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Biology

ट्रांसजेनिक का सृजन सी. एलिगेंस Biolistic परिवर्तन द्वारा

Published: August 23, 2010 doi: 10.3791/2090
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, University of Pittsburgh

ERRATUM NOTICE

Summary

ट्रांसजेनिक कीड़े सामान्यतः में उपयोग किया जाता है

Abstract

मुक्त रहने निमेटोड सी का उपयोग प्रयोगशालाओं की संख्या एलिगेंस तेजी से बढ़ रहा है. इस जैविक मॉडल की लोकप्रियता एक तेजी पीढ़ी समय और कम जीवन अवधि, आसान और सस्ता रखरखाव, पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम, और आरएनएआई संसाधनों और उत्परिवर्ती पशुओं की सरणी के लिए जिम्मेदार ठहराया है. इसके अलावा सी. के विश्लेषण, एलिगेंस जीनोम कीड़े और उच्च रीढ़ के बीच एक महान समानता है, जो पता चलता है कि कीड़े में अनुसंधान पूरी चूहों या संवर्धित कोशिकाओं में प्रदर्शन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण सहायक हो सकता है पता चला. कीड़ा अनुसंधान के एक शक्तिशाली और महत्वपूर्ण हिस्सा ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करने के लिए जीन स्थानीयकरण और समारोह का अध्ययन करने की क्षमता है. ट्रांसजेनिक जानवर कीड़ा germline के microinjection के माध्यम से या biolistic बमबारी के प्रयोग के माध्यम से बनाया जा सकता है. बमबारी एक नई तकनीक है और कम प्रयोगशालाओं के एक नंबर के लिए परिचित है. यहाँ हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सोने के कणों के साथ जैव रेड पीडीएस 1000 प्रणाली का उपयोग biolistic बमबारी द्वारा ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न. द्विलिंग में डीएनए microinjection germline के साथ तुलना में, इस प्रोटोकॉल कीड़ा शरीर रचना की पहचान करने या microinjection प्रदर्शन करने का संबंध है के साथ ऑपरेटर से नहीं विशेष कौशल की आवश्यकता का लाभ है. इसके अलावा कई ट्रांसजेनिक लाइनों आमतौर पर एक एकल बमबारी से प्राप्त कर रहे हैं. इसके अलावा microinjection के विपरीत, biolistic बमबारी दोनों extrachromosomal सरणियों और एकीकृत transgenes के साथ ट्रांसजेनिक जानवर पैदा करता है. एकीकृत ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने की क्षमता mutagenic प्रोटोकॉल के उपयोग से बचने के लिए विदेशी डीएनए को एकीकृत कर सकते हैं. अंत में, biolistic बमबारी ट्रांसजेनिक जानवर की पीढ़ी के लिए एक आकर्षक तरीका विशेष रूप से समय और प्रयास microinjection में कुशल बनने के की जरूरत निवेश करने में दिलचस्पी नहीं जांचकर्ताओं के लिए किया जा सकता है.

Protocol

अवलोकन

परंपरागत ट्रांसजेनिक कीड़े सी. में transgene डीएनए microinjecting द्वारा उत्पन्न किया गया एलिगेंस germline 1,2,3,4. जबकि सफल, इस दृष्टिकोण विशेष उपकरण और कीड़ा शरीर रचना विज्ञान और microinjection तकनीक के साथ अनुभव के विकास की आवश्यकता है. हाल ही में biolistic बमबारी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है जो डीएनए लेपित सोने के कणों का उपयोग करता है germline 5,6 में विदेशी डीएनए परिचय के रूप में विकसित किया गया है. इस दृष्टिकोण अभ्यास के मामले में कम समय के निवेश की आवश्यकता है सफल बनने के लिए.

सी. के biolistic बमबारी एलिगेंस ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न व्यक्ति कीड़ा के स्तर पर कम क्षमता है तो सफलता पशुओं की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है. ये कई मायनों में उगाया जा सकता है, लेकिन हम अंडे प्लेटों का उपयोग करने के लिए काम और शामिल प्लेटों की संख्या कम है. हमारी प्रोटोकॉल अंडे प्लेटों और कीड़े की तैयारी के साथ शुरू होता है और फिर बमबारी जैव रेड PDS-1000/He Hepta प्रणाली का उपयोग प्रोटोकॉल पर केंद्रित है. हम Berezikov एट अल 7 के काम से भाग में हमारे प्रोटोकॉल रूपांतरित किया.

