainda contêm alimentos. Placas de ovos resolver este problema como a camada espessa de alimentos em pratos de ovos permite unc-119 vermes a rastejar mais facilmente e para assumir todas as placas do ^7. As placas de ovos também têm a vantagem de suportar o crescimento de um grande número de worms para placas que são necessários menos ^13. Geralmente 5 placas de ovo são suficientes para crescer worms para um bombardeio. A receita abaixo faz cerca de 50 pratos, mas pode ser reduzido pela metade para fazer menos, se desejar.

As placas de ovos pode tornar-se facilmente contaminada por isso usamos os antibióticos e antifúngicos nas placas e só usar ovos gerados pelo tratamento de hipoclorito para semear as placas.

Dia 1:

1. Prepare LB (400 mL) em um frasco de 500ml. Autoclave por 20min.
2. Despeje ~ 50 centímetros 10 placas NGA usando um litro NGA com agar 2%. Nós adicionamos 10 mL nistatina por litro e estreptomicina a 200 mcg / mL ^13.
3. Crescer uma cultura de 40 ml durante a noite de OP50-1 em LB com 200 estreptomicina mcg / mL. Esta estirpe é resistente à estreptomicina e disponível a partir de CGC.
4. Autoclave uma garrafa de 500mL dedia seguinte.

Dia 2:

1. Separe as gemas de 10 ovos de galinha para o frasco estéril. Usamos um separador de gema (disponível em lojas da família, incluindo Target). Shake.
2. Traga volume para 400mL com LB. Agitar
3. Incubar a 60 ° C por 1 hora.
4. Arrefecer à temperatura ambiente.
5. Adicionar 40mL de OP50-1. Agitar
6. Distribuir 5-8 mL de mistura por placa.
7. Permitir que as placas para resolver em temperatura ambiente durante a noite.

Dia 3:

1. Gentilmente despeje o líquido restante das placas. Deixe secar com tampas em temperatura ambiente durante a noite.

Dia 4:

1. Colocar placas em uma caixa ou saco plástico e armazenar a 4 ° C até ser necessário. Essas placas parecem ser OK para usar por 1-2 meses.

2. Semeadura Placas Egg

1. Expandir o DP38 worms em 6 centímetros placas NGA adicionando OP50 concentrado para placas recentemente fome. Para um único bombardeio, usamos ~ 6 pratos pequenos para placas de semente cinco ovos. Para vários bombardeios, usamos as placas menores ao invés de sementes enriquecidas 2 placas de peptona antes da semeadura as placas de ovo.
2. Isolar os ovos do DP38 worms através do uso de hipoclorito de ^13,14. Ressuspender os ovos estéreis em buffers S-basal ou M9 ^13,14.
3. Adicione os ovos (> 10 mil por placa) para o número apropriado de placas de ovo. Crescem os vermes em pratos de ovos a 20 ° C por 7-10 dias para uso de bombardeio. As placas estarão prontos para usar uma vez que os vermes começaram a limpar a comida do prato. Essas placas são realmente difíceis de morrer de fome e crescente por períodos mais longos irá melhorar o rendimento worm.

Bombardeamento

Nós preparamos o estoque de ouro antes do tempo e mantê-lo conservado a 4 ° C para o uso. Também são necessários imaculado e viu 10 placas NGA centímetros. As placas sem mancha precisa ser derramado com bastante antecedência e permitiu a secar completamente para facilitar a absorção do líquido adicionado com os vermes.

No dia do bombardeio, que lave os vermes primeiro e depois começar a preparar o DNA revestido por partículas de ouro. Em seguida, adicione os vermes para as placas NGA imaculada e terminar de lavar as partículas de ouro e transferi-las para o macrocarriers.

Preparação de partículas de ouro:

1. Pesar 60 mg de partículas de ouro em um tubo de 1.7mL e mergulhar em etanol 70% por 15min. Girar rapidamente a se precipitar as partículas de ouro.
2. Lavar 3 vezes em água estéril e girar rapidamente a cada vez para coletar o ouro.
3. Ressuspender o ouro em 1mL de glicerol 50% estéril. Esta é a solução de reserva de partículas de ouro e pode ser armazenado durante meses a 4 ° C.

