Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Published: April 13, 2011 doi: 10.3791/2096
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3
1Molecular and Cellular Biochemistry, Center for Molecular Neurobiology, The Ohio State University, 2Integrated Biomedical Science Graduate Program, The Ohio State University, 3Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

Summary

وقد اقترح زرع الجزر المعزولة لتكون المعاملة المحتملة للاصابة بداء السكري من النوع 1. نحن هنا وصف الأسلوب لعزل الجزر من بنكرياسات الماوس وزرع لهم في الفضاء تحت المحفظة في الكلى.

Abstract

منذ بداية العمل الرائد الذي Ballinger Reckard ومما يدل على أن زرع جزيرات لانجرهانز في القوارض السكري يمكن تطبيع مستويات السكر في الدم ، وقد اقترح أن تكون جزيرة زرع علاج محتمل لمرض السكري نوع 1 ، 1،2. في الآونة الأخيرة ، عززت التقدم في زرع المزيد من جزيرة الإنسان هذا الرأي 1،3. ومع ذلك ، واثنين من القيود الرئيسية منع زرع جزيرة من كونها حقيقة واقعة على نطاق واسع السريرية : (أ) شرط لأعداد كبيرة من الجزر لكل مريض ، الأمر الذي يقلل كثيرا من عدد من المستفيدين المحتملين ، و (ب) الحاجة إلى كبت المناعة الثقيلة ، الأمر الذي يؤثر بشكل كبير السكان للأطفال المرضى بسبب تعرضهم لكبت المناعة على المدى الطويل. الاستراتيجيات التي يمكن التغلب على هذه القيود لديها القدرة على تعزيز المرافق العلاجية لزرع جزيرة.

جزيرة زرع كبسولة تحت الماوس الكلى هو النموذج المقبول على نطاق واسع لتحقيق استراتيجيات مختلفة لتحسين جزيرة الزرع. هذه التجربة يتطلب عزل من الجزر ذات جودة عالية وزرع جزيرات إلى المستلمين السكري. كل من الإجراءات الجراحية التي تتطلب خطوات يمكن أن يكون أظهر بشكل أفضل عن طريق الفيديو من قبل النص. هنا ، ونحن الوثيقة الخطوات التفصيلية لهذه الإجراءات من قبل كل من الفيديو وبروتوكول مكتوب. نحن أيضا مناقشة لفترة وجيزة زرع نماذج مختلفة : ، خيفي مسانج ، مسانج المناعة الذاتية ، وخيفي الذاتية.

Protocol

1. إعداد ومعايرة الكاشف Liberase

  1. ويستخدم هذا البروتوكول Liberase TL (روش ، القط # 05 401 020 001) انزيم لهضم البنكرياس.
  2. شراء 100 - 200mg في وقت واحد وجعل دفعة كبيرة. اعادة تعليق مسحوق مجفف بالتجميد في الماء المعقم الصف HPLC بحيث يتم تركيز وحدات ونش حوالي 26 في مل. هذا ينبغي أن يكون حوالي 5 ملغ / مل. راجع إدراج الحزمة للحصول على تفاصيل عن الوحدات ونش الواردة في الكثير محددة. مكان قارورة على الجليد لمدة 30 دقيقة مع غير اليهود يحوم كل بضع دقائق. الاختيار لضمان يذوب مسحوق تماما في نهاية 30 دقيقة.
  3. تجمع جميع Liberase حل معا والاختلاط مع يحوم طيف (لا NOT دوامة أو تهزه). قسامة 24.3 الوحدات ونش لأنابيب Eppendorph قبل المبردة ، وتجميد سريع على النيتروجين السائل (أي التعامل معها على أنها الإنزيمات) وتخزينها في -80 درجة مئوية. ينبغي أن يكون هذا 0.935ml تقريبا في أنبوب Eppendorph. كل قسامة هو للاستخدام مرة واحدة (تكفي لمدة 11 الفئران) ويجب أن لا يتم تخزين أو إعادة تجميد إذابة مرة واحدة. بشكل عام ، والأوراق المالية مستقرة لمدة لا تقل عن 6 أشهر.
  4. لكل دفعة جديدة ، ومعايرة فترة حضانة الأمثل. استخدام الأوراق المالية المجمدة ، وليس الأسهم حل حديثا ، من أجل المعايرة ، لمحاكاة ظروف حقيقية التجريبية قدر المستطاع.
    1. معايرة حمام الماء الذي كنت تنوي استخدام بالضبط إلى 37 درجة مئوية باستخدام ميزان الحرارة الزئبقي. استخدام نفس الحاضنة في التجارب المستقبلية.
    2. قبل الاستخدام ، أذاب أنبوب من Liberase على الجليد وإضافته (0.935ml) لتحرير 21.6ml RPMI مصل ، مما يجعل تركيز العمل النهائية 1،08 في وحدات ونش مل. المصل ، وبا وEDTA تمنع Liberase. الزنك والكالسيوم والعوامل المساعدة. متجر على الجليد واستخدام في غضون 1.5 ساعة. هذا يكفي لحوالي 11 الفئران (2ml/mouse).
    3. انظر الخطوة 2.3 لنضح البنكرياس. ويروي عدد ممكن من الفئران في 1 ساعة. ثم استخدم واحد أو اثنين في كل مرة الفئران لحضانة واختبار 10 ، 12 ، 14 ، 16 ، 18 دقيقة مرات الحضانة. إذا كان ذلك ممكنا ، وتشمل فترات الثانية بين 30 أضعاف توقيت الهضم مهم جدا.
    4. استكمال بروتوكول عزلة الجزيرة وتحليل العائد جزيرة والجودة من كل نقطة زمنية الحضانة. في نهاية المطاف يجب أن العائد لن تغير الكثير بين أوقات الذروة ، ولكن نوعية من الجزر في تلك الفترات قد تختلف. لتجارب لاحقة ، استخدم الظروف التي تؤدي إلى أكبر عدد من الجزر الصغيرة التي يتمتعون بصحة جيدة بعد 48 ساعة من العزلة. عمر الفئران ويبدو أن تؤثر على فترة حضانة الأمثل. بذلك ، استخدم الفئران ضمن مجموعة عمرية مماثلة. من الناحية المثالية ، واستخدام الفئران الأسبوع 8-12 القديمة ، ولكن حتى الفئران 8-10 شهر من العمر يمكن أن تسفر عن الجزر جيدة. لأغراض المعايرة واستخدام الفئران الأصغر سنا.