बमबारी के साथ, unc-119 जीन आमतौर पर ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. इल्ली इस उत्परिवर्तन ले उपभेदों गंभीर बेबुनियाद हैं और मुश्किल से बढ़ने, दिखने में गठीला हैं, और dauer 8 लार्वा फार्म करने में असमर्थ हैं. dauer जो प्रतिकूल परिस्थितियों के अंतर्गत एक प्रजनन वयस्क के लिए विकास में देरी के लिए प्रयोग किया जाता है एक वैकल्पिक लार्वा मंच है, और dauer में प्रवेश एकाधिक 9 जीन द्वारा नियंत्रित किया जाता है. Unc-119 जीन ले जाने के कई उपभेदों सी. से उपलब्ध हैं एलिगेंस जेनेटिक्स केंद्र (CGC, Minneapolis, MN). मूल DP38 तनाव (unc 119 (ed3)) भी एक असंबंधित dauer गठन (daf ग) विधान उत्परिवर्तन जो बहाव प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है वहन करती है. कई प्रयोगशालाओं इस उत्परिवर्तन outcrossed है, और तनाव HT1593 CGC से उपलब्ध है. हम पाते हैं कि ट्रांसजेनिक जानवर कुछ DP38 तनाव के साथ की पहचान आसान और ट्रांसजेनिक जानवर बनाने के लिए इस तनाव का उपयोग करते हैं. जब आवश्यक हो, तो हम HT1593 का उपयोग करने के लिए ट्रांसजेनिक कीड़े outcross daf-ग उत्परिवर्तन निकालना. DP38 कीड़े को विकसित करने के लिए हो रही है एक प्रोटोकॉल में धीमी कदम के है तो हम बढ़ती प्लेटों के एक शेयर को बनाए रखने जबकि transgenes तैयारी.

Unc-119 के साथ ब्याज की जीन मार्कर अभिव्यक्ति सामान्य गतिशीलता और शरीर के आकार 5 के बचाव पर आधारित transgene व्यक्त पशुओं की आसान पहचान की अनुमति देता है. unc 119 जीन छोटे सी. के लिए कई स्रोतों और वैक्टर unc-119 जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर, unc 119 प्रमोटर और सीडीएनए, और जीनोमिक डीएनए से प्राप्त किया जा सकता है briggsiae जीन 8,10 उपयोग किया जाता है. हमने हाल ही में एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन मुताबिक़ 11 पुनर्संयोजन और एक कीड़ा fosmids को संशोधित करने के लिए Cre - lox पुनर्संयोजन द्वारा unc-119 जीन ले ट्रांसजेनिक जानवर 12 उत्पन्न विधि द्वारा किसी भी एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन युक्त प्लाज्मिड एक unc-119 कैसेट जोड़ने के लिए. plasmids Addgene इंक (कैम्ब्रिज, एमए) से उपलब्ध हैं.

जबकि एक एकल बमबारी प्रदर्शन में शामिल प्रयास महत्वपूर्ण है लेकिन प्रबंधनीय है, अतिरिक्त एक ही दिन पर कई bombardments प्रदर्शन में शामिल काम कम है. नतीजतन, हम नियमित रूप से ट्रांसजेनिक कीड़े के उत्पादन के लिए प्रत्येक पैदा करने में शामिल काम कम क्लस्टर.

1. अंडे प्लेट तैयारी

unc 119 उत्परिवर्ती कीड़े क्योंकि उनके बिगड़ा गतिशीलता वे एक थाली के कुछ हिस्सों पर भूखा जबकि प्लेट के अन्य भागों में अभी भी भोजन शामिल हैं के साथ मानक एन जी एम प्लेटों पर बढ़ने के लिए मुश्किल हैं. अंडे प्लेटों इस समस्या को हल के रूप में अंडे प्लेटों पर मोटी भोजन परत unc-119 कीड़े और अधिक आसानी से क्रॉल करने और सभी 7 थाली पर लेने की अनुमति देता है. अंडे प्लेटें भी कीड़े की एक बड़ी संख्या के विकास का समर्थन बहुत कम प्लेटें 13 की जरूरत हैं के लाभ है . आमतौर पर 5 अंडे प्लेटों एक बमबारी के लिए कीड़े बढ़ने के लिए पर्याप्त हैं. नीचे नुस्खा लगभग 50 प्लेटें बनाता है, लेकिन कम अगर वांछित आधा किया जा सकता है.

