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Biology

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

doi: 10.3791/2090 Published: August 23, 2010

ERRATUM NOTICE

Summary

Worms transgênicos são comumente usados ​​em

Abstract

O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados ​​em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.

Protocol

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Visão global

Worms tradicionalmente transgênicos foram gerados por microinjecting DNA transgene no C. elegans germline 1,2,3,4. Embora bem-sucedida, esta abordagem necessários equipamentos especializados eo desenvolvimento de experiência com a anatomia verme e da técnica de microinjeção. Mais recentemente bombardeio biobalística foi desenvolvido como uma abordagem alternativa que usa partículas de DNA revestido de ouro para introduzir DNA estranho no 5,6 germinativas. Essa abordagem requer menos investimento de tempo em termos de prática para se tornar bem sucedido.

O bombardeio de biobalística C. elegans para gerar worms transgênico tem baixa eficiência ao nível do worm individuais para o sucesso requer uma grande quantidade de animais. Estes podem ser cultivadas em várias maneiras, mas nós usamos placas de ovos para reduzir o trabalho eo número de placas envolvidas. Nosso protocolo começa com a preparação de placas de ovos e vermes e, em seguida, centra-se no protocolo de bombardeamento utilizando o Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Nós adaptamos nosso protocolo, em parte, obra de Berezikov et al 7.

Com o bombardeio, o gene unc-119 é normalmente usado como um marcador para animais transgênicos. Worm cepas carregando essa mutação são severamente descoordenado e pouco movimento, são dumpy na aparência, e são incapazes de formar Dauer larvas 8. A Dauer é uma fase larval alternativo que é usado para retardar o desenvolvimento de um adulto reprodutivo em condições adversas, ea entrada em Dauer é regulada por múltiplos genes 9. Várias linhagens com o gene unc-119 estão disponíveis no C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). A cepa DP38 original (unc-119 (ED3)) também traz uma formação constitutiva Dauer-independentes (daf-c) mutação que poderia afetar experimentos a jusante. Vários laboratórios têm outcrossed esta mutação, ea tensão HT1593 está disponível a partir da CGC. Descobrimos que os animais transgênicos são um pouco mais fácil de identificar com a cepa DP38 e tendem a utilizar esta cepa para a criação de animais transgênicos. Quando necessário, usamos HT1593 para outcross os vermes transgênicos para remover a mutação daf-c. Obtendo o DP38 worms para crescer é um dos passos mais lentos no protocolo para que manter um estoque de placas de crescimento durante a preparação do transgenes.

Expressão do marcador unc-119 junto com o gene de interesse permite a fácil identificação dos animais expressando o transgene com base no resgate da motilidade normal e tamanho do corpo 5. O gene unc-119 pode ser obtido de diversas fontes, e vetores utilizando o DNA genômico unc-119, unc-119 promotor e cDNA e DNA genômico para o menor C. briggsiae gene são utilizados 8,10. Recentemente, descreveu um protocolo simples para adicionar um cassete unc-119 a qualquer plasmídeo contendo um gene de resistência a ampicilina por recombinação homóloga 11 e um método para modificar fosmids worm para transportar o gene unc-119 por Cre-lox recombinação para gerar animais transgênicos 12. Os plasmídeos estão disponíveis a partir Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Enquanto o esforço envolvido na realização de um bombardeio único é significativo, mas controlável, o trabalho adicional envolvido na realização de bombardeios múltiplas em um único dia é mínima. Consequentemente, nós rotineiramente agrupar a produção de transgênicos worms para diminuir o trabalho envolvido na geração de cada um.

1. Ovo Preparação Placa

Os vermes unc-119 mutantes são difíceis de crescer em placas NGM padrão, pois com sua mobilidade prejudicada eles tendem a morrer de fome em partes de um prato, enquanto outras partes da placa ainda contêm alimentos. Placas de ovos resolver este problema como a camada espessa de alimentos em pratos de ovos permite unc-119 vermes a rastejar mais facilmente e para assumir todas as placas do 7. As placas de ovos também têm a vantagem de suportar o crescimento de um grande número de worms para placas que são necessários menos 13. Geralmente 5 placas de ovo são suficientes para crescer worms para um bombardeio. A receita abaixo faz cerca de 50 pratos, mas pode ser reduzido pela metade para fazer menos, se desejar.