2. الإجراءات الجراحية

  1. اعداد جميع المعدات ووسائل الإعلام قبل euthanizing الفئران المانحة جزيرة.
    1. الأوتوكلاف أو لهب تعقيم الأدوات قبل استخدامها. ينبغي لجميع الصكوك والكواشف (ملامسة عينات) تكون معقمة. لا يمكن أن يؤديها من العزلة وقطف يد الجزر من خارج غطاء تدفق الصفحي دون زيادة كبيرة في معدلات التلوث. ومع ذلك ، وتعقيم الأدوات التي تتلامس مع الجزر أو البنكرياس هو أمر حاسم لتجنب التلوث. وهناك حاجة إلى الأدوات التالية :
      • 1 زوج من المقص لتشريح شق البطن.
      • 2 أزواج من الملقط.
      • 1 ملقط مرقئ المشبك لإيقاف القناة الصفراوية.
      • 0،419 مم سلك شبكة.
      • 0.1 ملم شبكة النايلون القطر.
    2. ينحني عدة إبر عيار 27 بحيث يتم عرض زاوية 70 درجة تقريبا في منتصف الطريق أسفل طول الإبرة. وينبغي على حافة مشطوف من الإبرة مواجهة الداخل من الكوع.
    3. ملء زجاجة رذاذ مع الايثانول 70 ٪.
    4. انشاء مجهر تشريح مع مصدر الضوء الكافي على مقعد في المختبر أو غطاء.
    5. قبل البرد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية. يجب أن يكون الطرد المركزي الدوار دلو البديل ، تكون قادرة على 900xG ، تكون مبردة ، ولها كسر يمكن فض الاشتباك. على Sorvall RT6000D مع الدوار H1000B Sorvall ، هو سرعة 900xG 2400RPM. تتم أبطأ يدور في 800RPM.
    6. وضع الكواشف التالية على الجليد.
      • RPMI (1 ليتر مع المصل 10 ٪)
      • RPMI (200ml دون المصل)
      • 50ml أنابيب مخروطية الشكل (1 لكل البنكرياس)
      • 5ml المحاقن.
    7. يوازن Histopaque1077 إلى غرفة تيمبيrature.
    8. أذاب a قسامة استخدام واحد من Liberase معايرة على الجليد وتمييع مجانا في 22.5ml RPMI المصل. المصل ، وبا وEDTA تمنع Liberase. الزنك والكالسيوم والعوامل المساعدة. متجر على الجليد واستخدام في غضون 1.5 ساعة. هذا يكفي لحوالي 11 الفئران (2ml/mouse).
    9. المياه الدافئة 37 درجة مئوية الحمام.
    10. تكون في متناولهم والفئران كثيرة كما يمكنك يقني ؛ يدخل القنية في 1 ساعة (حوالي 10 -- 18 الفئران).
  2. إعداد الماوس لإقناء ؛ إدخال القنية. أول الموت ببطء الماوس بواسطة الخلع أو عنق الرحم ثاني الاختناق 2. حين تنتهي الماوس ، وملء المحقنة مع 5ml الأسهم Liberase 2ml العمل (1.08 حدات ونش / مل).
    1. الماوس ضعه في وضع الاستلقاء على منشفة ورقية على نطاق ورذاذ تشريح البطن مع الايثانول 70 ٪ قبل فتح البطن مع شق - V من منطقة العانة إلى كل من الجبهة ساقيه. طية الجلد فوق الصدر للكشف عن تجويف البطن.
    2. موقف الفأر مع رئيس لافتا نحو لكم. حدد موقع إدخال الاثنى عشر من القناة الصفراوية المشتركة على النحو المبين في FIG.1. يمكن القيام بذلك من دون النظر من خلال تشريح نطاق الهدف.
    3. المشبك افتتاح الإثناعشرية مع مرقئ كما هو موضح في FIG.2. المشبك موقف حاسم لوقف تدفق Liberase في الامعاء. إذا المشبك عالية جدا أو منخفضة جدا ، وسوف لا يروي Liberase البنكرياس. مرقئ الموقف ، بحيث عند ضغطها ، فإنه يعمل على طول الحدود بالضبط البنكرياس / الأمعاء.
  3. قبل cannulating القناة الصفراوية المشتركة ، قد يكون من الضروري إعادة الكبد عن طريق الضغط عليه حتى ضد الحجاب الحاجز ، بحيث يتم كشفها على طول القناة الصفراوية المشتركة (FIG.3). مرة واحدة على طول القناة الصفراوية المكشوفة ، واستخدام عازمة 27 gague إبرة تعلق على حقنة مليئة Liberase لإقناء ؛ إدخال القنية. هناك نوعان من تقنيات cannulating القناة الصفراوية.
    1. في الأسلوب الأول ، أو أسلوب "اليد الحرة ، وفرضت على مرقئ يتم سحبها بعيدا عن العفج رئيس الماوس نحو الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة مشدود. هناك التقاء في وثيقة القناة الصفراوية للكبد ، حيث تستنزف الصفراء من المرارة والأنزيمات من الكبد معا قبل الدخول في الامعاء. ما يتعرض له من داخل الخامس شكلتها هذه نقطة التقاء من خلال سحب القناة الصفراوية وضيق هو المكان المثالي لبدء إقناء ؛ إدخال القنية من القناة (FIG.4). إذا كان وضعه بشكل صحيح ، فإن الإبرة الشريحة من خلال الحق في الخامس ، ويقني ؛ يدخل القنية مباشرة على الجزء السفلي من القناة. إدراج عدة مليمترات الإبرة في القناة قبل صرفها في Liberase. الأمثل موضع إبرة المهم لمنع ارتجاعي في الكبد والمرارة. بالإضافة إلى ذلك ، فمن المهم أن الإبرة لم يدرج حتى الآن أنه يعرقل مجرى الهواء الطحال. القناة الطحال هو من الصعب أن نرى فرع من القناة الصفراوية المشتركة ، وأنها تستنزف ذيل الطحال والبنكرياس ، وهي منطقة الجزيرة الغنية. إذا كانت إبرة الشرائح الماضي فتح باب القناة الطحال ، وسيكون هناك أقل من نضح كاملة من ذيل الطحال والهضم خفض محتمل في هذا المجال. العائد الأمثل جزيرة يحدث عندما عمق الخاص الإبرة ويكفي أنه لا يوجد حتى الآن Liberase يهرب إلى المثانة الكبد / المرارة ولكن ليس حتى الآن أن كنت قد مرت القناة الطحال. يمكنك اختبار لإقناء ؛ إدخال القنية الناجحة التي قام بها الاستغناء عن كمية صغيرة من Liberase. إذا كنت ترى Liberase سد القناة ثم الاستغناء عن بقية 2mls. إذا كانت المنطقة المحيطة تبدأ القناة لملء ، والتوقف عن صرفها ، وإعادة وضع الإبرة ، وحاول مرة أخرى.
    2. في الأسلوب الثاني ، أو أسلوب "ملقط مساعدة" ، وفرضت على العفج مرقئ يتم سحبها بعيدا عن رئيس الماوس نحو الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة مشدود. ثم ، باستخدام عازمة 27 gague إبرة تعلق على حقنة 5ml ، ثقب اللفافة تحت القناة الصفراوية المشتركة على مقربة من الكبد. استخدام الإبرة لمسح لفافة من القناة (FIG.5). مع الإبرة لا تزال في مكانها ، تعيين مرقئ أسفل والتقاط زوج من الملقط. استخدام ذراع واحدة من فتح ملقط لرفع القناة الصفراوية حيث الإبرة ومسح اللفافة. على قمم التلال في ملقط إنشاء المسالك التي يمكن استخدامها لتوجيه الإبرة في القناة. في حين سحب لاصق وملقط تجاهك ، الشريحة الإبرة في القناة باستخدام الملقط باعتبارهم حاجزا وقائيا. اختبار لإقناء ؛ إدخال القنية التي صرفها على كمية صغيرة من Liberase. إذا كانت القناة تبدأ لملء (FIG.5 سهم) ، موزعة على بقية 2mls. إذا كانت المنطقة المحيطة تبدأ القناة لملء ، والتوقف عن صرفها ، وإعادة الإبرة وحاول مرة أخرى.
  4. كما 2mls من Liberase يملأ البنكرياس ، والمنطقة القريبة من اثنى عشر يبدأ في توسيع الأولى ، تليها منطقة على رأس المعدة ، وأخيرا ذيل الطحال (FIG.6). ابحث عن التوسع حتى في البنكرياس (FIG.6). إذا كان مجال واحد يبدأ في توسيع وكنت لا أرى في الأنسجة البيضاء توسيع بالتساوي ويتباعد ، فمن المحتمل ألا يكون قد تم في القناة الصفراوية المشتركة مقنى ، بعد الإبرة داخل الكبسولة البنكرياس. سوف ملء الكبسولة مع Liberase لم يسفر عن جزيرة الغلة العالية والمساحة السطحية المعرضة للانزيم ستكون منخفضة. إذا كان هذا يحدث ، ووقف وإعادة التروية الإبرة.
  5. بمجرد perfused البنكرياس ، ويمكن إزالته من الماوس بسحبه خالية من نقاط الاتصال مع الأمعاء والمعدة والطحال. بدء بإزالة مرقئ من الاثني عشر. ثم ، استخدم ملقط لرفع اثنى عشر والبنكرياس فصل من الأمعاء مع الزوج الثاني من ملقط (FIG.7A - B). يتم ذلك عن طريق عقد الزوج الثاني من ملقط ثابت في حين سحب الأمعاء خارج البطن. المقبل ، وسحب البنكرياس خالية من الجزء العلوي من المعدة والطحال (FIG.7C - D). أخيرا ، رفع من البنكرياس في البطن وقطع عليه مجانا من اتصالات لفافة المتبقية (FIG.7E - F).
  6. مكان البنكرياس في أنبوب 50ml المخروطية وترك الأمر على الجليد بينما كان يعمل على الفئران الأخرى. بدء الموقت 1 ساعة. لجزيرة الغلة القصوى ، المكان الوحيد 1 البنكرياس في كل أنبوب. فمن غير المستحسن ترك بنكرياسات perfused على الجليد لأكثر من 1 ساعة ، كما ستبدأ Liberase أن تتحلل الأنسجة. في نهاية كل ساعة ، نقل على الفور إلى الخطوة 3.0 لجميع بنكرياسات التي كانت perfused.
  7. كرر الخطوات من 2،3-2،6 للفئران المتبقية أو حتى الموقت 1hour بدأت في الخطوة 2.6 انتهت صلاحيته.