अंडे प्लेटों को आसानी से दूषित हो तो हम प्लेटों में दोनों एंटीबायोटिक और रोधी दवाओं का उपयोग करें और केवल प्लेटें बोने के लिए हाइपोक्लोराइट उपचार द्वारा उत्पन्न अंडे का उपयोग कर सकते हैं.

दिन 1:

  1. एक 500ml बोतल में पौंड (400 एमएल) तैयार करें. 20min के लिए आटोक्लेव.
  2. ~ 50 10 सेमी NGA प्लेटें 2% अगर साथ 1 लीटर NGA का उपयोग कर डालो. हम 200 μg / 13 एमएल प्रति लीटर और स्ट्रेप्टोमाइसिन Nystatin 10 एमएल जोड़ें.
  3. लेग में एक 40 एमएल OP50-1 के रातोंरात संस्कृति स्ट्रेप्टोमाइसिन 200 / μg एमएल के साथ आगे बढ़ें. यह तनाव स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी और CGC से उपलब्ध है.
  4. के लिए एक 500ml बोतल आटोक्लेवअगले दिन.

दिन 2:

  1. बाँझ बोतल में 10 चिकन अंडे की अलग yolks. हम एक जर्दी विभाजक (टारगेट सहित घरेलू दुकानों, पर उपलब्ध है) का उपयोग करें. हिलाएँ.
  2. लेग साथ 400ml मात्रा लाओ. हिलाना
  3. 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  4. कमरे के तापमान को शांत.
  5. OP50-1 के 40ml जोड़ें. हिलाना
  6. प्लेट प्रति मिश्रण का 5-8 एमएल बांटो.
  7. प्लेटें कमरे के तापमान पर बसने के लिए रातोंरात की अनुमति दें.

3 दिन:

  1. धीरे बंद प्लेटों से शेष तरल डालना. पर lids के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे की अनुमति दें.

4 दिन:

  1. एक बॉक्स या प्लास्टिक बैग और दुकान में प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस जब तक जरूरत रखो. इन प्लेटों के 1-2 महीनों के लिए उपयोग करने के लिए ठीक हो दिखाई देते हैं.

2. अंडे प्लेट्स सीडिंग

  1. हाल ही में भूखे प्लेटें OP50 केंद्रित जोड़ने के द्वारा 6 सेमी NGA प्लेटों पर DP38 कीड़े का विस्तार करें. एक एकल बमबारी के लिए, हम बीज 5 अंडे प्लेटों ~ 6 छोटी प्लेट का उपयोग करें. एकाधिक bombardments के लिए, हम अंडे प्लेटों बोने से पहले बजाय बीज 2 समृद्ध peptone प्लेटें छोटी प्लेट का उपयोग करें.
  2. 13,14 hypochlorite के उपयोग के माध्यम से DP38 कीड़े से अंडे पृथक. बाँझ एस - बेसल या M9 13,14 बफ़र्स में अंडे Resuspend.
  3. अंडे प्लेटों की उपयुक्त संख्या में अंडे (> प्लेट प्रति 10,000) जोड़ें. 20 ° C पर 7-10 दिन बमबारी के लिए उपयोग करने के लिए अंडे प्लेटों पर कीड़े हो जाओ. प्लेटों का उपयोग करने के लिए एक बार कीड़े प्लेटों से भोजन को स्पष्ट करने के लिए शुरू कर दिया है के लिए तैयार हो जाएगा. ये प्लेटें वास्तव में मुश्किल को भूखा कर रहे हैं और अब durations के लिए बढ़ रहा है कीड़ा उपज में सुधार होगा.

गोलाबाज़ी

हम सोने के शेयर समय से आगे तैयार हैं और यह 4 डिग्री सेल्सियस उपयोग के लिए संग्रहीत रखना. इसके अलावा जरूरत बेदाग़ हैं और 10 सेमी NGA प्लेटें देखा. बेदाग़ प्लेटों को अच्छी तरह से अग्रिम में डाल दिया हो सकता है और अच्छी तरह से कीड़े के साथ जोड़ा तरल के अवशोषण को सुविधाजनक बनाने के शुष्क करने की अनुमति की जरूरत है.

बमबारी के दिन पर, हम दूर धोने कीड़े पहले तो डीएनए लेपित सोने के कणों की तैयारी शुरू. हम तो बेदाग़ NGA प्लेटों के लिए कीड़े को जोड़ने के लिए और सोने के कणों धोने और उन्हें macrocarriers करने के लिए स्थानांतरित खत्म.