As placas de ovos pode tornar-se facilmente contaminada por isso usamos os antibióticos e antifúngicos nas placas e só usar ovos gerados pelo tratamento de hipoclorito para semear as placas.

Dia 1:

  1. Prepare LB (400 mL) em um frasco de 500ml. Autoclave por 20min.
  2. Despeje ~ 50 centímetros 10 placas NGA usando um litro NGA com agar 2%. Nós adicionamos 10 mL nistatina por litro e estreptomicina a 200 mcg / mL 13.
  3. Crescer uma cultura de 40 ml durante a noite de OP50-1 em LB com 200 estreptomicina mcg / mL. Esta estirpe é resistente à estreptomicina e disponível a partir de CGC.
  4. Autoclave uma garrafa de 500mL dedia seguinte.

Dia 2:

  1. Separe as gemas de 10 ovos de galinha para o frasco estéril. Usamos um separador de gema (disponível em lojas da família, incluindo Target). Shake.
  2. Traga volume para 400mL com LB. Agitar
  3. Incubar a 60 ° C por 1 hora.
  4. Arrefecer à temperatura ambiente.
  5. Adicionar 40mL de OP50-1. Agitar
  6. Distribuir 5-8 mL de mistura por placa.
  7. Permitir que as placas para resolver em temperatura ambiente durante a noite.

Dia 3:

  1. Gentilmente despeje o líquido restante das placas. Deixe secar com tampas em temperatura ambiente durante a noite.

Dia 4:

  1. Colocar placas em uma caixa ou saco plástico e armazenar a 4 ° C até ser necessário. Essas placas parecem ser OK para usar por 1-2 meses.

2. Semeadura Placas Egg

  1. Expandir o DP38 worms em 6 centímetros placas NGA adicionando OP50 concentrado para placas recentemente fome. Para um único bombardeio, usamos ~ 6 pratos pequenos para placas de semente cinco ovos. Para vários bombardeios, usamos as placas menores ao invés de sementes enriquecidas 2 placas de peptona antes da semeadura as placas de ovo.
  2. Isolar os ovos do DP38 worms através do uso de hipoclorito de 13,14. Ressuspender os ovos estéreis em buffers S-basal ou M9 13,14.
  3. Adicione os ovos (> 10 mil por placa) para o número apropriado de placas de ovo. Crescem os vermes em pratos de ovos a 20 ° C por 7-10 dias para uso de bombardeio. As placas estarão prontos para usar uma vez que os vermes começaram a limpar a comida do prato. Essas placas são realmente difíceis de morrer de fome e crescente por períodos mais longos irá melhorar o rendimento worm.

Bombardeamento

Nós preparamos o estoque de ouro antes do tempo e mantê-lo conservado a 4 ° C para o uso. Também são necessários imaculado e viu 10 placas NGA centímetros. As placas sem mancha precisa ser derramado com bastante antecedência e permitiu a secar completamente para facilitar a absorção do líquido adicionado com os vermes.

No dia do bombardeio, que lave os vermes primeiro e depois começar a preparar o DNA revestido por partículas de ouro. Em seguida, adicione os vermes para as placas NGA imaculada e terminar de lavar as partículas de ouro e transferi-las para o macrocarriers.

Preparação de partículas de ouro:

  1. Pesar 60 mg de partículas de ouro em um tubo de 1.7mL e mergulhar em etanol 70% por 15min. Girar rapidamente a se precipitar as partículas de ouro.
  2. Lavar 3 vezes em água estéril e girar rapidamente a cada vez para coletar o ouro.
  3. Ressuspender o ouro em 1mL de glicerol 50% estéril. Esta é a solução de reserva de partículas de ouro e pode ser armazenado durante meses a 4 ° C.

Worms:

  1. Flutuar o DP38 worms fora do prato de ovos com tampão de S-basal ou M9 e transferi-los para um tubo de 50 ml cônico.
  2. Manter os tubos no banco até que os vermes estão na parte inferior. Em seguida, aspire o buffer e adicionar novos S-basal ou M9. Lave 2 ou 3 vezes, até encher o buffer é relativamente livre de detritos. Manter os worms nesta etapa até que o revestimento DNA está concluída.
  3. Aspirar e deixar cerca de 2-3 mL de vermes em tampão por bombardeio. Transfira para uma placa de 10 centímetros NGA imaculada no gelo. É importante minimizar o volume transferido como a placa NGA será necessário secar completamente antes de bombardeio. Certifique-se de cobrir toda a superfície da placa com os vermes.
  4. Permitir que a placa para secar no gelo. O gelo irá evitar os vermes se aglomerem durante a secagem.