Worms:

1. Flutuar o DP38 worms fora do prato de ovos com tampão de S-basal ou M9 e transferi-los para um tubo de 50 ml cônico.
2. Manter os tubos no banco até que os vermes estão na parte inferior. Em seguida, aspire o buffer e adicionar novos S-basal ou M9. Lave 2 ou 3 vezes, até encher o buffer é relativamente livre de detritos. Manter os worms nesta etapa até que o revestimento DNA está concluída.
3. Aspirar e deixar cerca de 2-3 mL de vermes em tampão por bombardeio. Transfira para uma placa de 10 centímetros NGA imaculada no gelo. É importante minimizar o volume transferido como a placa NGA será necessário secar completamente antes de bombardeio. Certifique-se de cobrir toda a superfície da placa com os vermes.
4. Permitir que a placa para secar no gelo. O gelo irá evitar os vermes se aglomerem durante a secagem.

Este passo é importante: a placa deve estar seca e as minhocas uniformemente dispersas na placa NGA. Mantendo o worms no gelo impede de mover-se sobre a placa e agregando em pilhas.

DNA de preparação (por um bombardeio):

1. Misture em um tubo de 1.7mL:
   • 50μl partículas de ouro. Ressuspender completamente antes de adicionar.
   • 50μl de DNA (10-15ug). Vemos pouca diferença entre DNA circular ou linear. Normalmente usamos cartuchos Qiagen midiprep para a purificação de DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. Esta solução é estável por várias semanas em temperatura ambiente.
   • 20μl espermidina 0,1 M.
     
     A espermidina é instável em solução aquosa. Fazemos alíquotas espermidina 70μl e armazenar a -20 ° C. Em seguida, adicionar 1 ml de água bem antes de usar para obter uma solução 0,1 M. Esta solução deve ser renovada a cada bombardeio.
     
     Nós geralmente vortex as partículas de ouro em um tubo 1.7mL a uma velocidade baixa e adicione o CaCl _2, DNA e espermidina / gotas de protamina, enquanto vórtex. Para as pessoas que têm transfectadas com fosfato de cálcio esta técnica é familiar.
     
     Temos também utilizado protamina em vez de espermidina com muito bons resultados ^15. Nós preparamos uma nova solução (1mg/ml) em água e nose 50μl em vez do 20μl de espermidina. Se usarmos de protamina, que geralmente incubar a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos em vez de colocar no gelo. Protamina não precisam ser mantidos congelados e é um pó em vez de um líquido.
2. Incubar a mistura em gelo por 30min, e periodicamente mix para manter as partículas de ouro em suspensão. Em seguida, girar rapidamente e aspirar o sobrenadante.
3. Lavar com etanol 300 ul de 70%. Girar por alguns instantes.
4. Lavar com etanol a 100% 1mL. Girar por alguns instantes.
5. Ressuspender em 170μl de etanol 100%.

Preparação de macrocarriers:

1. Enxágüe 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), em 2-propanol. Coloque-os sobre papel absorvente e deixe-os secar em temperatura ambiente.
2. Adicionar 20μl de DNA / ouro mistura no centro de cada macrocarrier. Certifique-se de direito vortex antes de pipetar para manter o ouro em suspensão.
3. Deixe o álcool evaporar.

3. Bombardeamento

Certifique-se de realizar um bombardeio em branco antes do experimento para lavar hélio através do sistema.