3. تنقية الفشوت من بنكرياسات Perfused

  1. قبل أن يتم تنقيتها الجزر من البنكرياس ، ويجب أن يهضم الأنسجة عند 37 درجة مئوية. مجموعة أنابيب 50ml تحمل الجزر perfused في الرف السفلي فتح التي تناسبها في حمام ماء C ° 37. ضمان تأمين جيدا في جميع القبعات وأنابيب يغرق في حمام الماء ° 37 مئوية لكمية محددة من الزمن محددة مسبقا للدفعة الحالية Liberase (انظر الخطوة 1.4). في نهاية الحضانة ، نقل الأنابيب إلى جليد وإضافة RPMI1640 مع 10 ٪ من مصل 20mls في الأنبوب. وسوف تتضمن وسائل الاعلام المصل وقف Liberase الهضم.
  2. تنأى الأنسجة التي تهز أنابيب بقوة 40 مرات في 10 ثانية. هذه الخطوة الحاسمة لضمان الشفاء التام من الجزر. حتى مع نضح Liberase الأمثل ومعايرة بإحكام الوقت الهضم ، وسوف تكون منخفضة الغلة جزيرة إذا لم يتم كسر الأنسجة تصل. معالجة العدوانية للعينات في هذه الخطوة لا يبدو أن الضرر الجزر الماوس وضروري لتحريرهم من مجموعات الخلايا الإفرازية.
  3. لفصل جزيرات البنكرياس من هضمها ، واستكمال الخطوات التالية.
    1. تجمع بنكرياسات يهضم حتى ان هناك ما يقرب من 2.5 بنكرياسات في الأنبوب. في القيام بذلك ، سيتم تكثيف ten أنابيب أنابيب إلى 4 50mls مع وسائل الإعلام لكل منهما.
    2. أنابيب الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800RPM و 4 درجات مئوية.
    3. تخلصي من طاف وresuspend الكريات في 15 25mls وسائل الاعلام مع FBS 10 ٪ بحلول vortexing بلطف (ضبط شدة الدوامة إلى ما يقرب من 50 ٪ من الحد الأقصى) لعدة ثوان.
    4. صب الطين معلق من خلال اسلاك 0.419mm والقمع في أنبوب 50ml جديدة المخروطية. يفصل هذا الخروج عدم استيعاب الأنسجة والدهون والليمفاوية. شطف الأنبوب الأولي مع 10mls إضافية من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ FBS ويسكب من خلال شبكة سلكية. كرر هذه العملية لأنابيب المتبقية.
    5. أنابيب الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800RPM و 4 درجات مئوية.
    6. تخلصي من طاف وعكس بدقة أنابيب على منشفة ورقية. مشاهدة للتأكد من أن الجزر لا تنزلق قبالة. مسح داخل الأنابيب مع منشفة ورقية لإزالة بقايا وسائل الإعلام ، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. العودة الأنابيب لوضع مستقيم.
    7. Resuspend الكريات في 5mls من درجة حرارة الغرفة التي histopaque1077 vortexing بلطف لعدة ثوان. تأكد من أن التعليق غير متجانسة قبل إضافة 5mls إضافية حول histopaque داخل الأنبوب. هذا يغسل الجزر قبالة جدار الأنبوب.
    8. تراكب مع histopaque 10mls المصل RPMI مجانا ، والحرص على الحفاظ على واجهة حادة بين histopaque وسائل الإعلام. إضافة وسائل الاعلام pipetting ببطء أسفل الجانب من الأنبوب بمعدل 1ml في 10 ثانية. وينبغي أن تكون وسائل الاعلام على القمة ، وhistopaque في القاع. مصل يؤثر على كثافة وسائل الإعلام ، وينبغي ألا تستخدم خلال هذه الخطوة.
    9. تدور العينات في جهاز طرد مركزي معايرتها إلى 20 درجة مئوية في 2400RPM (900xG) لمدة 20 دقيقة مع التسارع والكبح بطيئة جدا لا. هذه الخطوة تفصل بين الجزر من الخلايا الإفرازية. سوف الجزر الهجرة إلى الواجهة بين وسائل الإعلام الحرة وHistopaque مصل بينما الخلايا الإفرازية وايليرة لبنانية تشكيل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    10. جمع الجزر من واجهة histopaque / وسائل الإعلام مع ماصة 10ML المتاح المصلية. سوف الجزر التمسك الزجاج ، ولذلك لا ينبغي أن يستخدم ماصات زجاجية ما لم تكن قد siliconized فيها. مكان الجزر في أنبوب 50ml جديدة المخروطية. ويمكن تجميع العديد من الأنابيب عند هذه النقطة. ملء الأنابيب ل50ml مع مصل يحتوي على RPMI.
    11. أنابيب الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800RPM و 4 درجات مئوية.
    12. تخلصي من طاف وresuspend الجزر في 50mls المصل RPMI المحتوية على vortexing بلطف.
    13. أنابيب الطرد المركزي لمدة 90 ثانية في 800RPM و 4 درجات مئوية.
    14. تخلصي من طاف وتكرار غسل 1 مرة أكثر من ذلك.
    15. تخلصي من طاف واتخاذ أنابيب للأنسجة هود الثقافة. إضافة القلم / لبكتيريا تحتوي على 10 ٪ RPMI FBS إلى تركيز النهائي من 1 ٪ لجعل وسائل الإعلام ثقافة الجزيرة. Resuspend الجزر في 5mls من هذه الوسائط الثقافة.
    16. عكس خلية النايلون 0.1mm مصفاة ووضعه على أنبوب مخروطي 15ml. تمر ببطء الطين معلق الجزيرة من خلال مصفاة. وسيتم الإبقاء على الجزر من قبل مصفاة في حين أن الخلايا الإفرازية تمر في أنبوب مخروطي 15ml. هذه الخطوة يزيد بشكل كبير من نقاء الجزر مع الاحترام للتلوث الخلية الاكسوكرين في نهاية البروتوكول.
    17. شطف الأنبوب 50ml المخروطية مع 6mls إضافية من وسائل الإعلام وماصة من خلال مصفاة.
    18. 3mls مكان وسائل الإعلام إلى الثقافة باعتبارها انخفاض كبير في طبق بتري 10 سم. عكس الحق مصفاة تصل الخلية الجانب ، بحيث يمكن أن تراجع على السطح تستخدم لالتقاط الجزر إلى إسقاط وسائل الإعلام. ولمس مرشح الى وسائل الاعلام نقل معظم الجزر في ثقافة غير الأنسجة تعامل طبق بتري. استخدام طبق بتري غير المعالجة الحاسمة لتجنب التصاق وتشتيت جزيرة على سطح اللوحة. وأكثر من ذلك بكثير بسهولة التقطت الجزر العائمة الحرة للانفصال في المجموعات التجريبية.
    19. ماصة إضافي 5 - 7mls الثقافة وسائل الإعلام من خلال مصفاة في طبق بتري لغسل أي الجزر المتبقية الخروج من مصفاة في الطبق.
    20. تحقق العائد جزيرة والجودة في ظل الهدف 4X على مجهر مقلوب. ويحوم في طبق بيضاوي ضيق جمع الجزر في وسط الطبق. إذا كانت الجزر تبدو جيدة ، يمكن إما أن تكون التقطت على الفور للاستخدام التجريبي أو المنفصلين بالتساوي بين 4-6 10cm وحات بيتري (10 في المائة الفئران). زراعة الكثير من الجزر في طبق نفس الأسباب الجزر لتصبح نخرية وتتحلل. للتجارب ، 250-300 الجزر في صحن 6cm 3mls - 2 مع وسائل الإعلام لا يظهر أن أشدد على الجزر.
    21. وسوف يكون هناك بعض الجزر الصغيرة التي يمكن استخدامها في الأنبوب 15ml المخروطية التي جمعت الخلية النايلون 0.1mm تدفق من خلال مصفاة. ويمكن استعادة هذه الجزر التالية 3-4 جولات من الترسيب الجاذبية. بعد حوالي 4 دقائق من الترسبات ، ولكن جميع نضح 1ml تقريبا من وسائل الإعلام من انبوب الملء وإلى أعلى مع وسائط الثقافة. غطاء الأنبوب وعكس إلى المزيج. تكرار هذه العملية عدة مرات يزيل الكثير من الخلايا وحيدة الخلية الإفرازية التي تعاني من البطء في الرواسب ، ويثري أثقل مجاميع من خلايا الغدد الصماء (الجزر) التي تغرق بسرعة. بعد الشفط النهائي ، في resuspend 7mls من وسائل الإعلام والثقافة ، وطبق في طبق بتري الطازجة.