Este passo é importante: a placa deve estar seca e as minhocas uniformemente dispersas na placa NGA. Mantendo o worms no gelo impede de mover-se sobre a placa e agregando em pilhas.

DNA de preparação (por um bombardeio):

  1. Misture em um tubo de 1.7mL:
    • 50μl partículas de ouro. Ressuspender completamente antes de adicionar.
    • 50μl de DNA (10-15ug). Vemos pouca diferença entre DNA circular ou linear. Normalmente usamos cartuchos Qiagen midiprep para a purificação de DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA).
    • 50μl 2.5M CaCl 2. Esta solução é estável por várias semanas em temperatura ambiente.
    • 20μl espermidina 0,1 M.

      A espermidina é instável em solução aquosa. Fazemos alíquotas espermidina 70μl e armazenar a -20 ° C. Em seguida, adicionar 1 ml de água bem antes de usar para obter uma solução 0,1 M. Esta solução deve ser renovada a cada bombardeio.

      Nós geralmente vortex as partículas de ouro em um tubo 1.7mL a uma velocidade baixa e adicione o CaCl 2, DNA e espermidina / gotas de protamina, enquanto vórtex. Para as pessoas que têm transfectadas com fosfato de cálcio esta técnica é familiar.

      Temos também utilizado protamina em vez de espermidina com muito bons resultados 15. Nós preparamos uma nova solução (1mg/ml) em água e nose 50μl em vez do 20μl de espermidina. Se usarmos de protamina, que geralmente incubar a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos em vez de colocar no gelo. Protamina não precisam ser mantidos congelados e é um pó em vez de um líquido.
  2. Incubar a mistura em gelo por 30min, e periodicamente mix para manter as partículas de ouro em suspensão. Em seguida, girar rapidamente e aspirar o sobrenadante.
  3. Lavar com etanol 300 ul de 70%. Girar por alguns instantes.
  4. Lavar com etanol a 100% 1mL. Girar por alguns instantes.
  5. Ressuspender em 170μl de etanol 100%.

Preparação de macrocarriers:

  1. Enxágüe 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), em 2-propanol. Coloque-os sobre papel absorvente e deixe-os secar em temperatura ambiente.
  2. Adicionar 20μl de DNA / ouro mistura no centro de cada macrocarrier. Certifique-se de direito vortex antes de pipetar para manter o ouro em suspensão.
  3. Deixe o álcool evaporar.

3. Bombardeamento

Certifique-se de realizar um bombardeio em branco antes do experimento para lavar hélio através do sistema.

  1. Ligue a bomba de vácuo e trap bomba perto de vácuo. Nós usamos uma bomba de vácuo oil-free.
  2. Ligue tanque de hélio. Verifique que a pressão é ≥ 2200psi.
  3. Disco de ruptura Wet (1350 psi) em 2-propanol, colocando na retenção de tampa para hepta adaptador.
  4. Parafuso adaptador no PDS-1000 do sistema e aperte com a chave de torque fornecido.
  5. Coloque o 7 macrocarriers no suporte e encaixá-los com a ferramenta fornecida. Em seguida, coloque uma tela de parar hepta e no fundo para o titular. Virar o suporte e coloque na segunda prateleira de cima. O ouro manchado lado do macrocarriers deve estar voltado para baixo neste momento.
  6. Alinhe os orifícios no topo do titular macrocarrier com as saídas do adaptador hepta.
  7. Coloque a placa NGA revestido com worms (off tampa) na prateleira mais baixa na câmara de bombardeio.
  8. Abra completamente a vácuo botão vazão no PDS-1000. Pressione o botão até vac câmara atinge 26 Em Hg. Em seguida, mudar para manter a posição de manter o vácuo.
  9. Pressione e segure o botão de tiro até rupturas disco. Isso acontecerá quando a pressão chega a 1350psi. Às vezes, isso leva 50-20 segundos para ocorrer. Solte o botão.
  10. Lançamento da câmara de vácuo (posição de ventilação), e remover placa.
  11. Por sua vez vácuo e off hélio.
  12. Fogo várias vezes até que a linha não contém hélio (medidor de hélio deve marcar 0 psi).
  13. Desligue o sistema PDS-1000.