गोल्ड कण तैयारी:

  1. एक 1.7mL ट्यूब में सोने के कणों के 60mg वजन और 15min के लिए 70% इथेनॉल में लेना. संक्षेप में स्पिन करने के लिए सोने के कणों वेग.
  2. बाँझ पानी में 3 बार धो और सोना इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में हर बार स्पिन.
  3. 1ml 50% बाँझ ग्लिसरॉल में सोने Resuspend. यह शेयर सोने कण समाधान है और महीनों के लिए 4 पर भंडारित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस

कीड़े:

  1. एस बेसल M9 या बफर के साथ अंडे प्लेटों बंद DP38 कीड़े फ्लोट और उन्हें एक 50ml शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण.
  2. बेंच पर ट्यूबों रखें जब तक कीड़े नीचे में हैं. फिर बफर aspirate और ताजा एस बेसल या M9 जोड़ें. धो 2 या 3 बार, जब तक बफर मलबे के अपेक्षाकृत स्पष्ट है. इस कदम पर कीड़े रखें जब तक डीएनए कोटिंग पूरा हो गया है.
  3. Aspirate और बमबारी प्रति बफर में कीड़े के लगभग 2-3 एमएल छोड़. बर्फ पर एक 10 सेमी बेदाग़ NGA थाली पर स्थानांतरण. यह महत्वपूर्ण है हस्तांतरित की मात्रा को कम NGA थाली के रूप में बमबारी से पहले पूरी तरह से सूखे की आवश्यकता होगी. कीड़े के साथ प्लेट की पूरी सतह को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. प्लेट बर्फ पर शुष्क करने की अनुमति दें. बर्फ clumping जबकि सुखाने से कीड़े को रोकने जाएगा.

यह कदम महत्वपूर्ण है: थाली सूखी हो और कीड़े NGA प्लेट पर समान रूप से छितरी हुई है चाहिए. बर्फ पर कीड़े ध्यान में रखते हुए उन्हें थाली पर चलती है और बवासीर में कुल से रोकता है.

तैयारी डीएनए (एक बमबारी के लिए):

  1. एक 1.7mL ट्यूब में मिक्स:
    • 50μl सोने के कणों. जोड़ने से पहले अच्छी तरह से Resuspend.
    • 50μl डीएनए (10 15ug). हम परिपत्र या रैखिक डीएनए के बीच थोड़ा अंतर देखते हैं. आम तौर पर हम डीएनए शुद्धि के लिए Qiagen midiprep कारतूस का उपयोग करें (Qiagen इंक, वालेंसिया, सीए).
    • 50μl 2.5m CaCl 2. यह समाधान कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर है.
    • 20μl 0.1M spermidine.

      spermidine जलीय घोल में अस्थिर है. हम 70μl spermidine -20 डिग्री सेल्सियस पर और aliquots दुकान हम तो सही उपयोग करने से पहले पानी की 1ml जोड़ने के लिए एक 0.1M समाधान प्राप्त. यह समाधान प्रत्येक बमबारी के लिए ताजा तैयार होना चाहिए.

      हम आम तौर पर एक कम गति पर भंवर एक 1.7mL ट्यूब में सोने के कणों और फिर 2 CaCl, डीएनए और spermidine / protamine dropwise जोड़ने जबकि vortexing. है कि लोगों को कैल्शियम फॉस्फेट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है के लिए इस तकनीक का परिचित है.

      हम spermidine के बजाय भी बहुत अच्छा 15 परिणामों के साथ protamine इस्तेमाल किया. हम पानी में एक ताजा समाधान (1mg/mL) तैयार हमेंई के बजाय spermidine के 20μl 50μl. अगर हम protamine का उपयोग करें, हम आमतौर पर कमरे के तापमान पर बर्फ पर रखने की बजाय 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं. Protamine जमी रखा जाना नहीं की जरूरत है और एक तरल के बजाय एक पाउडर है.
  2. 30min के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं, और समय - समय पर निलंबन में सोने के कणों रखने के लिए मिश्रण. तो संक्षेप में स्पिन और aspirate सतह पर तैरनेवाला.
  3. 70 300μl% इथेनॉल के साथ धोएं. संक्षेप में स्पिन.
  4. 1ml 100% इथेनॉल के साथ धोएं. संक्षेप में स्पिन.
  5. 170μl 100% इथेनॉल में Resuspend.