4. العمل مع الفشوت متفرقة

  1. عملية العزل هو مرهقة إلى حد ما على الجزر ؛ histopaque غير سامة ، والهز والخطوات لحث على الضغط الهائل الطرد المركزي ، والعزل من إمدادات الدم المضيفة ، وكذلك في المختبر يمكن أن تحدث الثقافة نقص الأكسجة. لقد أظهرنا أن العزلة وغيرها من يحرض خلايا بيتا 4-5 الموت. ويعتبر تأثير هذه الضغوط من قبل النزع من الخلايا من محيط الجزيرة وسواد والطرد من نواة مركزية من الجزيرة (وسط النخر). في حين يمكن التساهل فيه النزع من الخلايا من المحيط ، وتنخر مركزي للجزيرة غير مؤهلة للاستخدام في التجارب. عادة ، أكبر جزيرة ، زادت فرصة أن نخر المركزية سوف يكون مشكلة. والجهود الرامية إلى الحد من التوتر في جزيرة العزلة استجابة آخر زيادة الغلة من الجزر صالحة للاستعمال.
  2. ولذلك ، فإننا نستخدم تقنية ذكرت في وقت سابق من يحتضنها الجزر في 22-27 درجة مئوية الأنسجة حاضنة للثقافة 48-72 ساعة الأولى بعد العزلة 6-8. انخفاض درجات الحرارة هذا يخفف من حدة التوتر استجابة الجزر وينعم تحولها إلى ثقافة في المختبر. إذا كان النسيج 22-27 درجة مئوية حاضنة الثقافة ليست متاحة ، فمن الممكن لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة في حاضنة نسيج الثقافة القياسية عن طريق إيقاف مراقبة الحرارة ووضع ما يقرب من 20 £الطوب الفريزر معايرتها إلى -80 درجة مئوية. هذه النتائج في 24hours - 16 تقريبا من درجة الحرارة انخفضت في الحاضنة. استبدال الثلاجة -80 درجة مئوية الطوب حسب الحاجة. نحن لم يلاحظ وجود فائدة إضافية من الحضانة في هذه انخفاض درجة الحرارة أكثر من 72hrs.
  3. بالإضافة إلى حضانة درجة حرارة منخفضة ، نوصي تغيير وسائل الاعلام بعد 24-48 ساعة العزلة. العوامل يفرز من الجزر وشدد والقتلى تتراكم في عزلة وسائل الاعلام التالية ويمكن أن تعزز التوتر جزيرة إضافية. لتغيير وسائل الإعلام ، واستكمال الخطوات التالية.
    1. نقل وسائل الإعلام والجزر من طبق بتري لأنبوب مخروطي 15ml باستخدام ماصة بلاستيكية.
    2. غسل لوحة 3mls إضافية مع وسائل الإعلام الثقافة لجمع الجزر المتبقية.
    3. أضف هذا 3mls إضافية لأنبوب مخروطي 15ml الجزر والسماح لثقل الرواسب 5min.
    4. نضح جميع وسائل الإعلام ولكن 1ml من الأنبوب المخروطية 15ml ، ثم resuspend الجزر من وسائل الإعلام في 4mls ثقافة الجزيرة.
    5. نقل الجزر وسائل الإعلام على لوحة بيتري الطازجة. إضافة 3mls إضافية من وسائل الإعلام والثقافة لأنبوب مخروطي 15ml لجمع أي الجزر المتبقية وإضافة هذا إلى لوحة بيتري.
    6. تغيير وسائل الإعلام الجزيرة كل يوم 3-5 بعد ذلك.
  4. عند اختيار الجزر للتجربة ، فمن غير المستحسن أن مزيج من العزلة الجزر المختلفة. ويتأثر الأساس الجزيئي للالجزر بواسطة أشياء كثيرة ، بما في ذلك مقدار الوقت الذي تم في الثقافة والضغط العزلة التي تختلف من الإعدادية إلى الإعدادية. للحد من التباين ، يجب إجراء التجارب على جزيرة الجزر التي كانت معزولة في نفس الوقت. ومع ذلك ، إذا لم يكن هذا ممكنا ، فإننا نقترح بقوة تجمع جميع الجزر الصغيرة في مجموعة واحدة قبل انتشالها لإجراء التجارب. لالتقاط الجزر للتجارب ، واستكمال الخطوات التالية.
    1. إذا تحتضن الجزر في أكثر من طبق واحد ، تجمع كل الجزر في طبق واحد عن طريق الخطوات التالية 4.3.1 خلال 4.3.5 المذكورة أعلاه. إذا اشترك عدة أطباق من الجزر ، يجب استخدام أنبوب 50ml مخروطية بدلا من الأنبوب 15ml. وهذا يمكن تقليل التقلبات الناجمة عن الفروق الدقيقة في ظروف الثقافة بين لوحات خلال فترة الانتعاش بعد انتهاء العزلة.
    2. خلال الرواسب خطورة الجزر وانشاء المجهر المقلوب مجهزة الهدف 4X أو 10X. جمع micropipette P200 و P200 مربع من النصائح العقيمة.
    3. نقل الجزر الرسوبية لوحة واحدة والانتقال إلى لوحة المجهر. دوامة لوحة لجمع الجزر في الوسط. إزالة غطاء لوحة واستخدام ماصة P200 لالتقاط الجزر صحية. الجزر صحية والحدود على نحو سلس وليس مناطق وسط الظلام (الشكل 8). محاولة للحفاظ على توزيع الأحجام حتى في جميع أنحاء الجزيرة التجريبية أطباق بحجم جزيرة يمكن أن يغير استجابة للعلاج.
    4. يمكن أن تتفاوت وفقا لعدد من الجزر في المجموعة التجريبية على احتياجات التجربة. نحن نقدر أن واحدا تقريبا 1000-2000 وجزيرة الخلايا وسيحقق 0.3 1μg من البروتين والحمض النووي الريبي 25ng من المجموع. لفحوصات في المختبر ، يمكن لمجموعة نموذجية تجريبية ما بين 100 و 250 جزيرة صغيرة مطلية في 35mm أو 6cm الأطباق 3ml - 1 مع وسائل الإعلام. للزرع ، سيكون لكل الماوس المستفيدة تتطلب ما بين 150 و 400 الجزر اعتمادا على التصميم التجريبي (انظر الخطوة 5.2.2 والمناقشة لمزيد من التفاصيل).
    5. للحد من التغيرات التي أدخلتها عملية قطف اليد ، ونحن نستخدم الفتحة من طرف P200 - ماصة كدليل لتقدير حجم جزيرة. معظم الجزر ويبلغ قطرها حوالي نصف قطر الفتحة ، ونحن نعول كل منها جزيرة واحدة القياسية. أي الجزر أكبر أو أصغر من ذلك ، نحن تعيين عدد جزيرة مختلفة تبعا لذلك. نجمعها الجزر على دفعات من 20-50 ونقلها إلى أطباق التجريبية المحددة. إذا تم تعيين P200 - ماصة في حجم 180 microliters ، يمكن للمرء أن جمع الجزر متعددة (عادة أكثر من 50 جزيرة صغيرة) في طرف واحد. وهكذا ، حتى ولو يتم انتقاؤها الجزر في وقت واحد ، يمكن للمرء أن جمع العديد من الجزر الصغيرة داخل كل طرف ، P200 عن طريق التحكم في آلية إطلاق pipetman. هذا يسهل التقاط مئات أو حتى أكثر من ألف من الجزر اللازمة لإجراء التجارب. ونحن أيضا استخدام هذه العملية دفعة من الحكمة لمساعدة حتى من توزيع الجزر مع نوعية وحجم مماثل.