Worm recuperação depois do bombardeamento:

  1. Deixe a placa bombardeado a 20 ° C por 20 minutos.
  2. Float os vermes da placa com 10 mL de tampão S-basal ou M9.
  3. Coloque worms 0,5 ml em 20 - 10 cm placas NGA manchado.
  4. Deixe a 20 ° C de temperatura ou quarto (22-24 ° C) por cerca de duas semanas antes de verificar para worms resgatados.
  5. Tela para worms com o fenótipo unc-119 (+) com um microscópio de dissecação. O tempo ideal para a triagem é após as placas de ter passado fome desde o worms resgatados ter vantagem de sobrevivência sobre os não-resgatada worms.
  6. Gerar uma linha individual de cada placa de 10 cm que continha worms resgatados.

4. Resultados representante

O sucesso do protocolo no que diz respeito à obtenção de animais transgênicos depende do transgene particular. Para promotor: transgenes repórter GFP obtivemos até 20 linhas. Um resultado mais comum é 30-10 linhas. Até 30% das linhagens transgênicas são linhas integradas, mas esta é aleatória e vamos realizar bombardeios múltiplas em um único dia, se uma linha integrada é particularmente desejado.

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Discussion

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Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans 1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl 2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Como descrevemos no protocolo de bombardeio, a protamina pode ser usado em vez de espermidina para entregar DNA estranho 15. Protamina tem a vantagem de ser mais estável à temperatura ambiente e ser um pó em vez de um líquido viscoso.

O gene unc-119 resgate pode ser colocado em cis sobre o plasmídeo mesmo que o transgene ou em um plasmídeo separado que é misturado com o transgene antes do revestimento das partículas de ouro. Enquanto a mistura de um ou mais plasmídeos é geralmente bem sucedido, nós e outros descobriram que bombardeio de worms com plasmídeos múltiplos pode criar animais transgênicos carregando alguns, mas nem todos os plasmídeos 6,11. Para facilitar a colocação do gene unc-119 sobre o transgene plasmídeo, que descreveu recentemente um protocolo com a recombinação homóloga para inserir o gene unc-119 no gene de resistência a ampicilina de quase todos os 11 plasmídeos.

Além disso, para facilitar a passagem de transgenes a tensão DP38 em cepas de vírus falta a mutação unc-119, que também gerou um plasmídeo com unc-119 fundido a mCherry 11. O pan-neuronal de fluorescência mCherry pode então ser usado para rastrear a presença do transgene em uma variedade de origens genéticas 11.

Alguns transgenes pode ser difícil de detectar depois do bombardeamento, devido à fraca expressão ou uma expressão estágio específica. A presença do transgene pode ser verificado, muitas vezes através do uso de PCR usando os vermes transgênicos. Para transgenes com fraca expressão, realizando bombardeios adicionais podem levar à identificação de linhas com mais forte expressão. Alternadamente, o uso de um composto ou um microscópio confocal muitas vezes podem ajudar com a visualização a expressão de proteínas fluorescentes.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh e conceder NIH AG028977 para ALF

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold particles Inbio gold BD021 1micron
Midiprep kit Qiagen 12143
Spermidine Sigma-Aldrich S4139
Protamine Sigma-Aldrich P4505
Macrocarriers Bio-Rad 165-2335
PDS-1000/He Hepta System Bio-Rad 165-2257
Rupture disk Bio-Rad 165-2330
Nystatin Sigma-Aldrich N1638
Streptomycin MP Biomedicals 100556

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  16. Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.

The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect. The volume has been corrected from:

The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 70μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.

to:

The spermidine is unstable in aqueous solution. We make 16μl spermidine aliquots and store at -20°C. We then add 1mL of water right before use to obtain a 0.1M solution. This solution must be prepared fresh for each bombardment.

Geração de transgênicos<em> C. elegans</em> Por biobalística Transformação
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Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation. J. Vis. Exp. (42), e2090, doi:10.3791/2090 (2010).More

Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation. J. Vis. Exp. (42), e2090, doi:10.3791/2090 (2010).

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