Macrocarriers की तैयारी:

  1. 7 macrocarriers (जैव रेड प्रयोगशालाओं, हरक्यूलिस, सीए) 2-propanol में कुल्ला. उन्हें टिशू पेपर पर रखो और उन्हें कमरे के तापमान पर शुष्क.
  2. डीएनए / सोने के मिश्रण के प्रत्येक macrocarrier के केंद्र में 20μl जोड़ें. निलंबन में सोने रखने pipetting से पहले भंवर सही करने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. इथेनॉल लुप्त हो जाना.

3. गोलाबाज़ी

के लिए एक रिक्त बमबारी करने से पहले प्रयोग प्रणाली के माध्यम से हीलियम फ्लश करने के लिए सुनिश्चित करें.

  1. वैक्यूम पंप और करीब वैक्यूम पंप जाल पर मुड़ें. हम एक तेल मुक्त वैक्यूम पंप का उपयोग करें.
  2. हीलियम टैंक पर मुड़ें. जाँच करें कि दबाव ≥ 2200psi है.
  3. 2-propanol में गीले टूटना (1350 साई) डिस्क, hepta एडाप्टर के लिए टोपी को बनाए रखने में रखकर.
  4. पीडीएस सिस्टम 1000 में adapter भाड़ और आपूर्ति टोक़ रिंच के साथ कस है.
  5. धारक और उन्हें प्रदान किए गए उपकरण के साथ सीट में 7 macrocarriers रखें. तो धारक को एक hepta रोक स्क्रीन और नीचे डाल दिया. ऊपर से दूसरे शेल्फ पर अधिक धारक और जगह फ्लिप. macrocarriers के सोने देखा पक्ष इस बिंदु पर नीचे का सामना करना पड़ होना चाहिए.
  6. Hepta एडाप्टर के आउटलेट के साथ macrocarrier धारक के शीर्ष में छेद संरेखित करें.
  7. NGA बमबारी चैम्बर में सबसे कम शेल्फ पर कीड़े (ढक्कन बंद) के साथ लेपित प्लेट रखें.
  8. पूरी तरह से पीडीएस-1000 वैक्यूम प्रवाह दर घुंडी खोलें. Vac बटन दबाएँ जब तक चैम्बर पारा में 26 तक पहुँचता है. तो वैक्यूम बनाए रखने की स्थिति पकड़ के लिए स्विच.
  9. डिस्क ruptures जब तक आग बटन प्रेस और पकड़. यह होगा जब दबाव 1350psi तक पहुँचता है. कभी कभी यह 5-20 सेकंड लेता है के लिए होते हैं. बटन छोड़ें.
  10. चैम्बर (वेंट स्थिति) से वैक्यूम रिलीज, और थाली हटा.
  11. निर्वात और हीलियम बंद करें.
  12. कई बार आग जब तक लाइन हीलियम (हीलियम गेज 0 साई निशान चाहिए) शामिल नहीं करता है.
  13. पीडीएस-1000 प्रणाली बंद करें.

बमबारी के बाद इल्ली वसूली:

  1. 20 पर बमबारी की थाली छोड़ दो डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए.
  2. 10 एमएल एस - बेसल M9 या बफर के साथ थाली से कीड़े फ्लोट.
  3. 10 सेमी देखा NGA प्लेटें - 20 पर 0.5ml कीड़े रखो.
  4. ° सी के बारे में 2 सप्ताह के लिए या कमरे के तापमान (22-24 डिग्री सेल्सियस) बचाया कीड़े के लिए जाँच करने से पहले 20 पर छोड़ दें.
  5. Phenotype unc-119 (+) के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ कीड़े के लिए स्क्रीन . स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम समय बाद प्लेटों के बाद से बचाया कीड़े गैर बचाया कीड़े से अधिक अस्तित्व फायदा है भूखे है.
  6. प्रत्येक 10 सेमी की थाली है कि बचाया कीड़े निहित से एक व्यक्ति लाइन उत्पन्न.

4. प्रतिनिधि परिणाम

विशेष transgene ट्रांसजेनिक जानवर प्राप्त करने के लिए संबंध के साथ प्रोटोकॉल की सफलता पर निर्भर करता है. प्रमोटर के लिए: GFP संवाददाता transgenes हम 20 लाइनों के लिए प्राप्त की है. एक अधिक विशिष्ट परिणाम 3-10 लाइनों है. ट्रांसजेनिक लाइनों के 30% करने के लिए एकीकृत लाइनें हैं, लेकिन यह यादृच्छिक है और हम एक ही दिन पर में कई bombardments प्रदर्शन अगर एक एकीकृत लाइन विशेष रूप से वांछित है.

