Summary
弓形虫囊肿的形式，在应对环境压力，可在组织培养模式模仿的转换。本视频演示了技术审查囊肿壁的形成，激活骨髓来源的巨噬细胞或改变成纤维细胞生长介质的pH值。
Abstract
弓形虫是一种专性细胞内寄生虫能侵入任何温血动物有核细胞。在感染，T。弓形虫传播作为一种快速复制的形式被称为速殖子。速殖子转换成一个缓慢增长的囊称为一个信号的过程，是没有很好的特点bradyzoite的形式。 bradyzoite囊肿内的动物，被发现在中枢神经系统和肌肉组织和代表的慢性感染阶段。可以进行模拟转换到bradyzoites在组织培养中的CO 2饥饿，使用高pH值，或增加干扰素γ（IFNγ）的媒介。 Bradyzoites的特点是存在一个囊肿壁，其中的凝集素的Dolichos biflorus凝集素（DBA）结合。荧光标记的DBA是用于可视化的囊壁在人包皮成纤维细胞（HFFS）已暴露在低CO 2和高pH值介质中生长的寄生虫。同样，寄生虫居住在小鼠骨骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）显示囊肿壁由DBA的检测γ干扰素和脂多糖（LPS）激活后的楼宇管理维修综合计划“。此协议将演示如何诱导T 的转换弓形虫到低的CO 2和楼宇管理维修综合计划“激活使用高pH值增长介质的bradyzoites。宿主细胞培养上盖玻片，与速殖子感染，要么与γ干扰素和脂多糖（BMMs）此外激活或暴露于高pH值生长介质三天（HFFS）。宿主细胞的感染完成后，将固定，通透，并阻止。囊壁将使用荧光显微镜罗丹明DBA的可视化。
Protocol
1。制备的人包皮成纤维细胞（HFF）涂层的盖玻片
- 井24孔组织培养板底部放置一个无菌的圆形玻璃盖玻片。
- 收获HFFS从一个融合150厘米2烧瓶，冲洗烧瓶中两次，用1X PBS和添加2.5毫升0.025％胰蛋白酶EDTA 。在37 ° C为5-10分钟烧瓶中。
- 攻方对手掌的容量瓶，可以帮助从烧瓶中分离的细胞。一旦细胞有从烧瓶中公布，新增150 HFF中等毫升（贝科的修改鹰中等[]与10％胎牛血清的DMEM 2毫米L -谷氨酰胺，1％青霉素，链霉素）和使用的介质，以冲洗烧瓶中，并收集细胞。
- 分配1毫升，每孔细胞的盖玻片。
- 允许细胞变成汇合在37℃，5％的CO 2。
2。准备的L929 BMC的发展条件培养基（CM）
- L929是一个小鼠的非整倍体纤维肉瘤细胞系分泌巨噬细胞集落刺激因素，经过长期的汇合。这种分泌可从被用来发展成巨噬细胞在细胞培养1的小鼠骨髓细胞的L929细胞的CM。
- 一旦L929细胞融合，让他们为一个额外的7-9天孵化，直到他们出现球形，并开始解除烧瓶。收集上清和沉淀在10分钟的425 XG任何分离的细胞。这上清是CM。
- 一个150厘米2 L929细胞的烧瓶中产生30毫升厘米，它可以产生150毫升的BMC介质。 BMC介质是由10％FBS，CM 20％，1％的青霉素，链霉素，1％的L -谷氨酰胺的DMEM。
3。骨髓细胞培养的骨髓细胞的分离
- 牺牲的CO 2窒息和表面消毒用70％的乙醇C57BL / 6小鼠。
- 解除腿部附近的腹部皮肤，用剪刀切割，暴露腹膜。避免腹腔穿刺。砍掉的腿暴露胫骨和股骨。切用剪刀腿骨骼肌肉组织。
- 要删除股骨，一度跌破膝盖和髋关节附近的一次削减。放置在细菌的Petri菜含有冷1X PBS骨头。不要使用这些步骤的骨髓细胞组织培养处理的培养皿中，因为将坚持永久。使用手术刀刮去多余的肌肉组织。削减略高于膝盖骨的骨髓暴露。
- 重复步骤（b）及（三）收集第二股骨的骨髓。
- 使用一个充满10CC与冷的1X PBS和25号针头，撞出一个50毫升的锥形管骨髓的注射器。骨应该会出现纯白色的一次骨髓被删除。
- 穿过的22号针头的PBS /骨髓混合，打破了任何骨髓总量。
- 在10分钟的425 XG旋转混合，并去除上清。
- BMC的培养基在8毫升，重悬沉淀。加入1毫升细胞悬液和9毫升BMC中等8个细菌培养皿。
- 在37℃，5％的CO 2。
- 第5天，添加10毫升的BMC中等，每块板。第7天，细胞会得到充分的发展。骨髓细胞可传代1-2周后成熟。
- 分裂骨髓细胞，去除培养基，每个培养皿中添加5毫升冷1X PBS。孵育4 ° C为30分钟，待细胞开始解除。断板的骨髓细胞，用无菌移液管冲洗。
- 集中在50毫升的锥形管和沉淀在10分钟的425 XG BMC的。
- 10毫升BMC中期和一个血球计数重悬沉淀。种子2x105 BMC的在底部的圆形盖玻片的24孔板，每孔。一夜之间让BMC的坚持与T.感染前reseeded 弓形虫。多余的骨髓细胞可以在培养皿中以备后用。
4。感染细胞， 以 T 弓形虫
- 感染25厘米融合HFFS 2烧瓶2X10 6 T 。 弓形虫和成长，直到细胞开始溶解（约2-3天） 。
- 使用细胞刮刀去除感染的宿主细胞单层组织培养瓶中，然后释放所通过的27号针头脱落单层从宿主细胞的寄生虫。
- 使用血球，以确定在中期的寄生虫数量。