1. Ligue a bomba de vácuo e trap bomba perto de vácuo. Nós usamos uma bomba de vácuo oil-free.
2. Ligue tanque de hélio. Verifique que a pressão é ≥ 2200psi.
3. Disco de ruptura Wet (1350 psi) em 2-propanol, colocando na retenção de tampa para hepta adaptador.
4. Parafuso adaptador no PDS-1000 do sistema e aperte com a chave de torque fornecido.
5. Coloque o 7 macrocarriers no suporte e encaixá-los com a ferramenta fornecida. Em seguida, coloque uma tela de parar hepta e no fundo para o titular. Virar o suporte e coloque na segunda prateleira de cima. O ouro manchado lado do macrocarriers deve estar voltado para baixo neste momento.
6. Alinhe os orifícios no topo do titular macrocarrier com as saídas do adaptador hepta.
7. Coloque a placa NGA revestido com worms (off tampa) na prateleira mais baixa na câmara de bombardeio.
8. Abra completamente a vácuo botão vazão no PDS-1000. Pressione o botão até vac câmara atinge 26 Em Hg. Em seguida, mudar para manter a posição de manter o vácuo.
9. Pressione e segure o botão de tiro até rupturas disco. Isso acontecerá quando a pressão chega a 1350psi. Às vezes, isso leva 50-20 segundos para ocorrer. Solte o botão.
10. Lançamento da câmara de vácuo (posição de ventilação), e remover placa.
11. Por sua vez vácuo e off hélio.
12. Fogo várias vezes até que a linha não contém hélio (medidor de hélio deve marcar 0 psi).
13. Desligue o sistema PDS-1000.

Worm recuperação depois do bombardeamento:

1. Deixe a placa bombardeado a 20 ° C por 20 minutos.
2. Float os vermes da placa com 10 mL de tampão S-basal ou M9.
3. Coloque worms 0,5 ml em 20 - 10 cm placas NGA manchado.
4. Deixe a 20 ° C de temperatura ou quarto (22-24 ° C) por cerca de duas semanas antes de verificar para worms resgatados.
5. Tela para worms com o fenótipo unc-119 (+) com um microscópio de dissecação. O tempo ideal para a triagem é após as placas de ter passado fome desde o worms resgatados ter vantagem de sobrevivência sobre os não-resgatada worms.
6. Gerar uma linha individual de cada placa de 10 cm que continha worms resgatados.

4. Resultados representante

O sucesso do protocolo no que diz respeito à obtenção de animais transgênicos depende do transgene particular. Para promotor: transgenes repórter GFP obtivemos até 20 linhas. Um resultado mais comum é 30-10 linhas. Até 30% das linhagens transgênicas são linhas integradas, mas esta é aleatória e vamos realizar bombardeios múltiplas em um único dia, se uma linha integrada é particularmente desejado.

Discussion

Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans ^1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl _2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Como descrevemos no protocolo de bombardeio, a protamina pode ser usado em vez de espermidina para entregar DNA estranho ^15. Protamina tem a vantagem de ser mais estável à temperatura ambiente e ser um pó em vez de um líquido viscoso.

O gene unc-119 resgate pode ser colocado em cis sobre o plasmídeo mesmo que o transgene ou em um plasmídeo separado que é misturado com o transgene antes do revestimento das partículas de ouro. Enquanto a mistura de um ou mais plasmídeos é geralmente bem sucedido, nós e outros descobriram que bombardeio de worms com plasmídeos múltiplos pode criar animais transgênicos carregando alguns, mas nem todos os plasmídeos ^6,11. Para facilitar a colocação do gene unc-119 sobre o transgene plasmídeo, que descreveu recentemente um protocolo com a recombinação homóloga para inserir o gene unc-119 no gene de resistência a ampicilina de quase todos os ¹¹ plasmídeos.

Além disso, para facilitar a passagem de transgenes a tensão DP38 em cepas de vírus falta a mutação unc-119, que também gerou um plasmídeo com unc-119 fundido a mCherry ^11. O pan-neuronal de fluorescência mCherry pode então ser usado para rastrear a presença do transgene em uma variedade de origens genéticas ^11.

Alguns transgenes pode ser difícil de detectar depois do bombardeamento, devido à fraca expressão ou uma expressão estágio específica. A presença do transgene pode ser verificado, muitas vezes através do uso de PCR usando os vermes transgênicos. Para transgenes com fraca expressão, realizando bombardeios adicionais podem levar à identificação de linhas com mais forte expressão. Alternadamente, o uso de um composto ou um microscópio confocal muitas vezes podem ajudar com a visualização a expressão de proteínas fluorescentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556