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Discussion

Biolistic बमबारी सी. सहित कई जीवों में विदेशी डीएनए परिचय के लिए एक सरल तरीका है, 1,5,6,7,16 एलिगेंस. यह सोने 2 CaCl की उपस्थिति में डीएनए के साथ एक जटिल बनाने के कणों पर निर्भर करता है . Spermidine जैसे cationic polyamines, vivo में nuclease गिरावट से डीएनए की रक्षा करना. चूंकि spermidine एक अस्थिर अणु है, यह महत्वपूर्ण है -20 ° सी में, यह छोटे aliquots में दुकान और बमबारी प्रदर्शन से पहले सही समाधान. जैसा कि हम बमबारी प्रोटोकॉल में वर्णित है, protamine spermidine के बजाय प्रयोग किया जा सकता है विदेशी डीएनए देने 15. Protamine कमरे के तापमान पर अधिक स्थिर किया जा रहा है और एक चिपचिपा तरल के बजाय एक पाउडर होने का लाभ है.

unc 119 बचाव जीन सीआईएस में भी कर सकते हैं transgene के रूप में एक ही प्लाज्मिड या एक अलग प्लाज्मिड कि transgene के साथ मिलाया जाता है सोने के कणों कोटिंग करने से पहले पर रखा . जबकि एक या एक से अधिक plasmids के मिश्रण आमतौर पर सफल है, और हम दूसरों ने पाया है कि कई plasmids के साथ कीड़े की बमबारी ट्रांसजेनिक कुछ ले जाने जानवरों बना सकते हैं, लेकिन 6,11 नहीं सभी plasmids. प्लाज्मिड transgene पर unc-119 जीन रखने को सुविधाजनक बनाने के के लिए, हम हाल ही में एक प्रोटोकॉल मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग करने के लिए लगभग सभी 11 plasmids के एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन में unc-119 जीन डालने वर्णित.

इसके अलावा, कीड़ा उपभेदों में DP38 तनाव उत्परिवर्तन unc 119 की कमी से चलती transgenes को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम भी unc-119 के साथ एक प्लाज्मिड mCherry 11 के लिए इनकार उत्पन्न. अखिल neuronal mCherry प्रतिदीप्ति तो आनुवंशिक 11 पृष्ठभूमि की एक किस्म में transgene की उपस्थिति पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

कुछ transgenes कमजोर अभिव्यक्ति या एक मंच विशिष्ट अभिव्यक्ति की वजह से बमबारी के बाद पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है. transgene की उपस्थिति ट्रांसजेनिक कीड़े का उपयोग पीसीआर के उपयोग के माध्यम से अक्सर सत्यापित कर सकते हैं. कमजोर अभिव्यक्ति के साथ transgenes के लिए, अतिरिक्त bombardments प्रदर्शन मजबूत अभिव्यक्ति के साथ लाइनों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक परिसर या confocal खुर्दबीन का उपयोग अक्सर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति visualizing के साथ मदद कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम पिट्सबर्ग और NIH अनुदान AG028977 के ALF विश्वविद्यालय से बीज फंडों द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold particles Inbio gold BD021 1micron
Midiprep kit Qiagen 12143
Spermidine Sigma-Aldrich S4139
Protamine Sigma-Aldrich P4505
Macrocarriers Bio-Rad 165-2335
PDS-1000/He Hepta System Bio-Rad 165-2257
Rupture disk Bio-Rad 165-2330
Nystatin Sigma-Aldrich N1638
Streptomycin MP Biomedicals 100556

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References

  1. Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
  2. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  3. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  6. Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
  7. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
  8. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  9. Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
  10. Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
  11. Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
  12. Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
  13. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
  14. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. The nematode, Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  15. Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
  16. Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).

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सूक्ष्म जीव विज्ञान 42 अंक सी एलिगेंस ट्रांसजेनिक जानवर पुनः संयोजक डीएनए UNC-119 microparticle बमबारी transgene

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.

The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect. The volume has been corrected from:

The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 70μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.

to:

The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 16μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.

ट्रांसजेनिक का सृजन<em> सी. एलिगेंस</em> Biolistic परिवर्तन द्वारा
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Hochbaum, D., Ferguson, A. A.,… More

Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation. J. Vis. Exp. (42), e2090, doi:10.3791/2090 (2010).

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