- 感染HFF单层盖玻片1，协议或议定书第3 BMC的10％以及5寄生虫。让寄生虫侵入3小时37 ° C，5％的CO 2。
5。启动T。弓形虫 bradyzoite发展的环境压力
- Bradyzoite HFFS与介质pH值的增加和CO 2饥饿发展
- 准备发展的中期。发展中等包含的RPM我没有碳酸氢盐1640，1％胎牛血清，青霉素，链霉素，1％和42毫米HEPES。 pH值至8.0，过滤消毒。
- 删除从被感染的HFFS的DMEM培养液，用1X PBS冲洗，并添加发展的中期1毫升。
- 与周围空气中，连续3天在37℃孵育。
- 激活的骨髓细胞
- 准备介质激活骨髓细胞。激活介质是BMC中期辅以100U/ml干扰素-γ和100 ng / ml的脂多糖。在水浴超声2分钟内毒素在使用前要破坏聚集。
- 从水井中删除BMC中型和1毫升激活介质更换。
- 在37℃，5％CO 2为3天。
6。免疫荧光检测
- 用1X PBS冲洗感染井的三倍。
- 修正单层与3％的甲醛20分钟，200ul。
- 取出固定液，用1X PBS冲洗井。
- 添加0.1 M甘氨酸200μL井，并让我们坐了5分钟。
- 删除甘氨酸和用1X PBS冲洗井。
- 加入250μl3％BSA/0.2％TritonX - 100在1X PBS的通透和块单层为30分钟。
- 去除阻塞的解决方案，并与1X PBS冲洗井。
- 添加50μL1:25稀释的罗丹明Dolichos biflorus凝集素在3％BSA/0.2％的Triton X - 100在1X PBS。
- 在室温下放置1小时盖平台摇床板和地点
- 洗净的盖玻片3次，用0.2％的Triton在1X PBS X - 100的5分钟振动筛上的每个平台。
- 摩盖玻片使用VectaShield安装培养基中含有4'6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）。
- 彩绘T。弓形虫可以可视化与罗丹明过滤适当使用荧光显微镜在100倍的放大倍率。
7。代表性的成果
图1显示了代表DBA T 的染色弓形虫在激活楼宇管理维修综合计划“和pH胁迫下HFFS。双方围绕寄生虫显示DBA染色含有空泡，表明囊肿壁成分的存在。激活BMM的图像显示DBA染色，与液泡的表面一致。 T 的截面弓形虫强调在pH HFFS显示囊壁没有染色的内部结构。
图1。 DBA的染色强调T.弓形虫在胁迫条件下，激活楼宇管理维修综合计划“或pH值的细胞内寄生虫强调HFFS，沾满罗丹明标记的DBA（红色） 。微分干涉对比（DIC）的显示囊肿的轮廓和黑色比例尺等于2微米。
在动物实验
在威斯康星州大学的动物护理和使用委员会规定的准则和法规的规定进行了动物实验。
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Discussion
虽然bradyzoite发展的机制尚不完全清楚，T的分子遗传分析弓形虫在组织培养的阶段转换，导致在 2,3,4 bradyzoite囊肿形成有关的基因的发现。也导致了一些bradyzoite标记其他长期胁迫条件下，包括在激活的巨噬细胞的增长 5,6的表达观察分析。上面的方法描述了如何成长T 。 弓形虫诱导发展一个DBA的积极骨髓细胞和HFFS囊肿壁结构。这些结果突出，囊肿发展途径，可以通过不同的应激刺激引起的。
由于T。弓形虫可以在几乎所有的温血动物主机核细胞生长，可用于许多类型的细胞增长T.弓形虫体外 。 HFFS被使用在这个协议，因为他们是接触抑制细胞株。由于细胞培养bradyzoite发展需要三天，它更容易使用细胞株不会长满。 HFFS不能无限期培养的原代细胞。 HFFS组织培养传代的时间越长，他们不太宽容成为高pH介质，从而无法使用他们成为bradyzoite开关。为了达到最佳效果，应在宿主细胞低传，并获准成为汇合后要休息至少一个星期。有诱导的发展，bradyzoites 有 7对宿主细胞的不同影响的替代方法。
弓形虫的蓬勃发展在许多免疫细胞类型。对于某些应用，BMC的是可取的巨噬细胞线，因为他们避免可能已经永生8推出的文物。骨髓细胞在体外实验中也有用，因为它们RAW264.7细胞相比，有一个扁平的形态，使它们更适合显微镜。这里介绍的方法基本的BMC文化，可适应用于其他目的，包括从其他小鼠品系9,10 BMC的生产。与γ干扰素和LPS的活化程度可能有所不同，取决于供应商，甚至很多。因此，有必要滴定激活介质中的最佳和一致的性能使用LPS和IFNγ的金额。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由威斯康星 - 麦迪逊赫尔曼一夏皮罗杰出研究生奖学金（CMT），美国国立卫生研究院奖AI072817（AMP）和美国心脏协会奖0840059N（LJK）大学的支持。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W.
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