5. تحت المحفظة زرع الكلى جزيرة

  1. حمل السكري في الفئران المتلقي الزرع.
    1. الفئران مكان على ساعة سريع 4-6. وينبغي أن يكون متلقي زرع الأمثل ما بين 6 الى 10 اسابيع من العمر ويزن 20-25 غرام في وقت سريع. على الفئران الصيام ، وإزالة الطعام من feediنانوغرام الرف ومكان دائما في قفص الفئران الطازجة. هذا يضمن سريع الحقيقية التي تفصل بين الفئران من أي أجزاء المتبقية من الطعام قد تراجعت في وقت سابق في قفص بهم. خطة لمدة 80 ٪ إلى 90 ٪ من الفئران لتصبح السكري.
    2. ثلاث ساعات في الصيام ، وإعداد الاحتياطي السيترات الصوديوم. تزن خارج 0.735g إنزيم السيترات الصوديوم الصف (نا السيترات ، السيد 294.10 غ / مول) واذابته في الماء منزوع الأيونات 25mls العقيمة. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. يجب أن تقدم هذه عازلة جديدة لكل جولة من التجارب.
    3. مكان 0.05g بالستربتوزوتوسين (STZ ، M ص 265.2 غ / مول) في أنبوب Eppendorph 1.5ml. هذا المبلغ يكفي للحث على مرض السكري في حوالي 8 الفئران. إعداد عدد كاف من الأنابيب 1.5ml لعدد من الفئران ليتم حقنه. STZ خفيف الحساسة ، بحيث تغطي كل أنبوب بورق الألمنيوم.
    4. بعد 4 ساعات من الصيام ، resuspend أنبوب واحد من STZ مع 1ml المصنوعة حديثا نا السيترات العازلة. معلق مرة واحدة ، والحل السيترات STZ - نا يفقد النشاط في غضون 15 إلى 20 دقيقة ، لذلك ينبغي الا تكون هذه الخطوة القيام به على الفور قبل حقن الفئران.
    5. حقن كل intraperitoneally الماوس مع حجم المناسبة من الحل السيترات STZ - نا لتحقيق الجرعة النهائية من 190mg/kg الماوس. قد تختلف هذه الجرعة من سلالة وعمر الفأر ، وبالتالي قد يكون من الضروري إجراء التحسين الجرعة إذا كان معدل الإصابة بمرض السكري منخفض جدا أو إذا كان الكثير من الفئران يموتون في الأيام 3-5 حقن التالية. استخدام جرعات تتراوح المشتركة 150mg/kg الماوس إلى ماوس 250mg/kg.
    6. إمدادات الغذاء والماء مرة واحدة وقد تم حقن جميع الفئران.
    7. فئران تجارب لغير الصيام ارتفاع السكر في الدم (> 350mg/kg) 2 إلى 4 أيام بعد الحقن. ويمكن استخدام الفئران التي تثبت 3 أيام متتالية من ارتفاع السكر في الدم الصيام غير كمتلقين الزرع.
  2. إعداد الجزر لزرع
    1. عزل الجزر على النحو المبين أعلاه في خطوات 2.0 خلال 4.0. إذا لزم الأمر ، يمكن أن تكون معزولة على الجزر يوميا من زرع أو قبل ذلك.
    2. اختيار الجزر إلى مجموعات من أجل زرع عن طريق وضعها في أنابيب معقمة Eppendorph 1.5ml. إبقاء الأنابيب على الجليد. قد تختلف نظرا لعدد من الجزر الصغيرة اللازمة لاستعادة normoglycemia ظروف التجربة (سلالة جزيرة المانحة والوزن وسلالة من المتلقي ، وأية علاجات إضافية نظرا إلى المتلقي) ، والشخص الذي يتم التقاط الجزر. حجم الفأر المستلم هو متغير واحد التأثيرات الرئيسية التي الحد الأدنى من عدد جزيرة ، والفئران الكبيرة سوف يتطلب المزيد من الجزر. نجد دائما أن الجزر 150-250 هامشيا فقط في حين يستعيد normoglycemia 300 الجزر او اكثر هو العلاجية في 18 إلى 20gram C57BL / 6 الماوس المتلقي. في هذه التجارب ، كانت الفئران المانحة جزيرة إما C57BL / 6 أو BALB / ج.
  3. الجزر لزرع الكلى الحقيبة تحت المحفظة
    1. تجميع المواد التالية (يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية) :

      الجدول 1. معدات للزراعة
      25μl هاميلتون الحقنة 6 قطع "من أنابيب PE 50 مرنة بحيث يتم مشطوف جانب واحد
      هلام التحميل وP200 نصائح ماصة Eppendorph أنابيب معقمة (1 في المتلقي)
      وIsoflurane Isoflurane المرذاذ Eppendorph رفرفالأنابيب
      مكفرسون - Vannas مقص (1) ملقط الذراع عازمة (2)
      المرقأة (1) مقطع الجرح مع لقطات
      إبرة قياس 27 سحبت اللهب تحقيقات زجاج الأنابيب الشعرية *
      القطن يميل تطبيقها 50ml أنبوب مخروطي من برنامج تلفزيوني العقيمة
      الغرز المقص الكهربائي
      70 ٪ زجاجة بخاخ الايثانول الكرة نقطة القلم
      Betadine واضح من البلاستيك العقيمة ثنى


      * ملاحظة : عند إعداد هذه التحقيقات ، ومحاولة لخلق قوس في التحقيق الذي يحاكي زاوية الكلى الماوس. بالإضافة إلى ذلك ، ضمان كاف ملتهب في نهاية التحقيق المصقول بحيث لا وجود حواف حادة.
    2. وتزن كل الفئران العلامة المتلقي السكري. تعيين كل الماوس إلى المجموعة التجريبية قبل الزرع بحيث يقابل كل مجموعة وبالمثل وزن الجسم.
    3. انشاء الجراحي الميداني داخل غطاء جبهة مفتوحة مجهزة مأخذ الغاز من المرذاذ Isoflurane.
    4. تخدير المتلقي ماوس مع isoflurane ثم يحلق حدودها مع المقصات الكهربائية. حلق الماوس خارج المنطقة التي سيتم تنفيذ عمليات زرع.
    5. عودة الماوس لتخدير ووضعه عمودي على الكذب ومباشرة فوق رمح قضيب الزجاج بحيث ينبري الجناح حلق. الجناح رذاذ مع الايثانول 70 ٪. الفأر هو أن هيأهم مع فرك الجراحية التناوب betadine والكحول وكرر ثلاث مرات. ثنى الماوس مع ثنى العقيمة واضحة تسمح بالوصول إلى الجهة حليق.
    6. إعداد الجزر لزرع بينما الفأر يجري تخدير. القيام بذلك بواسطة إكمال الخطوات التالية.
      1. وضع الجل المعقم تحميل طرف في افتتاح أنبوب Eppendorph 1.5ml حتى لا يكون هناك منحنى لطيف مما يجعل شكل U في النهاية الضيقة للطرف. وينبغي أن افتتاح قمة تكون مواجهة مباشرة من الأنبوب Eppendorph. لا إدخال شبك في أي نقطة في هلام تحميل طرف لأن ذلك سوف يؤدي إلى القص من الجزر ، وانخفاض في عدد من الجزر التي يتم زرعها.
      2. إزالة بلطف من الجليد أنبوب من الجزر التي تم إعدادها في الخطوة 5.2.2. ينبغي أن تسوى جميع الجزر في الجزء السفلي من الأنبوب. باستخدام ماصة P200 ، وجمع بلطف الجزر في حجم الحد الأدنى من أسفل الأنبوب. نقل هذه الجزر من خلال فتحة كبيرة من هلام تحميل الطرف الذي أعد الخطوة 5.3.6.1. ينبغي أن تستقر في الجزر على طول ضيقة أو تقييد الضيقة للهلام غيض التحميل.
      3. بعد الجزر والرسوبية ، وإزالة أكبر قدر من وسائل الإعلام من طرف جل التحميل ممكن. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الجل الطازجة تحميل طرف تعلق على ماصة P200 بواسطة الشفط وسائل الإعلام من خلال فتحة كبيرة من طرف جل التحميل جزيرة الحاملة.
      4. نقل الجزر الرسوبية في أنابيب مرنة PE 50 (~ 15cm في الطول). يمكن القيام بذلك عن طريق ربط لأول مرة نهاية غير مشطوف من الأنبوب إلى فتحة ضيقة من طرف جل التحميل جزيرة الحاملة قبل إرفاق تلميح إلى ماصة P200. ويمكن بعد ذلك أن هذه الجزر من خلال دفع 60 ٪ من طول الأنبوب.
      5. نقل جزيرة تحمل أنابيب PE 50 إلى حقنة 25μl هاميلتون. تأكد من تم سحب الغواص حقنة قبل نقل الأنبوب. الاتصال حافة غير مشطوف من أنابيب البولي ايثيلين إلى 50 إبرة المحقنة.
      6. كساد الغطاس من الحقنة حتى الجزر هي 0.5cm تقريبا بعيدا عن افتتاح مشطوف.
      7. تعيين حقنة جانبا حتى أن الجزر قد يستقر في كتلة واحدة قرب افتتاح مشطوف من الأنبوب بينما يجري إعدادها لاستقبال الكلى الجزر.
    7. باستخدام أصابعك ، وتوطين الكلى عن طريق الجلد من الفأرة تحت التخدير. ينبغي للرمح الكرة نقطة القلم تكون مباشرة تحت المنطقة التي يقع فيها الكلى ووضع عمودي على الحبل الشوكي.
    8. بمجرد المترجمة الكلى ، استخدم مقص مكفرسون - Vannas لإجراء شق 2cm من خلال الأدمة مباشرة فوقه في اتجاه عمودي على الحبل الشوكي. وسوف يعرض هذا شق الجدار البريتوني.
    9. مع مقص مكفرسون - Vannas إجراء شق 1cm من خلال الجدار البريتوني في الاتجاه نفسه مثل قطع من خلال طبقة الجلد. من المهم أن فتح التي خلقها هذا الشق يكون أصغر من أن تتعرض الكلى.
    10. رمح باستخدام قضبان الزجاج باعتبارهم حاجزا وقائيا ، والقوة في الكلى البريتوني من خلال فتح طريق الضغط باستمرار على اله السطح المجاور. إذا فتح أصغر قليلا من الكلى ، والكلى الضغط من خلال افتتاح وبقية ستابلي على سطح الماوس دون أي تلاعب أو إضافية للإتصال به. هذا الموضع هو الأمثل للخطوات اللاحقة الزرع. إذا كان فتح كبير جدا ، وسوف يرتد الكلى في التجويف البريتوني ، مما يجعل من الصعب استكمال الخطوات اللاحقة.
    11. يميل الرطب على سطح الكلى يتعرض العقيمة مع الجليد PBS الباردة باستخدام قطعة من القطن مبللة قضيب. كرر هذه الخطوة كل بضع دقائق أو حسب الحاجة لمنع الكبسولة الكلى من الجفاف.
    12. باستخدام إبرة قياس 27 ، وجعل شق 0.2cm من خلال كبسولة الكلى عبر السطح الأمامي للنقل الكلى من الجانب الوحشي تجاه الجانب الأيسر الجانبي الأيمن.
    13. الشعلة باستخدام مسبار سحبت زجاج الأنابيب الشعرية ، إنشاء الحقيبة بين كبسولة الكلى وحمة الكلوي. تفعل ذلك عن طريق إدراج التحقيق من خلال شق في الخطوة 5.3.12 وتحريكه في الاتجاه الخلفي على طول السطح الظهري الوحشي في الكلى. وسوف يكون مثاليا لتحقيق منعطف في أن يوافق قوس الطبيعية لهذا السطح من الكلى. هذا سيسمح لجنة التحقيق للوصول الى نهاية معظم الخلفي من الكلى دون تمزيق فتح فتحة كبيرة الأمامي. من المهم أن تجعل هذه الحقيبة طالما وضيق وقت ممكن. الحقائب واسعة قصيرة ليست مثالية لأنها تسمح الجزر للهروب من الكبسولة. الحقائب طويلة وضيقة تسمح تودع الجزر في نهاية الخلفي في الكلى مع فقدان الحد الادنى من الحقيبة المحفظة.
    14. استرداد المحاقن هاميلتون 25μl أعدت في الخطوة 5.3.6 الجزر ونقل إلى حافة جدا من افتتاح مشطوف من أنبوب مرن.
    15. إدراج مشطوف حافة من أنابيب مرنة في الحقيبة أعدت تحت المحفظة خطوة في 5.3.13. ينبغي أن يكون مشطوف حافة مواجهة ، حتى حافة طويلة على اتصال مع لحمة الكلوي. نقل أنبوب إلى نهاية معظم الخلفي من الكبسولة.
    16. نقل ببطء الجزر من أنبوب PE 50 في الحقيبة تحت المحفظة بالضغط على المكبس من المحاقن. كما ان الجزر ملء الحقيبة مرة أخرى ببطء إلى أنبوب مرن مما يجعل مجالا أكبر للالجزر التي ستودع. ضمان أن يتم نقل جميع الجزر من الأنبوب في الحقيبة. لا تملأ الحقيبة مع الهواء أو السوائل الزائدة.
    17. بعد إزالة أنبوب PE 50 من الحقيبة ، واستخدام الشعلة انسحب التحقيق زجاج الأنابيب الشعرية إلى حزمة برفق في الجزر القريبة من نهاية الحقيبة. القيام بذلك عن طريق الانزلاق التحقيق الزجاج على السطح الخارجي للالكلى تتحرك في الاتجاه الأمامي الخلفي ل. توخي الحذر بعدم حزمة الجزر مسرف كنهاية الخلفي من الحقيبة تحت المحفظة قد تمزق والإفراج عن الجزر. هذه الخطوة تقلل من الخسائر في الجزر من فتح الأمامي من الحقيبة عندما يتم وضع الكلى إلى داخل التجويف البريتوني.
    18. باستخدام ملقط رفع ذراعه عازمة بطانة البريتوني المتاخمة لفتح اعتماد لفي الكلى ومن ثم استخدام قطعة من القطن مبللة PBS يميل قضيب لدفع برفق الكلى مرة أخرى في التجويف البريتوني.
    19. إغلاق الماوس عن طريق تطبيق الغرز على الجدار البريتوني ومقاطع الجرح إلى طبقة الجلد.
    20. عودة الماوس لقفص وكرر الخطوات من خلال 5.3.19 5.3.4 للفئران الباقية. يجب أن تبقى دافئة مع الفئران وسادة التدفئة تحت القفص أو مصباح التدفئة مع عيون المحمية حتى يتعافى تماما الماوس من التخدير. وينبغي توفير الحيوانات مع acetominophine في الماء (6 ملغ / مل).
    21. الاختيار غير الصيام مستويات السكر في الدم في وقت لاحق 24hrs. وينبغي أن يكون كل الفئران أسوياء سكر الدم (الجلوكوز في الدم <200mg/dl) في مرحلة ما بعد العملية اليوم (POD) 1.

6. ممثل النتائج

موصوفة اثنين من الإجراءات الرئيسية في هذا البروتوكول : (1) جزيرة العزلة و (2) جزيرة زرع كبسولة تحت الكلى. في الإجراء عزلة الجزيرة ، جزيرة الغلة عادة ما تتراوح بين 100-150 الجزر في الماوس حسب العمر والسلالة. يمكن للنقاء هذه الجزر فيما يتعلق فصلهم من الخلايا في البنكرياس الاكسوكرين تختلف على نطاق واسع بين كل إعداد. إلا أن استخدام Histopaque1077 درجة حرارة الغرفة في الخطوة 3.3.7 وتصفية النايلون 0.1mm في الخطوة 3.3.17 يسمح عادة لالنقاء أكبر من 99 ٪ من الجزر. ويتحقق هذا النقاء قبل أي جهة اختيار إضافية من الجزر. وتظهر الصور ممثل عزلة الجزر 8D التالية في الشكل. كما شوهد في هذه الصور ، والجزر وعادة ما يكون على الحدود الوعرة المحيطة العزلة التالية مباشرة. ولكن ، مع الوقت في الثقافة ، وسوف يكتسب الجزر صحية والمحافظة على الحدود على نحو سلس ، الشكل (8D). في بعض الجزر ، فإن تطوير المنطقة المركزية نخرية ،يبدو وكأنه منطقة مظلمة في قلب. غالبا ما يتم طرد هذا المركز نخرية من الجزيرة التي احتلتها في الوقت الفاصل بين التصوير (فيديو إضافي 1). الجزر المتبقية تظهر جوفاء في المركز (لا تظهر البيانات) ويفترض أن لا وظيفية. وبالتالي ، فإننا استبعاد الجزر مع مركز الظلام خلال عملية اختيار اليد. الأهم من ذلك ، وجدنا أن حضانة درجة حرارة منخفضة بعد إجراء العزل (الخطوة 4.2) يمكن أن تقلل بشكل كبير من عدد من الجزر الصغيرة التي من شأنها تطوير نخر المركزية في الثقافة على مر الزمن.

في إجراء عمليات زرع جزيرة ، واثنين من الخطوات الحاسمة : الحث الكيميائي لمرض السكري وتسليم الجزر إلى منطقة شبه كبسولة الكلى. لتحريض السكري ، والهدف هو تحقيق زيادة في فرط سكر الدم من 90 ٪ من STZ حقن الفئران. وهذه الفئران البقاء على قيد الحياة من دون زرع لعدة أسابيع. الجرعة المثلى للSTZ لتحقيق هذا الهدف ، تبعا سلالات الفأر والعمر ، وينبغي أن يحدده تجريبيا. وجدنا أن فرقا صغيرة مثل 20mg/kg وزن الجسم يمكن أن تحدث فرقا كبيرا. وبالتالي ، يجب إجراء معايرة مع فواصل ضيقة الخروج. لزرع جزيرة ، وهو اعتبار أساسي هو النماذج ، والتي يمكن لها أربعة سياقات المناعية : مسانج ، خيفي ، مسانج المناعة الذاتية ، وخيفي الذاتية. في النموذج مسانج ، سلالة المانحة هو نفس السلالة المتلقية. وبالتالي ، فإن الجزر لا تحتج على التكيف استجابة المناعة من المتلقين. هذا يسمح للباحثين للتحقيق في القضايا المحيطة "الأولية غير وظيفة" ، وهو مصطلح يشير الى ضعف وخسارة الجزيرة لأسباب أخرى من الرفض المناعي محددة من المتلقين. ويعتقد الأولية غير وظيفة أن يكون السبب الرئيسي لفشل الجزيرة في مرحلة مبكرة وزرع لاشتراط وجود عدد كبير من الجزر الصغيرة (2 ≥ بنكرياسات / المريض) لتحقيق سوائية سكر الدم. وهكذا ، بل هي قضية حاسمة لعملية زرع جزيرة. في هذا النموذج ، كتلة جزيرة الهامشية التي لا يستعيد تماما وينبغي أن تستخدم normoglycemia وينبغي دراسة الفئران لمستوى السكر في الدم في مرحلة مبكرة في اعقاب عمليات الزرع ، وعادة ما بين 1 إلى POD POD 7. في تجربتنا ، كتلة هامشية من الجزر الصغيرة عادة ما بين 150 و 250 جزيرة صغيرة الحجم متوسط ​​نصيب المستفيد 20 جرام باستخدام سلالة C57BL / 6 من الفئران. مع نموذج مسانج ، يمكن للمرء استخدام وراثيا او عقاقيري الجزر تعديلها لاختبار ما إذا كان تعديل معين يؤثر على فعالية العلاج من الجزر الصغيرة في مرحلة مبكرة بعد الزرع.

في النماذج خيفي والمناعة الذاتية ، ويتعرض للترقيع للهجوم على جزيرة المناعي المحددة من قبل المضيف على التكيف ، الحصانة ، والذي ينطوي على الخلايا اللمفية تي ، وباء الخلايا اللمفية ، والخلايا المناعية الأخرى. التكيفية - الحصانة هو تأخر الاستجابة المناعية ؛ لفحص هذه الاستجابة ، فإنه من الضروري زرع عدد من الجزر التي تشبع يستعيد normoglycemia بفعالية في مرحلة مبكرة بعد زرع للتقليل من أثر عدم وظيفتها الرئيسية. يمكن للمرء ثم رصد طول الوقت قبل أن يتم رفض هذه الجزر كما يدل على ذلك فقدان normoglycemia لتحديد الآثار المترتبة على أي تعديل من الجزر على رفض الكسب غير المشروع. في تجربتنا ، هناك حاجة أكبر من 300 غرام الجزر في الماوس 20 و 15 إلى 21 يوما هي فترة الرفض لزرع خيفي باستخدام BALB / ج (H - 2 د) والجهات المانحة وC57BL / 6 (H - 2 ب) على النحو المتلقين.

الشكل 1
الشكل 1. تحديد موقع افتتاح الاثنى عشر من القناة الصفراوية المشتركة. الإنزيمات الهضمية الذاتية استنزاف من الكبد والبنكرياس والمرارة تمر عبر القناة الصفراوية المشتركة قبل الدخول إلى الأمعاء في الاثني عشر. يمكن عكس اتجاه تدفق من خلال هذه القناة إذا لم يتم تطبيق الضغط على النظام عن طريق إضافة السائل الخارجية. وهذا سيؤدي في البنكرياس تصبح كاملة ومنتفخة.

الشكل 2
الشكل 2. المشبك افتتاح الاثنى عشر من القناة الصفراوية المشتركة. من أجل ملء البنكرياس مع Liberase ، فمن الضروري لمنع فتح الاثني عشر من القناة الصفراوية المشتركة. إذا لم يتحقق هذا صحيح ، وسوف Liberase ملء الأمعاء بدلا من البنكرياس.

الشكل 3
الشكل 3. تغيير وضع الكبد ضد الحجاب الحاجز يسمح التصور من المنطقة القريبة من القناة الصفراوية المشتركة. لا يمكن أن يتحقق إقناء ؛ إدخال القنية من القناة الصفراوية الأكثر شيوعا بنجاح ، إذا حاولت ذلك قرب نهايته القريبة (عند التقاء على شكل V وصفها في 2.3.1).

الشكل 4
الشكل 4. Cannulating القناة الصفراوية المشتركة من قبل الحرةاليد 'الأسلوب. والتقاء القناة الصفراوية المشتركة يصبح مرئيا عندما يتم سحبها مرقئ التي فرضت على مدى الاثنى عشر في نهاية الخلفي من الماوس. لا يمكن أن يتحقق إقناء ؛ إدخال القنية القناة عن طريق وضع إبرة قياس 27 في هذا التقاء والقيادة من خلال ذلك.

الشكل 5
الشكل 5. Cannulating القناة الصفراوية المشتركة من قبل 'ملقط مساعدة" الأسلوب. كما ورد في النص ، وأحيانا الأنسجة المحيطة فافي القناة يجعل من الصعب يقني ؛ يدخل القنية. (A) في هذه الحالات ، فإنه من المفيد لمسح طبقة الوجه مع إبرة قياس 27. (ب) يمكن أن يكون لاصق ثم تصور واضح ومعتمد من قبل زوج من ملقط الذراع مثنية. (ج) استخدام ملقط باعتبارهم حاجزا وقائيا ، ويمكن إدراج إبرة قياس 27 في قناة لتوصيل Liberase.

الشكل 6
الشكل 6. التوسع حتى في البنكرياس يشير الأمثل موضع الإبرة. نظرا لطبيعة شفافة من القناة والأنسجة المحيطة فافي ، في بعض الحالات ، قد يبدو أنه قد تم مقنى القناة حين أنها في الواقع لم يفعل ذلك. إذا كان هذا يحدث والإبرة تخترق الكبسولة البنكرياس ، فإن المنطقة الإثناعشرية في البنكرياس تبدأ في توسيع عند تسليم Liberase. ومع ذلك ، لن يكون كامل البنكرياس perfused وهذا سوف يؤدي إلى انخفاض العائد جزيرة. لتجنب هذه المشكلة ، ومشاهدة للتوسع حتى في البنكرياس التي تبحث عن علامات على وجه التحديد من دخول المنطقة انزيم البنكرياس التي تعلق على الجزء الأمامي من المعدة.

الشكل 7
الشكل 7. إزالة البنكرياس perfused. لإزالة البنكرياس من الماوس ، لا بد من كسر عدة نقاط اتصال مع الأحشاء. (أ ب) فصل من البنكرياس والامعاء. (ج) فصل البنكرياس من المعدة. (د) فصل من البنكرياس والامعاء. (EF) قطع أي اتصالات مع باقي التجويف البريتوني.

الشكل 8
الشكل 8. صور الممثل من الجزر. ويمكن تقدير نسبة نقاء وجودة الجزر المجهر عند الانتهاء من إجراءات العزل. (أ) في حين كان الهدف هو تنقية الجزر من البنكرياس ، وخلايا وإفرازات الحطام موجودة في بعض الأحيان. (B) ويمكن أن نؤكد من العزلة جزيرة استحثاث موت الخلية التي تتجلى في المناطق الوسطى المظلمة من الجزر وتتمزق من الخلايا من محيط الجزيرة. (C) عند التقاط الجزر للتجربة ، وتجنب التقاط الخلايا الإفرازية تلويث. (D) الفشوت تغيير في المظهر مع الزمن في الثقافة. كما الجزر التعافي من العزلة ، انهم الحصول على سطح أملس الطرفية. أحيانا أكبر الجزر في منطقة وسط الظلام مرئيا. هذه الخلايا وصمة عار إيجابية للموت الخلية.

تكميلية الفيديو 1. المجهري مرور الزمن بعد عزلة الجزر. ويمكن في هذا الفيديو الفاصل الزمني 16hr أن ينظر إلى تطوير مراكز نخرية الجزر التي يتم طردها في نهاية المطاف. الرجاء انقر هنا للحصول على الفيديو .

Discussion

في المقاطع المذكورة أعلاه ، وصفت لنا خطوات تفصيلية من أجل عزل وزرع البنكرياس الجزر الماوس. هنا نسلط الضوء بإيجاز الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح الإجراءات.

1. جزيرة العزلة

الخطوات الرئيسية هي تحديد أمثل الوقت الهضم الأنزيمي (1.4) ، وتحديد المواقع المشبك مرقئ على مدى الاثنى عشر لفتح القناة الصفراوية المشتركة (2.2.3) ، cannulating القناة الصفراوية المشتركة (2.3) ، والهز قوية في البنكرياس بعد ال 37 خلاصة درجة مئوية (3.2) ، وإزالة التلوث الخلايا الإفرازية (3.3.7 و 3.3.16). هذه الخطوات لها تأثير كبير على المحصول وجودة ونقاء من الجزر. ولعل الخطوة الأكثر تحديا تقنيا هو إقناء ؛ إدخال القنية من القناة الصفراوية المشتركة. في الفئران كثيرة ، يمكن أن تكون القناة الصفراوية المشتركة من الصعب تصور ذلك بسبب اللفافة المحيطة بها. ولذلك ، فمن الشائع أن محاولات يقني ؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة نتيجة تغلغل في نسيج اللفافة فقط. في هذه الحالات ، ويبدأ Liberase لملء الأنسجة المحيطة الضام ، ولا يروي البنكرياس. إذا لوحظ هذا ، ووقف تدفق Liberase وإعادة الإبرة بحيث تخترق تجويف القناة الصفراوية. مع الممارسة ، فمن الممكن التعرف بسرعة على الموقف الأمثل لوضع الإبرة واستكمال إقناء ؛ إدخال القنية دون الإضرار قناة قابلة للتفتيت.

2. جزيرة زرع

الخطوات الحاسمة هي تحريض STZ من مرض السكري (5.1) ، والتنفيذ الفعال من الجزر في الحقيبة تحت المحفظة (5.3.14-5.3.16). STZ التماثلية الجلوكوز هو تحدث بصورة طبيعية وغير انتقائي السامة للخلايا إفراز الإنسولين β خلايا الجزر 9. ومع ذلك ، هذا يحدث السمية الانتقائية في مجموعة تركيز ضيق نسبيا. ويتجلى ذلك من خلال حقيقة أن جرعات عالية من STZ يمكن أن يؤدي إلى الفتك (2-3 أيام) السريع في غياب ارتفاع السكر في الدم. ولذلك ، ينبغي توخي الحذر لتحديد الجرعة المثالية من STZ للسلالة وعمر الفئران المستخدمة قبل الشروع في أي تجارب على نطاق واسع. التسليم المادي من الجزر في الحقيبة تحت المحفظة هو أيضا خطوة رئيسية. لتحقيق نتائج متسقة ، لا بد من تقليل الخسائر في الجزر خلال إيصالها. وهذا يمكن أن يحدث إذا كانت هناك عيوب او الدموع في كبسولة الكلى تغطي الحقيبة أو إذا كان حجم حقن كبير جدا. ويمكن تجنب الأضرار التي لحقت كبسولة من خلال التلاعب طيف ودقيق ، وباستخدام الزجاج السلس التحقيق لإعداد الحقيبة تحت المحفظة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصغير حجم الحقن مع إزالة دقيق لطاف في الخطوة 5.3.6.3. إذا تمت إزالة طاف وصولا الى مستوى الجزر الرسوبية ، يوجد عادة أكثر من مساحة كافية في الحقيبة تحت المحفظة إلى مكان 400-500 الجزر. ومع ذلك ، إذا كان حجم الحقن كبير جدا ، والجزر هي أكثر عرضة للتسرب من الحقيبة أثناء عملية الزرع ، المساس استنساخ التجربة.

ضمن هذا البروتوكول ، فمن الممكن تعديل بعض الخطوات وتحقيق النتائج لا تزال مرضية. وتشمل هذه ما يلي : (أ) استخدام انزيم مختلفة لهضم البنكرياس ، (ب) طريقة مختلفة لايصال لانزيم البنكرياس ، (ج) استخدام التدرج المستمر (FSD) Ficoll - الصوديوم ودياتريزوات بدلا من خطوة واحدة Histopaque1077 الكثافة ، و (د) زرع جزيرة إلى أماكن أخرى من subcapsule الكلى.

  1. في هذا البروتوكول ، ويستخدم لإضعاف Liberase الاتصالات خلية خلية داخل البنكرياس. Liberase هي في جوهرها مزيج من تخصيبه بدرجة collagenases التي أثبتت مفيدة في الإفراج عن الجزر من البنكرياس. ومع ذلك ، أقل collagenases المنقى قادرون على تحقيق نتيجة مماثلة. لذلك ، فإنه من الممكن استخدام مختلف الاستعدادات انزيم المتاحة تجاريا لهضم البنكرياس ، طالما هو الأمثل لحالة الهضم لتحقيق جودة عالية جزيرة والمحصول والنقاء.
  2. ومن الممكن أيضا لهضم البنكرياس دون نضح الأقنية من الانزيم. تسليم Liberase عبر القناة الصفراوية المشتركة يسمح التعرض القصوى من المساحة السطحية للانزيم البنكرياس. هذه النتائج في عملية الهضم أكثر من البنكرياس والافراج عن أكبر الجزر سليمة. ومع ذلك ، يمكن استخدام خطوات أخرى لزيادة المساحة السطحية للالبنكرياس لهذا الأنزيم. على سبيل المثال ، يمكن استخدام تنميق البنكرياس قبل تفرخ في Liberase مباشرة أو عن طريق الحقن من خلال الكبسولة Liberase البنكرياس لعزل الجزر. ومع ذلك ، لا توجد طريقة أخرى لتقديم Liberase فعالة كما هو الارواء عن طريق القناة الصفراوية المشتركة. لذا ، ينبغي أن تكون محفوظة الحقن المباشر تنميق أو كملاذ أخير ، في حالة تلف القناة الصفراوية المشتركة وperfusable لا.
  3. طريقة بديلة لفصل الجزر من الخلايا الإفرازية ينطوي علىاستخدام التدرج بدلا من FSD Histopaque1077 10. فصل كفاءة من الجزر من الخلايا الإفرازية في هذا البروتوكول هو في جزء منه نتيجة لكثافة الفرق بين أنواع الخلايا اثنين. Histopaque1077 لديها كثافة من 1.0771 غ / مل عند 25 درجة مئوية. عند هذه الدرجة ، Histopaque هو أكثر كثافة من الجزر ولكن أقل كثافة من الخلايا الإفرازية. لذا ، في إطار قوة الطرد المركزي ، Histopaque1077 الكريات الخلايا الإفرازية ، بينما رفع الجزر إلى السطح. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أي مادة أخرى ذات الكثافة التي يمكن أن الجزر منفصلة من الخلايا الإفرازية في هذه الخطوة والتدرج FSD هي واحدة من هذه المواد.
  4. مع الاحترام لموقع لزرع الجزر ، الكبسولة الكلى المستخدمة في هذا البروتوكول هو واحد من المواقع القليلة ممكن. في حين أن subcapsule الكلى هو الموقع الأكثر شيوعا من زرع في الفئران ، تم العثور على مواقع أخرى لزرع تكون فعالة وأنها تشمل الوريد البابي الكبدي ، والفضاء تحت الشبكية والخصية ، وسادة بربخي الدهون والطحال والبنكرياس وحتى 11-14. كل من هذه المواقع ومزاياها والتحديات. ولذلك ، ينبغي تحديد اختيار موقع لزرع جزيرة من الأسئلة التي وجهت والظروف المحددة للتجارب.

ويعتقد أن الاستراتيجيات التي يمكن التغلب على القيود المفروضة على زرع جزيرة ستعزز بشكل كبير قدرته العلاجية. لذا ، فإن استخدام نموذج الفئران على النحو الذي فصله هذا البروتوكول يوفر نهج جذابة لتحديد مثل هذه الاستراتيجيات.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل RO1 DK064938 (لTH).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 31800-022
Liberase TL Reagent Roche Group 05401020001
Fetal Bovine Serum Reagent GIBCO, by Life Technologies 10437-028
Histopaque1077 Reagent Sigma-Aldrich 10771
Penicillin Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140
Sodium Citrate Reagent Sigma-Aldrich S4641
Streptozotocin Reagent Sigma-Aldrich S-0130
HCl Reagent Fisher Scientific A144-212
Isoflurane Reagent Vedco, Inc. ISOSOL
Glass Capillary Tubes Equipment Fisher Scientific 22362574
Insulin Syringe Equipment BD Biosciences 329461
27 Gauge Syringe Needle Equipment BD Biosciences 305109
Hamilton Syringe #1702 Equipment Fisher Scientific 14813133
10cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 0875712
6cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 07770212
6-0 Suture Equipment Ethicon Inc. 8726H
PE 50 Flexible Tubing Equipment Fisher Scientific NC9083963
5ml Disposable Syringe Equipment BD Biosciences 309603
50ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352098
15ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352097
0.1mm Nylon Mesh Equipment Fisher Scientific 22363549
0.419mm Wire Mesh Equipment Newark Wire Cloth Company 0300241
Water Bath Incubator Equipment Fisher Scientific 15-462-5
Dissecting Microscope Equipment Carl Zeiss, Inc. Stemi SV6
Inverted Microscope Equipment Nikon Instruments TMS
Tissue Culture Incubator Equipment Napco 6300
Dissecting Scissors Equipment Kent Scientific INS14393
McPherson-Vannas Scissors Equipment Kent Scientific INS500260
Curved Forceps Equipment Kent Scientific INS15915
Hemostatic Forceps Equipment Kent Scientific INS 500451
Isoflurane Nebulizer Equipment Smiths Medical ISOTech 4 OHMEDA
Swing Bucket Centrifuge Equipment Dupont – Sorvall RT6000D
Swing Bucket Rotor Equipment Dupont – Sorvall H1000B
pH Meter Equipment Mettler Toledo 09313509
Gel Loading Tips Equipment Fisher Scientific 05408151
p200 Tips Equipment USA Scientific, Inc. 111-0730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Islet transplantation as a treatment for diabetes. J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).
  3. Gangemi, A. Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol. Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).
  4. Zmuda, E. Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model. Diabetologia. , Forthcoming (2010).
  5. Bottino, R. Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment. Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).
  6. Markmann, J. F. The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression. Transplantation. 49, 272-277 (1990).
  7. Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts. Diabetes. 35, 83-88 (1986).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).
  9. Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells. Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).
  10. Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets. Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).
  11. Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts. Transplantation. 43, 747-749 (1987).
  12. Nasr, I. W. Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells. J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).
  13. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).
  14. Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats. Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).

Tags

الطب ، العدد 50 ، جزيرة العزلة ، جزيرة زرع ، والسكري ، الفئران والبنكرياس
وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. … More

Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096, doi:10.3791/2096 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter