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Medicine

Murine आइलेट अलगाव और Subcapsular गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए एक विधि

Published: April 13, 2011 doi: 10.3791/2096
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3
1Molecular and Cellular Biochemistry, Center for Molecular Neurobiology, The Ohio State University, 2Integrated Biomedical Science Graduate Program, The Ohio State University, 3Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

Summary

अलग islets के प्रत्यारोपण के लिए टाइप 1 मधुमेह के लिए एक संभावित उपचार के लिए प्रस्तावित किया गया है. यहाँ हम एक माउस pancreata से islets अलग और उन्हें गुर्दे की subcapsular जगह प्रत्यारोपण विधि का वर्णन.

Abstract

Ballinger और Reckard के प्रारंभिक अग्रणी काम मधुमेह कृन्तकों में Langerhans की islets कि प्रत्यारोपण प्रदर्शन के बाद से उनकी रक्त शर्करा का स्तर मानक के अनुसार कर सकता है, आइलेट प्रत्यारोपण टाइप 1 मधुमेह 1,2 के लिए एक संभावित उपचार के लिए प्रस्तावित किया गया है. हाल ही में, मानव आइलेट प्रत्यारोपण में प्रगति को आगे इस 1,3 दृश्य को मजबूत किया है . हालांकि, एक व्यापक नैदानिक ​​वास्तविकता होने से दो प्रमुख सीमाओं आइलेट प्रत्यारोपण को रोकने: (क) रोगी के प्रति islets, जो गंभीर रूप से संभावित प्राप्तकर्ताओं की संख्या कम कर देता है की बड़ी संख्या के लिए आवश्यकता है, और (ख) भारी प्रतिरक्षादमन के लिए की जरूरत है, जो काफी प्रभावित करता है उनकी लंबी अवधि प्रतिरक्षादमन के लिए जोखिम के कारण रोगियों के बाल चिकित्सा आबादी. रणनीति है कि इन सीमाओं को पार कर सकते हैं आइलेट प्रत्यारोपण के चिकित्सीय उपयोगिता को बढ़ाने की क्षमता है.

आइलेट प्रत्यारोपण माउस गुर्दे कैप्सूल के तहत एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं मॉडल करने के लिए विभिन्न रणनीतियों की जांच आइलेट प्रत्यारोपण में सुधार है. इस प्रयोग के लिए उच्च गुणवत्ता islets और मधुमेह प्राप्तकर्ताओं के लिए islets के आरोपण के अलगाव की आवश्यकता है. दोनों प्रक्रियाओं शल्य चिकित्सा कदम है कि बेहतर पाठ से वीडियो द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम दोनों वीडियो और लिखा प्रोटोकॉल द्वारा इन प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत कदम का दस्तावेज़. हम भी संक्षेप में अलग प्रत्यारोपण मॉडल पर चर्चा: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune और autoimmune allogeneic.

Protocol

1. तैयारी और Liberase अभिकर्मक के अंशांकन

  1. इस प्रोटोकॉल Liberase (Roche, बिल्ली # 05 020 001 401) अग्नाशय के पाचन के लिए एंजाइम TL का इस्तेमाल करता.
  2. एक समय में 100-200mg खरीद और एक बड़ा बैच बनाने. बाँझ HPLC ग्रेड पानी में lyophilized पाउडर इतना है कि एकाग्रता लगभग 26 मिलीलीटर प्रति Wünsch इकाइयों पुनः निलंबित. यह लगभग मिलीग्राम / एमएल 5 होना चाहिए. पैकेज डालने Wünsch विशिष्ट बहुत में निहित इकाइयों पर जानकारी के लिए देखें. नास्तिक व्यक्ति के साथ 30 मिनट घूमता हर कुछ मिनट के लिए बर्फ पर शीशियों प्लेस. जांच करने के लिए सुनिश्चित करें पाउडर पूरी तरह से 30 मिनट के अंत में भंग कर रहा है.
  3. पूल सभी भंग साथ Liberase और घूमता कोमल (भंवर या हिला नहीं करते हैं) के साथ मिश्रण. विभाज्य 24.3 पूर्व ठंडा ट्यूबों Eppendorph, तरल नाइट्रोजन पर जल्दी फ्रीज (यह किसी भी एंजाइमों के रूप में इलाज) और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस Wünsch इकाइयों यह लगभग Eppendorph ट्यूब प्रति 0.935ml होना चाहिए. प्रत्येक विभाज्य एकल उपयोग (11 चूहों के लिए पर्याप्त) के लिए है और नहीं रखना चाहिए या फिर एक बार thawed जमे हुए है. सामान्य में, शेयर कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर है.
  4. प्रत्येक नए बैच के लिए, इष्टतम ऊष्मायन समय जांचना. जमे हुए शेयर, हौसले से भंग शेयर नहीं का प्रयोग करें, अंशांकन के लिए, वास्तविक प्रयोगात्मक शर्तों जितना संभव नकल.
    1. पानी के स्नान है कि आप 37 बिल्कुल का उपयोग करने का इरादा डिग्री सेल्सियस एक पारा थर्मामीटर का उपयोग कर. जांचना भविष्य प्रयोगों में ही इनक्यूबेटर का प्रयोग करें.
    2. पहले का उपयोग करने के लिए, बर्फ पर Liberase की एक ट्यूब गल और 21.6ml सीरम मुक्त RPMI करने के लिए यह (0.935ml) जोड़ने के लिए, अंतिम काम कर रहे एकाग्रता 1.08 मिलीलीटर प्रति Wünsch इकाइयों बनाने. सीरम बास, और EDTA Liberase रोकना. जिंक और कैल्शियम cofactors हैं. बर्फ और 1.5 घंटे के भीतर प्रयोग पर स्टोर. यह लगभग 11 चूहों (2ml/mouse) के लिए पर्याप्त है.
    3. अग्न्याशय छिड़काव के लिए 2.3 कदम. 1 घंटे में संभव के रूप में कई चूहों के रूप में Perfuse. फिर प्रत्येक ऊष्मायन समय और 10 परीक्षण के लिए एक या दो चूहों, 12, 14, 16, 18 मिनट ऊष्मायन बार का उपयोग करें. यदि संभव हो तो, समय के बीच 30 सेकंड के अंतराल में शामिल के रूप में पाचन के समय बहुत महत्वपूर्ण है.
    4. आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल को पूरा करें और प्रत्येक ऊष्मायन समय बिंदु से आइलेट उपज और गुणवत्ता का विश्लेषण. अंततः उपज पीक समय के बीच बहुत ज्यादा नहीं बदल, लेकिन उन अंतराल पर islets की गुणवत्ता में भिन्न हो सकते हैं चाहिए. बाद के प्रयोगों के लिए, islets कि इस अलगाव के बाद स्वस्थ 48 घंटे की सबसे बड़ी संख्या में परिणाम है कि शर्तों का उपयोग करें. चूहों की उम्र के लिए इष्टतम ऊष्मायन समय प्रभावित होता है. तो, एक समान उम्र सीमा के भीतर चूहों का उपयोग करें. आदर्श रूप में, 8-12 सप्ताह पुराने चूहों का प्रयोग, तथापि, 8-10 भी महीने पुराने चूहों अच्छा islets उपज कर सकते हैं. अंशांकन प्रयोजनों के लिए, छोटे चूहों का उपयोग करें.

2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया

  1. आइलेट दाता चूहों euthanizing से पहले सभी उपकरणों और मीडिया तैयार करें.
    1. आटोक्लेव या लौ उपयोग से पहले उपकरणों बाँझ. सभी अभिकर्मकों और उपकरणों (नमूने छू) बाँझ होना चाहिए. अलगाव और islets के हाथ उठा बहुत संदूषण की घटनाओं में वृद्धि के बिना एक लामिना का प्रवाह हुड के बाहर प्रदर्शन किया जा सकता है है. हालांकि, उपकरण है कि अग्न्याशय या islets के साथ संपर्क में आने के बंध्याकरण के संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. निम्नलिखित उपकरण की जरूरत है:
      • पेट चीरा के लिए कैंची विदारक की 1 जोड़ी.
      • संदंश के दो जोड़े.
      • 1 hemostatic के लिए रवाना पित्त नली दबाना संदंश.
      • 0.419 मिमी व्यास के तार जाल.
      • 0.1 मिमी व्यास नायलॉन जाल.
    2. बेंड कई 27 गेज सुई इतनी है कि एक 70 डिग्री के कोण लगभग आधे रास्ते नीचे सुई की लंबाई शुरू की है. सुई के beveled बढ़त कोहनी के अंदर का सामना करना चाहिए.
    3. 70% इथेनॉल के साथ एक स्प्रे बोतल भरें.
    4. एक प्रयोगशाला बेंच पर या एक हुड में एक पर्याप्त प्रकाश स्रोत के साथ एक खुर्दबीन विदारक सेट करें.
    5. पूर्व ठंड डिग्री सेल्सियस 4 अपकेंद्रित्र एक स्विंग बाल्टी रोटर अपकेंद्रित्र है, 900xG के लिए सक्षम होना चाहिए, प्रशीतित हो, और एक को तोड़ने कि ख़ाली किया जा सकता है. Sorvall H1000B रोटर के साथ RT6000D Sorvall में, एक 900xG गति 2400RPM है. धीमी spins 800RPM पर किया जाता है.
    6. बर्फ पर निम्नलिखित अभिकर्मकों रखें.
      • RPMI (10% सीरम के साथ 1 लीटर)
      • RPMI (सीरम के बिना 200ml)
      • 50ml शंक्वाकार ट्यूबों (प्रत्येक अग्न्याशय के लिए एक)
      • 5ml सिरिंज.
    7. कमरा Tempe Histopaque1077 संतुलित करनाrature.
    8. बर्फ पर कैलिब्रेटेड Liberase के एक एकल उपयोग विभाज्य पहले गला लें और 22.5ml सीरम मुक्त RPMI में जलमिश्रित. सीरम बास, और EDTA Liberase रोकना. जिंक और कैल्शियम cofactors हैं. बर्फ और 1.5 घंटे के भीतर प्रयोग पर स्टोर. यह लगभग 11 चूहों (2ml/mouse) के लिए पर्याप्त है.
    9. गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान.
    10. कई चूहों के रूप में हाथ पर क्या है के रूप में आप 1 घंटे (लगभग 10 - 18 चूहों) में cannulate कर सकते हैं.
  2. Cannulation के लिए माउस को तैयार हैं. पहले गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस euthanize. जबकि माउस अवसान हो रहा है, 2ml Liberase काम कर रहे शेयर (1.08 Wünsch इकाइयों / एमएल) के साथ 5ml सिरिंज भरें.
    1. विदारक गुंजाइश पर एक कागज तौलिया और 70% इथेनॉल के साथ चीरा जघन क्षेत्र से एक वी के साथ दोनों के सामने पैरों को अपने पेट खोलने से पहले पेट स्प्रे पर लापरवाह स्थिति में रखें माउस. उदर गुहा प्रकट करने के लिए छाती पर मोड़ो त्वचा.
    2. आप की ओर इशारा करते हुए सिर के साथ माउस स्थिति. आम पित्त के रूप में Fig.1 में प्रकाश डाला वाहिनी के ग्रहणी प्रविष्टि का पता लगाएँ. यह विदारक गुंजाइश उद्देश्य के माध्यम से देख के बिना किया जा सकता है.
    3. Hemostat साथ ग्रहणी खोलने के रूप Fig.2 में प्रदर्शन दबाना. क्लैंप स्थिति आंतों में Liberase के प्रवाह को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि दबाना बहुत अधिक या बहुत कम है, Liberase अग्न्याशय perfuse नहीं होगा. स्थिति hemostat, ताकि जब संकुचित, यह बिल्कुल आवासी / अग्नाशय आंत साथ चलाता है.
  3. आम पित्त नली cannulating से पहले, यह आवश्यक हो सकता है इसे दबाने डायाफ्राम के खिलाफ है, ताकि आम पित्त नली की पूरी लंबाई (FIG.3) अवगत कराया है द्वारा जिगर reposition सकता है. एक बार जब पित्त नली की लंबाई उजागर, तुला 27-gague cannulation लिए Liberase भर सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग करें. पित्त नली cannulating के लिए दो तकनीकों हैं.
    1. पहली तकनीक या विधि 'मुफ्त हाथ' में hemostat clamped पर ग्रहणी पूंछ की ओर माउस के सिर से दूर खींच लिया है इतना है कि आम पित्त नली तना हुआ हो जाता है. पित्त जिगर जहां पित्त पित्ताशय और जिगर से एंजाइमों आंतों में प्रवेश करने से पहले एक साथ आ से draining वाहिनी पास में एक संगम है. इस संगम द्वारा गठित वी के अंदर खींच पित्त तंग वाहिनी द्वारा अवगत कराया है और डक्ट (FIG.4) cannulation आरंभ करने के लिए एक आदर्श जगह है. यदि सही ढंग से तैनात है, सुई सही वी के माध्यम से स्लाइड, और सीधे वाहिनी के निचले हिस्से cannulate. वाहिनी में Liberase वितरण से पहले सुई कई मिलीमीटर डालें. जिगर और पित्ताशय में backflow को रोकने के इष्टतम सुई स्थान महत्वपूर्ण है. इसके अलावा में, यह महत्वपूर्ण है कि सुई डाला जा नहीं इतनी दूर है कि यह प्लीहा - संबंधी वाहिनी भी नुकसान पहुँचा है. प्लीहा - संबंधी वाहिनी एक मुश्किल है आम पित्त नली की शाखा देखने के लिए और अग्न्याशय, एक आइलेट समृद्ध क्षेत्र के प्लीहा - संबंधी पूंछ नालियों. यदि सुई प्लीहा - संबंधी वाहिनी के लिए खोलने पिछले स्लाइड, प्लीहा - संबंधी पूंछ की पूरी छिड़काव और इस क्षेत्र के संभावित कम पाचन से भी कम हो जाएगा. इष्टतम आइलेट उपज होती है जब आपके सुई गहराई तक पर्याप्त है कि कोई Liberase मूत्राशय / जिगर पित्त बच नहीं है लेकिन इतनी दूर है कि आप प्लीहा - संबंधी वाहिनी पारित किया है. आप सफल cannulation लिए Liberase की एक छोटी राशि वितरण का परीक्षण कर सकते हैं. यदि आप वाहिनी भरने Liberase देखते हैं तो बाकी 2mls के बग़ैर. यदि वाहिनी के आसपास के क्षेत्र को भरने के लिए शुरू होता है, वितरण बंद करो, सुई reposition, और फिर कोशिश करें.
    2. दूसरी तकनीक, या 'संदंश सहायता' विधि में, hemostat ग्रहणी पर clamped है पूंछ की ओर माउस के सिर से दूर खींच इतना है कि आम पित्त नली तना हुआ हो जाता है. फिर, तुला 27-gague सुई 5ml सिरिंज से जुड़ी, पंचर आम वाहिनी पित्त जिगर को करीब से नीचे प्रावरणी का उपयोग. वाहिनी (FIG.5) से प्रावरणी स्पष्ट सुई का प्रयोग करें. अभी भी जगह में सुई के साथ, hemostat नीचे सेट और संदंश की एक जोड़ी लेने. खुला संदंश के एक हाथ का प्रयोग पित्त नली जहां सुई प्रावरणी मंजूरी दे दी है लिफ्ट. संदंश में लकीरें एक पथ है कि आप वाहिनी में सुई गाइड का उपयोग कर सकते हैं बनाएँ. हालांकि आप की ओर खींच वाहिनी और संदंश, एक backstop रूप संदंश का उपयोग वाहिनी में सुई स्लाइड. Cannulation के लिए Liberase की एक छोटी राशि के वितरण से टेस्ट. यदि वाहिनी (FIG.5 एरो) को भरने के लिए शुरू होता है, 2mls के बाकी बग़ैर. यदि वाहिनी के आसपास के क्षेत्र को भरने के लिए शुरू होता है, वितरण बंद करो, सुई reposition और फिर कोशिश करें.
  4. के रूप में Liberase की 2mls अग्न्याशय, निकट क्षेत्र ग्रहणी के लिए पहली विस्तार, पेट के शीर्ष पर इस क्षेत्र है, और अंत में प्लीहा - संबंधी पूंछ (FIG.6) द्वारा पीछा शुरू होता है भरता है. अग्न्याशय का भी विस्तार (FIG.6 के लिए देखो). यदि एक क्षेत्र का विस्तार करने के लिए शुरू होता है और आप सफेद ऊतक समान रूप से विस्तार और बाहर फैल नहीं देखते हैं, यह संभावना है कि आम पित्त नली cannulated नहीं किया गया है, अभी तक सुई अग्नाशय के कैप्सूल के अंदर है. Liberase साथ कैप्सूल भरना एक उच्च आइलेट उपज में परिणाम नहीं एंजाइम को उजागर सतह क्षेत्र के रूप में कम हो जाएगा. यदि ऐसा होता है, छिड़काव बंद करो और सुई reposition.
  5. एक बार अग्न्याशय perfused किया गया है, यह इसे खींच आंतों, पेट और प्लीहा के साथ संपर्क के अंक से मुक्त करके माउस से हटा दिया जा सकता है. ग्रहणी से hemostat को हटाने के द्वारा शुरू करो. फिर, संदंश का उपयोग करने के लिए ग्रहणी लिफ्ट और आंतों से संदंश (FIG.7A बी) के एक दूसरी जोड़ी के साथ अग्न्याशय अलग. यह संदंश की दूसरी जोड़ी स्थिर जबकि आंतों के पेट से बाहर खींच द्वारा किया जाता है. अगले, पेट के ऊपर और तिल्ली (FIG.7C डी) से मुक्त अग्न्याशय खींच. अंत में, लिफ्ट अग्न्याशय पेट के बाहर और यह शेष प्रावरणी कनेक्शन (FIG.7E एफ) से मुक्त कटौती.
  6. एक 50ml शंक्वाकार ट्यूब में अग्न्याशय प्लेस और यह बर्फ पर छोड़ जबकि अन्य चूहों पर काम कर रहे हैं. 1 घंटे टाइमर शुरू करो. उपज के लिए अधिक से अधिक आइलेट, प्रत्येक ट्यूब में केवल 1 अग्न्याशय जगह है. यह अधिक से अधिक 1 घंटे के लिए बर्फ पर perfused pancreata छोड़ अनुशंसित नहीं है, के रूप में Liberase ऊतक नीचा करने के लिए शुरू हो जाएगा. घंटे के अंत में, तुरंत 3.0 सभी pancreata है कि perfused थे के लिए कदम चाल है.
  7. 2.3 चरणों को दोहराएँ - शेष चूहों के लिए 2.6 या जब तक 1hour टाइमर 2.6 चरण में शुरू की अवधि समाप्त हो चुकी है.

3. Perfused Pancreata से शुद्ध Islets

  1. इससे पहले islets अग्न्याशय से शुद्ध किया जा सकता है है, ऊतक 37 में पचा होना चाहिए डिग्री सेल्सियस समूह 50ml एक खुला नीचे रैक कि 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फिट बैठता है में perfused islets असर ट्यूबों. सुनिश्चित करें कि सभी टोपियां और अच्छी तरह से सुरक्षित हैं समय की सटीक राशि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डूब ट्यूबों Liberase के मौजूदा बैच के लिए पूर्व निर्धारित (1.4 कदम देखें). ऊष्मायन अंत में, बर्फ के लिए ट्यूबों को ले जाने के लिए और 10% ट्यूब प्रति 20mls के लिए सीरम के साथ RPMI1640 जोड़ने. सीरम युक्त मीडिया Liberase पाचन बंद हो जाएगा.
  2. ट्यूबों सख्ती 10 सेकंड में 40 बार मिलाते द्वारा ऊतक अलग. इस कदम islets के इष्टतम वसूली के लिए महत्वपूर्ण है. यहां तक ​​कि इष्टतम Liberase छिड़काव और कसकर कैलिब्रेटेड पाचन समय के साथ, आइलेट उपज कम हो सकता है अगर ऊतकों को नहीं तोड़ा है. इस चरण में नमूने के आक्रामक से निपटने के लिए माउस islets के नुकसान प्रकट नहीं होता और उन्हें exocrine सेल समूहों से मुक्त करने के लिए आवश्यक है.
  3. पचा अग्न्याशय से अलग islets के लिए, निम्न चरणों को पूरा.
    1. पूल pancreata पचा इतना है कि वहाँ ट्यूब प्रति लगभग 2.5 pancreata हैं. ऐसा करने में, दस ट्यूब प्रत्येक मीडिया के 50mls के साथ 4 ट्यूबों को गाढ़ा हो जाएगा.
    2. 800RPM और 4 में 2 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र ° सी.
    3. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और 10% FBS के साथ 15 25mls मीडिया में धीरे से कई सेकंड के लिए (लगभग 50 प्रतिशत अधिकतम भंवर तीव्रता को समायोजित) vortexing छर्रों resuspend.
    4. 0.419mm तार जाल के माध्यम से resuspended घोल डालो और एक ताजा 50ml शंक्वाकार ट्यूब में कीप. यह ऊतक गैर पचा वसा, और लसीका अलग है. 10% FBS और तार जाल के माध्यम से डालना युक्त मीडिया के एक अतिरिक्त 10mls के साथ प्रारंभिक ट्यूब कुल्ला. शेष ट्यूबों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
    5. 800RPM और 4 में 2 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र ° सी.
    6. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और ध्यान से एक कागज तौलिया पर ट्यूबों पलटना. यकीन है कि islets बंद नहीं स्लाइड बनाने के लिए देखो. अवशिष्ट मीडिया को हटाने के लिए एक कागज तौलिया के साथ ट्यूबों के अंदर पोछो, सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. एक ईमानदार स्थिति ट्यूबों लौटें.
    7. कई सेकंड के लिए धीरे vortexing से कमरे histopaque1077 तापमान के 5mls में छर्रों Resuspend. सुनिश्चित करें कि निलंबन histopaque की ट्यूब के अंदर चारों ओर एक अतिरिक्त 5mls जोड़ने से पहले सजातीय है. इस ट्यूब की दीवार बंद islets washes.
    8. ओवरले के साथ सीरम मुक्त RPMI के 10mls histopaque, histopaque और मीडिया के बीच एक तेज इंटरफ़ेस बनाए रखने के लिए सावधान किया जा रहा है. 1ml प्रति 10 सेकंड की दर पर ट्यूब की ओर धीरे धीरे नीचे pipetting द्वारा मीडिया जोड़ें. मीडिया के शीर्ष पर होना चाहिए, और तल पर histopaque. सीरम मीडिया के घनत्व को प्रभावित करता है और इस कदम के दौरान नहीं किया जाना चाहिए.
    9. एक अपकेंद्रित्र equilibrated में नमूने स्पिन 20 ° 2400RPM (900xG) के त्वरण के साथ बहुत धीमी गति से 20 मिनट और कोई ब्रेक लगाना के लिए सी. यह कदम exocrine कोशिकाओं से islets अलग. islets के सीरम मुक्त मीडिया और Histopaque के बीच इंटरफेस करने के लिए ओर पलायन जबकि वाई exocrine कोशिकाओंट्यूब के नीचे एक गोली फार्म करूँगा.
    10. एक डिस्पोजेबल 10ml सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ इंटरफेस / histopaque मीडिया से islets ले लीजिए. Islets कांच के लिए छड़ी जाएगा, इसलिए जब तक वे siliconized किया गया है कांच pipettes नहीं किया जाना चाहिए. एक ताजा 50ml शंक्वाकार ट्यूब में islets रखें. कई ट्यूबों इस बिंदु पर जमा किया जा सकता है है. 50ml के लिए सीरम युक्त RPMI साथ ट्यूबों भरें.
    11. 800RPM और 4 में 2 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र ° सी.
    12. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और धीरे vortexing द्वारा सीरम युक्त RPMI के 50mls में islets resuspend.
    13. 800RPM और 4 पर 90 सेकंड के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र ° सी.
    14. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और 1 अधिक समय धो दोहराने.
    15. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और टिशू कल्चर हुड ट्यूबों ले. RPMI कलम / strep जोड़ें 1% की एक अंतिम एकाग्रता आइलेट संस्कृति मीडिया बनाने के लिए 10% FBS युक्त. इस संस्कृति मीडिया के 5mls में islets Resuspend.
    16. एक 0.1mm नायलॉन सेल झरनी उलटें और यह एक 15ml शंक्वाकार ट्यूब पर जगह है. धीरे धीरे झरनी के माध्यम से resuspended आइलेट घोल गुजरती हैं. जबकि 15ml शंक्वाकार ट्यूब में exocrine कोशिकाओं के माध्यम से पारित islets झरनी द्वारा बनाए रखा जाएगा. यह कदम नाटकीय रूप से exocrine सेल संदूषण के लिए सम्मान के साथ प्रोटोकॉल के अंत में islets की शुद्धता बढ़ जाती है.
    17. मीडिया के एक अतिरिक्त 6mls साथ 50ml शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला और यह झरनी के माध्यम से विंदुक.
    18. प्लेस 3mls संस्कृति मीडिया के एक 10 सेमी पेट्री डिश में एक बड़ी गिरावट के रूप में. सेल झरनी दाईं ओर उलटें, ताकि islets पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया सतह मीडिया ड्रॉप में डूबा जा सकता है. मीडिया के लिए फ़िल्टर मार्मिक islets की एक गैर ऊतक इलाज संस्कृति पेट्री डिश में सबसे स्थानांतरण होगा. एक गैर इलाज पेट्री डिश का उपयोग आइलेट आसंजन और प्लेट की सतह के लिए प्रसार से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. फ्री फ्लोटिंग islets और अधिक आसानी से प्रयोगात्मक समूहों में अलग होने के लिए चुना जाता है.
    19. झरनी के माध्यम से एक अतिरिक्त संस्कृति मीडिया के 5 7mls पेट्री डिश में किसी भी अवशिष्ट islets धोने के लिए रवाना हो झरनी के पकवान में पिपेट.
    20. आइलेट और एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 4x उद्देश्य के तहत उपज की गुणवत्ता की जाँच करें. एक तंग अंडाकार में पकवान घूमता पकवान की केंद्र में islets एकत्रित करेगा. यदि islets अच्छे लग रहे हैं, वे या तो प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तुरंत कर सकते हैं उठाया जा या 4-6 10cm पेट्री प्लेट (10 चूहों प्रति) के बीच समान रूप से अलग है. संवर्धन एक ही थाली में भी कई islets islets परिगलित और नीचा बनने का कारण बनता है. प्रयोगों के लिए, मीडिया के 2 - 3mls के साथ 6cm पकवान प्रति 250-300 islets islets तनाव प्रकट नहीं होता है.
    21. 15ml शंक्वाकार कि ट्यूब के माध्यम से एकत्र 0.1mm नायलॉन सेल झरनी प्रवाह में कुछ प्रयोग करने योग्य islets जाएगा. इन islets के गुरुत्वाकर्षण अवसादन के तीन से चार राउंड के बाद बरामद किया जा सकता है. अवसादन के लगभग 4 मिनट के बाद, सभी aspirate लेकिन ट्यूब और संस्कृति मीडिया के साथ शीर्ष करने के लिए इसे फिर से भरना से लगभग मीडिया के 1ml. ट्यूब कैप और मिश्रण पलटना. इस प्रक्रिया में कई बार दोहरा एकल कक्ष exocrine कोशिकाओं है कि तलछट के लिए धीमी गति से कर रहे हैं के कई को हटा, और endocrine (islets) कोशिकाओं है कि जल्दी सिंक की भारी समुच्चय enriches. अंतिम आकांक्षा के बाद, संस्कृति मीडिया और एक ताजा पेट्री डिश में थाली के 7mls में resuspend.

4. पृथक Islets के साथ कार्य करना

  1. अलगाव की प्रक्रिया islets पर काफी तनावपूर्ण है, histopaque विषाक्त मिलाते और centrifugation कदम सरासर तनाव पैदा करने के लिए, और मेजबान रक्त की आपूर्ति के रूप में अच्छी तरह से हटाने के रूप में इन विट्रो संस्कृति में hypoxia प्रेरित कर सकते हैं. हम और दूसरों से पता चला है कि अलगाव बीटा कोशिका मृत्यु 4-5 लाती है. इन तनाव से प्रभाव आइलेट की परिधि से कोशिकाओं के sloughing और darkening और आइलेट (केंद्रीय परिगलन) के केंद्रीय कोर के निष्कासन के द्वारा देखा जाता है. जबकि परिधि से कोशिकाओं के sloughing सहन किया जा सकता है, आइलेट के केंद्रीय परिगलन यह प्रयोगों में उपयोग के लिए disqualifies. आमतौर पर, बड़े आइलेट, अधिक से अधिक मौका है कि केंद्रीय परिगलन एक समस्या हो जाएगी. आइलेट पोस्ट अलगाव तनाव प्रतिक्रिया को कम करने के उद्देश्य से प्रयास प्रयोज्य islets की उपज में वृद्धि होगी.
  2. इसलिए, हम 6-8 अलगाव के बाद पहले 48-72 घंटे के लिए 22-27 ° C टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में islets incubating के पहले की रिपोर्ट तकनीक का उपयोग करें. यह कम तापमान islets के तनाव प्रतिक्रिया dampens है और इन विट्रो संस्कृति में अपने संक्रमण smooths . यदि 22-27 ° C टिशू कल्चर इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, यह बंद गर्मी नियंत्रण मोड़ और लगभग 20 £ रखने द्वारा एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वांछित तापमान रेंज को प्राप्त करने के लिए संभव हैफ्रीजर -80 के लिए ईंटों equilibrated ° सी. इनक्यूबेटर में लगभग कम तापमान के 16 24hours में यह परिणाम है. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर ईंटों के रूप में की जरूरत बदलें. हम 72hrs की तुलना में यह कम अब तापमान में ऊष्मायन से एक अतिरिक्त लाभ नहीं मनाया गया है.
  3. कम तापमान ऊष्मायन इसके अलावा, हम अलगाव के बाद मीडिया 24-48 घंटे बदलने की सलाह देते हैं. पर बल दिया और मृत islets से secreted कारकों मीडिया निम्नलिखित अलगाव में जमा और अतिरिक्त आइलेट तनाव को बढ़ावा कर सकते हैं. मीडिया को बदलने के लिए, निम्न चरणों को पूरा करें.
    1. पेट्री डिश से मीडिया और islets एक 15ml शंक्वाकार एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर ट्यूब स्थानांतरण.
    2. संस्कृति मीडिया के एक अतिरिक्त 3mls के साथ थाली धो अवशिष्ट islets इकट्ठा.
    3. 15ml शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए इस अतिरिक्त 3mls जोड़ें और 5min के लिए गुरुत्वाकर्षण तलछट को islets की अनुमति.
    4. लेकिन सभी 15ml शंक्वाकार ट्यूब से मीडिया के 1ml Aspirate, तो आइलेट संस्कृति मीडिया के 4mls में islets resuspend.
    5. एक ताजा पेट्री प्लेट islets और मीडिया स्थानांतरण. किसी भी अवशिष्ट islets इकट्ठा और पेट्री थाली करने के लिए इस जोड़ने 15ml शंक्वाकार ट्यूब संस्कृति मीडिया के एक अतिरिक्त 3mls जोड़ें.
    6. आइलेट मीडिया हर तीन से पाँच दिनों उसके बाद बदलें.
  4. जब एक प्रयोग के लिए islets उठा, यह विभिन्न isolations से islets के मिश्रण की सिफारिश नहीं है. islets के आणविक आधारभूत कई बातों से प्रभावित होता है समय की राशि और वे संस्कृति में किया गया है अलगाव तनाव है कि प्रस्तुत करने के लिए प्रस्तुत करने से बदलता है. परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, आइलेट प्रयोगों islets कि एक ही समय में अलग थे पर निष्पादित किया जाना चाहिए. हालांकि, अगर यह संभव नहीं है, हम दृढ़ता से एक एकल समूह में सभी islets pooling सुझाव है पहले उन्हें प्रयोगों के लिए उठा. प्रयोगों के लिए islets लेने के लिए, निम्न चरणों को पूरा करें.
    1. यदि islets के एक से अधिक पकवान, पूल सभी islets में एक ही डिश में कदम 4.3.1 4.3.5 ऊपर सूचीबद्ध के माध्यम से पालन करके incubating रहे हैं. यदि islets के कई व्यंजन शामिल हैं, एक 50ml शंक्वाकार ट्यूब 15ml ट्यूब के बजाय किया जाना चाहिए. इस वसूली के बाद अलगाव की अवधि के दौरान प्लेटों के बीच संस्कृति की स्थिति में सूक्ष्म अंतर द्वारा प्रेरित परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं.
    2. Islets के गुरुत्वाकर्षण तलछट के दौरान, एक 4x या 10x उद्देश्य के साथ एक औंधा सुसज्जित खुर्दबीन सेट. P200 micropipette और बाँझ P200 सुझावों की एक बॉक्स लीजिए.
    3. एक एकल थाली sedimented islets के स्थानांतरण और माइक्रोस्कोप के लिए थाली ले जाने. भंवर थाली केंद्र में islets के इकट्ठा करने के लिए. थाली करने के लिए ढक्कन हटाएँ और विंदुक P200 उपयोग करने के लिए स्वस्थ islets लेने. स्वस्थ islets चिकनी boarders और कोई अंधेरे केंद्र क्षेत्रों (चित्रा 8) है. आइलेट आकार के रूप में उपचार के जवाब में परिवर्तन कर सकते हैं प्रयोगात्मक व्यंजन भर में एक आइलेट आकार का भी वितरण को बनाए रखने की कोशिश करें.
    4. प्रति प्रायोगिक समूह islets की संख्या प्रयोग की जरूरतों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हम अनुमान है कि एक छोटा सा व्दीप लगभग 1000-2000 कोशिकाओं और प्रोटीन और कुल शाही सेना के 25ng के 0.3-1μg निकलेगा. इन विट्रो assays में के लिए, एक ठेठ प्रयोगात्मक समूह 35 मिमी या 6cm व्यंजन में 100 और 250 के बीच islets मढ़वाया 3ml - 1 मीडिया के साथ किया जा सकता है. प्रत्यारोपण के लिए, प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस 150 और 400 के बीच प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है (5.2.2 अधिक जानकारी के लिए और कदम चर्चा देखें) islets की आवश्यकता होगी.
    5. हाथ उठा प्रक्रिया द्वारा शुरू की विविधताओं को कम करने के लिए, हम आइलेट आकार का अनुमान के लिए एक गाइड के रूप में P200 - विंदुक टिप के छिद्र का उपयोग करें. अधिकांश टापू एक छिद्र व्यास का लगभग आधा व्यास है, और हम उनमें से प्रत्येक के रूप में एक मानक आइलेट गिनती. कोई टापू है कि अधिक से बड़ा या छोटे, हम एक अलग आइलेट गिनती के अनुसार असाइन. हम 20-50 के बैच में islets इकट्ठा करने और उन्हें नामित प्रयोगात्मक व्यंजन करने के लिए स्थानांतरण. यदि P200 विंदुक 180 microliters की मात्रा पर सेट है, एक एक टिप में कई islets के (आमतौर पर 50 से अधिक islets) जमा कर सकते हैं. इस प्रकार, भले ही islets के एक एक समय में उठाया जाता है, एक pipetman रिलीज तंत्र को नियंत्रित द्वारा प्रत्येक P200 - टिप के भीतर कई islets के जमा कर सकते हैं. यह सैकड़ों उठा या और भी अधिक प्रयोगों के लिए आवश्यक islets की एक हजार की तुलना की सुविधा है. हम भी इस बैच वार आपरेशन का उपयोग करने के लिए इसी तरह की गुणवत्ता और आकार के साथ islets के वितरण के बाहर भी मदद.

5. Subcapsular गुर्दा आइलेट प्रत्यारोपण

  1. प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में मधुमेह प्रेरित.
    1. 4 से 6 घंटे के उपवास पर रखें चूहों. इष्टतम प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के बीच 6 से 10 सप्ताह पुरानी हो सकता है और तेजी के समय में 20 से 25 ग्राम वजन चाहिए. तेजी से चूहों, feedi से खाना हटायेंएनजी रैक और हमेशा एक ताजा पिंजरे में चूहों की जगह. यह भोजन के किसी भी अवशिष्ट बिट्स कि पहले अपने पिंजरे में गिर सकता है से अलग चूहों द्वारा एक सच्चे तेजी से सुनिश्चित करता है. योजना के लिए 80 से चूहों के 90% के लिए मधुमेह के बनने के लिए.
    2. तेजी में तीन घंटे, सोडियम साइट्रेट बफर तैयार करते हैं. एंजाइम ग्रेड सोडियम साइट्रेट की 0.735g वजन (ना साइट्रेट, श्री 294.10 छ / mol) और यह बाँझ विआयनीकृत जल के 25mls में भंग. पीएच 4.5 एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित करें. इस बफर प्रयोगों के प्रत्येक दौर के लिए नए सिरे से किया जाना चाहिए.
    3. (STZ, एम आर 265.2 छ / mol) एक 1.5ml Eppendorph ट्यूब में प्लेस 0.05g Streptozotocin. यह राशि लगभग 8 चूहों में मधुमेह प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. इंजेक्शन जा चूहों की संख्या के लिए 1.5ml ट्यूबों के एक पर्याप्त संख्या में तैयार करें. STZ संवेदनशील प्रकाश है, तो प्रत्येक ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
    4. तेजी के 4 घंटे के बाद, 1ml हौसले ना बफर साइट्रेट बनाया STZ की एक ट्यूब resuspend. एक बार resuspended, साइट्रेट STZ ना समाधान 15 से 20 मिनट के भीतर गतिविधि खो देता है, तो यह कदम केवल चूहों को इंजेक्शन के तुरंत पहले किया जाना चाहिए.
    5. साइट्रेट STZ ना समाधान का एक उचित मात्रा के साथ प्रत्येक माउस intraperitoneally इंजेक्षन माउस 190mg/kg की अंतिम खुराक प्राप्त करने के लिए. इस खुराक तनाव और माउस की उम्र से भिन्न हो सकते हैं, इसलिए यह आवश्यक हो सकता है यदि मधुमेह की घटनाओं में एक खुराक अनुकूलन प्रदर्शन बहुत कम है या अगर बहुत सारे चूहों निम्नलिखित इंजेक्शन 3 से 5 दिनों में मर रहे हैं हो सकता है. आम खुराक 250mg/kg माउस माउस 150mg/kg से रेंज इस्तेमाल किया.
    6. भोजन और पानी की आपूर्ति एक बार सभी चूहों अंतःक्षिप्त किया गया है.
    7. गैर उपवास hyperglycemia के लिए टेस्ट चूहों इंजेक्शन के बाद 2 से 4 दिन (350mg/kg>). चूहों कि गैर - उपवास hyperglycemia के लगातार 3 दिनों दिखाना प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. प्रत्यारोपण के लिए तैयार islets
    1. पृथक islets के रूप में 2.0 चरणों में ऊपर 4.0 के माध्यम से वर्णित है. यदि आवश्यक हो, islets के प्रत्यारोपण के या इससे पहले दिन पर अलग किया जा सकता है.
    2. प्रत्यारोपण के लिए समूहों में उन्हें बाँझ 1.5ml Eppendorph ट्यूब में रखकर islets उठाओ. बर्फ पर ट्यूबों रखें. normoglycemia बहाल करने की जरूरत islets की संख्या प्रयोग (आइलेट दाता तनाव, वजन और प्राप्तकर्ता के तनाव, और किसी भी अतिरिक्त प्राप्तकर्ता को दी उपचार) और व्यक्ति जो islets उठा रहा है की स्थिति को देखते हुए भिन्न हो सकते हैं. प्राप्तकर्ता माउस के आकार के एक प्रमुख चर है कि न्यूनतम आइलेट संख्या को प्रभावित करती है, के रूप में बड़े चूहों अधिक islets की आवश्यकता होगी है. हम लगातार पाते हैं कि 150 से 250 islets केवल मामूली normoglycemia पुनर्स्थापित जबकि 300 या अधिक islets के एक 18 में उपचारात्मक C57BL / 6 प्राप्तकर्ता माउस 20gram. इन प्रयोगों में, आइलेट दाता चूहों या तो C57BL 6 / / या Balb सी.
  3. Subcapsular गुर्दे की थैली के लिए प्रत्यारोपण islets
    1. निम्नलिखित सामग्री इकट्ठा (सभी सर्जिकल उपकरणों निष्फल होना चाहिए):

      तालिका 1. प्रत्यारोपण के लिए उपकरण
      25μl हैमिल्टन सिरिंज पीई 50 लचीला टयूबिंग के 6 काट तो एक तरफ beveled है
      जेल लोड हो रहा है और P200 विंदुक युक्तियाँ बाँझ Eppendorph ट्यूबों (1 प्राप्तकर्ता प्रति)
      Isoflurane और Isoflurane vaporizer Eppendorph ट्यूब रैक
      McPherson - Vannas कैंची (1) तुला हाथ संदंश (2)
      Hemostats (1) क्लिप के साथ घाव क्लिप
      27 गेज सुई ज्वाला गिलास केशिका ट्यूब जांच खींच लिया *
      कपास applicators इत्तला दे दी बाँझ पीबीएस के 50ml शंक्वाकार ट्यूब
      Sutures इलेक्ट्रिक कैंची
      70% इथेनॉल स्प्रे बोतल गेंद बिंदु कलम
      Betadine स्पष्ट प्लास्टिक बाँझ टांगना


      * नोट: जब इन जांच की तैयारी, जांच है कि माउस गुर्दे के कोण mimics में एक चाप बनाने का प्रयास. इसके अलावा, यह सुनिश्चित है कि जांच के अंत पर्याप्त है तो पॉलिश flamed कि कोई तेज किनारों मौजूद.
    2. सभी मधुमेह प्राप्तकर्ता चूहों वजन और टैग. पहले प्रत्यारोपण एक प्रयोगात्मक समूह ताकि प्रत्येक समूह इसी तरह शरीर के वजन मिलान प्रत्येक माउस निरुपित.
    3. एक खुला सामने Isoflurane vaporizer से गैस आउटलेट के साथ सुसज्जित हुड के भीतर एक शल्य चिकित्सा क्षेत्र निर्धारित करें.
    4. Isoflurane और फिर बिजली कैंची के साथ अपने पार्श्व दाढ़ी के साथ एक प्राप्तकर्ता माउस anesthetize. क्षेत्र है जहां प्रत्यारोपण प्रदर्शन किया जाएगा के बाहर माउस दाढ़ी.
    5. संज्ञाहरण और यह करने के लिए और सीधे एक गिलास छड़ी की शाफ्ट पर सीधा झूठ बोल इतना है कि मुंडा दिशा चेहरे स्थिति माउस लौटें. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे पार्श्व. माउस के लिए बारी betadine और शराब के तीन बार दोहराया के एक शल्य चिकित्सा साफ़ के साथ तैयार हो जाता है. स्पष्ट बाँझ मुंडा पार्श्व के लिए उपयोग की अनुमति टांगना के साथ माउस कपड़ा.
    6. प्रत्यारोपण के लिए islets तैयार है जबकि माउस anesthetized किया जा रहा है. निम्न चरणों को पूरा करके यह मत करो.
      1. प्लेस एक 1.5ml Eppendorph ट्यूब के उद्घाटन में एक बाँझ जेल लोड हो रहा है टिप इतना है कि वहाँ एक सौम्य मोड़ है जो टिप की संकीर्ण अंत में एक यू आकार बनाता है. टिप के उद्घाटन Eppendorph ट्यूब के बाहर हो सीधे का सामना करना पड़ जाना चाहिए. परिचय जेल लोड हो रहा है टिप में किसी भी बिंदु पर एक गांठ के रूप में इस islets और islets कि प्रतिरोपित कर रहे हैं की संख्या में कमी के बाल काटना में परिणाम होगा नहीं है.
      2. धीरे बर्फ से islets कि 5.2.2 चरण में तैयार किया गया था की एक ट्यूब हटा दें. Islets के सभी ट्यूब के नीचे बसे होना चाहिए. एक P200 विंदुक का प्रयोग, धीरे ट्यूब के नीचे से एक न्यूनतम मात्रा में islets एकत्र. जेल लोडिंग 5.3.6.1 चरण में तैयार टिप के बड़े खोलने के माध्यम से इन islets के स्थानांतरण. islets संकीर्ण लंबाई में या जेल लोड हो रहा है टिप के संकीर्ण प्रतिबंध समझौता करना चाहिए.
      3. बाद islets sedimented है, के रूप में संभव के रूप में जेल लोडिंग सिरे से मीडिया के बहुत दूर. यह एक ताजा जेल लोडिंग से जुड़ी जेल आइलेट असर लोड हो रहा है टिप के बड़े खोलने के माध्यम से मीडिया aspirating द्वारा एक P200 विंदुक टिप का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है.
      4. पीई 50 लचीला टयूबिंग (15cm ~ लंबाई में) में sedimented islets के स्थानांतरण. यह पहली बार P200 विंदुक टिप संलग्न करने से पहले जेल आइलेट असर लोड हो रहा है टिप की संकीर्ण खोलने के लिए गैर - ट्यूब के अंत beveled संलग्न द्वारा किया जा सकता है. islets तो टयूबिंग की लंबाई के 60% के माध्यम से धक्का दिया जा सकता है.
      5. 25μl हैमिल्टन सिरिंज आइलेट असर पीई 50 टयूबिंग स्थानांतरण. यकीन है सिरिंज सवार ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले वापस ले लिया गया है. सिरिंज की सुई पीई 50 टयूबिंग की गैर beveled बढ़त कनेक्ट.
      6. सिरिंज के सवार दबाना जब तक islets के लगभग 0.5cm beveled खोलने से दूर हैं.
      7. सिरिंज तरफ इतनी सेट कि islets ट्यूब के beveled खोलने के पास एक ही मास में बसा है, जबकि गुर्दे islets प्राप्त करने के लिए तैयार किया जा रहा है हो सकता है.
    7. अपनी उंगलियों का प्रयोग, संज्ञाहरण के तहत माउस की त्वचा के माध्यम से गुर्दे स्थानीयकरण. गेंद बिंदु कलम के शाफ्ट क्षेत्र है जहां गुर्दे स्थित है और रीढ़ की हड्डी को सीधा तैनात सीधे नीचे होना चाहिए.
    8. एक बार गुर्दे स्थानीयकृत है, McPherson - Vannas कैंची का उपयोग करने के लिए रीढ़ की हड्डी को सीधा दिशा में यह सीधे ऊपर dermis के माध्यम से एक 2cm चीरा बनाने के लिए. यह चीरा peritoneal दीवार का खुलासा होगा.
    9. McPherson - Vannas कैंची त्वचीय परत के माध्यम से कटौती के रूप में एक ही दिशा में peritoneal दीवार के माध्यम से एक 1cm चीरा बनाते हैं. यह महत्वपूर्ण है कि इस चीरा के द्वारा बनाई गई खोलने गुर्दे उजागर किया जा रहा से छोटी हो.
    10. Backstop के रूप में गिलास छड़ी की शाफ्ट का प्रयोग, peritoneal खोलने के माध्यम से वें पर नीचे दबाने से गुर्दे बलई आसन्न सतह. यदि खोलने गुर्दे की तुलना में थोड़ा छोटा है, गुर्दे और माउस की सतह पर stably खोलने के बाकी के माध्यम से किसी भी अतिरिक्त हेरफेर या संपर्क के बिना निचोड़ जाएगा. इस स्थिति के बाद प्रत्यारोपण के कदम के लिए इष्टतम है. यदि खोलने बहुत बड़ा है, गुर्दे वापस peritoneal गुहा में गिरावट, यह बाद में चरणों को पूरा करने के लिए मुश्किल बना.
    11. बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस के साथ उजागर गुर्दा लथपथ कपास का उपयोग कर की सतह गीला applicator इत्तला दे दी. इस कदम दोहराएँ हर कुछ मिनट या के रूप में बाहर सुखाने से गुर्दे कैप्सूल को रोकने की जरूरत है.
    12. 27 गेज सुई का प्रयोग, बाएँ पार्श्व की ओर से सही पार्श्व पक्ष की ओर बढ़ने गुर्दे की पूर्वकाल सतह भर में गुर्दे कैप्सूल के माध्यम से एक 0.2cm चीरा बनाते हैं.
    13. लौ का उपयोग गिलास केशिका ट्यूब जांच खींच लिया, गुर्दे कैप्सूल और गुर्दे parenchyma के बीच एक थैली बना. 5.3.12 चरण में बनाया चीरा के माध्यम से जांच डालने से ऐसा मत करो और एक पीछे दिशा में यह गुर्दे की सतह पृष्ठीय पार्श्व के साथ कदम. एक आदर्श जांच में एक मोड़ है कि गुर्दे की इस सतह के प्राकृतिक चाप मैच होगा. यह जांच खुला एक बड़े पूर्वकाल खोलने फाड़ के बिना गुर्दे की सबसे पीछे अंत तक पहुँचने के लिए अनुमति देगा. यह महत्वपूर्ण है इस थैली के रूप में संभव के रूप में लंबे और संकीर्ण है. लघु विस्तृत पाउच आदर्श के रूप में वे islets के कैप्सूल से बचने के लिए अनुमति नहीं कर रहे हैं. लंबे और संकीर्ण पाउच islets सम्पुटी थैली से कम से कम नुकसान के साथ गुर्दे के पीछे अंत की ओर जमा हो अनुमति देते हैं.
    14. 25μl हैमिल्टन 5.3.6 कदम में तैयार सिरिंज निकालें और लचीला ट्यूब के beveled खोलने के बहुत किनारे करने के लिए ले जाने के islets.
    15. लचीला टयूबिंग beveled बढ़त subcapsular कदम 5.3.13 में तैयार थैली में डालें. beveled बढ़त का सामना किया जाना चाहिए, ताकि लंबे किनारे गुर्दे parenchyma के साथ संपर्क में है. कैप्सूल का सबसे पीछे अंत करने के लिए ट्यूब हटो.
    16. धीरे धीरे सिरिंज के सवार निराशाजनक द्वारा पीई 50 ट्यूब से islets subcapsular थैली में स्थानांतरित. Islets के पाउच के रूप में धीरे धीरे वापस जमा किया जा islets के लिए और अधिक कमरे बनाने के बाहर लचीला ट्यूब को भरने. सुनिश्चित करें कि सभी islets ट्यूब से थैली में स्थानांतरित कर रहे हैं. हवा या अधिक तरल के साथ थैली भरने मत करो.
    17. थैली से पीई 50 ट्यूब को हटाने के बाद का उपयोग करें, लौ धीरे थैली के प्रॉक्सिमल अंत में islets पैक गिलास केशिका ट्यूब जांच खींच लिया. दिशा पीछे पूर्वकाल में चलती गुर्दे की बाहरी सतह के साथ कांच जांच फिसलने से यह मत करो. सावधानी बरतें नहीं islets भी subcapsular थैली के पीछे हो सकता है टूटना अंत के रूप में कसकर पैक और islets के रिलीज. यह कदम islets की थैली जब गुर्दे वापस peritoneal गुहा के अंदर रखा गया है की पूर्वकाल खोलने से नुकसान minimizes.
    18. तुला हाथ संदंश peritoneal गुर्दे के लिए बनाया खोलने के लिए आसन्न अस्तर उठा और फिर एक पीबीएस लथपथ कपास का उपयोग करें का उपयोग applicator के इत्तला दे दी धीरे peritoneal गुहा में गुर्दे वापस धक्का.
    19. Peritoneal दीवार और घाव क्लिप करने के लिए sutures त्वचीय परत को लागू करने के द्वारा माउस बंद करें.
    20. अपने पिंजरे और दोहराने कदम 5.3.4 करने के लिए 5.3.19 के माध्यम से शेष चूहों के लिए माउस लौटें. चूहे को पिंजरे के नीचे एक हीटिंग पैड या संरक्षित आँखों के साथ एक हीटिंग दीपक के साथ गर्म रखा जाना चाहिए जब तक माउस संज्ञाहरण से पूरी तरह ठीक है. पशु पानी (6 मिलीग्राम / एमएल) में acetominophine साथ प्रदान की जानी चाहिए.
    21. गैर उपवास रक्त ग्लूकोज स्तर 24hrs बाद में जाँच करें. सभी चूहों normoglycemic (रक्त <ग्लूकोज 200mg/dl) के आपरेशन के बाद (Pod) दिन 1 पर होना चाहिए.

6. प्रतिनिधि परिणाम

दो मुख्य प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं: (1) आइलेट अलगाव और गुर्दे कैप्सूल के तहत (2) आइलेट प्रत्यारोपण. आइलेट अलगाव प्रक्रिया में, आइलेट पैदावार आम तौर पर माउस प्रति 100-150 islets उम्र और तनाव पर निर्भर करता है के बीच सीमा होती है. अग्न्याशय के exocrine कोशिकाओं से उनकी जुदाई के लिए सम्मान के साथ इन islets की शुद्धता प्रत्येक तैयारी के बीच व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं. लेकिन कमरे में कदम 3.3.7 और 3.3.17 चरण में एक 0.1mm नायलॉन फिल्टर में तापमान Histopaque1077 का उपयोग आमतौर पर अधिक से अधिक islets के 99% शुद्धता के लिए अनुमति देते हैं. इस शुद्धता islets के किसी भी अतिरिक्त हाथ उठा से पहले हासिल की है. Islets निम्नलिखित अलगाव की छवियों प्रतिनिधि चित्रा 8D में दिखाए जाते हैं. के रूप में इन छवियों में देखा है, islets के आम तौर पर किसी न किसी परिधीय के बाद तुरंत अलगाव सीमा है. तथापि, संस्कृति में समय के साथ, स्वस्थ islets के अधिग्रहण और एक चिकनी बॉर्डर (चित्रा 8D) को बनाए रखने. कुछ टापू में, एक केंद्रीय परिगलित क्षेत्र का विकास होगा,कोर में एक अंधेरे क्षेत्र के रूप में प्रदर्शित होने. यह परिगलित केंद्र अक्सर आइलेट से निष्कासित कर दिया है के रूप में समय व्यतीत इमेजिंग (पूरक 1 वीडियो) द्वारा कब्जा कर लिया है. शेष islets के केंद्र में खोखले (नहीं दिखाया डेटा है) और कार्यात्मक नहीं संभाव्यतः दिखाई देते हैं. इस प्रकार, हम हाथ उठा प्रक्रिया के दौरान अंधेरे केंद्र के साथ islets बाहर. महत्वपूर्ण बात है, हमने पाया है कि एक कम तापमान प्रक्रिया अलगाव निम्नलिखित ऊष्मायन (4.2 चरण) नाटकीय रूप से islets कि संस्कृति में समय पर केंद्रीय परिगलन का विकास होगा की संख्या को कम कर सकते हैं.

आइलेट प्रत्यारोपण प्रक्रिया में, दो कदम महत्वपूर्ण हैं: मधुमेह और गुर्दे क्षेत्र उप - कैप्सूल islets की डिलीवरी की रासायनिक प्रेरण. मधुमेह प्रेरण के लिए, लक्ष्य STZ इंजेक्शन चूहों के 90% से अधिक में hyperglycemic हासिल है. इन चूहों को कई हफ्तों के लिए प्रत्यारोपण के बिना जीवित रह जाएगा. STZ इस लक्ष्य को प्राप्त करने के इष्टतम खुराक बदलता है, माउस उपभेदों और उम्र पर निर्भर करता है, और प्रयोगात्मक द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. हमने पाया है कि शरीर के वजन 20mg/kg के रूप में छोटे रूप में एक फर्क एक बड़ा फर्क कर सकते हैं. इस प्रकार, संकीर्ण अंतराल के साथ एक अनुमापन किया जाना चाहिए. Syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, और autoimmune allogeneic: आइलेट प्रत्यारोपण के लिए, एक महत्वपूर्ण विचार मॉडल है, जो चार प्रतिरक्षाविज्ञानी संदर्भों हो सकता है. Syngeneic मॉडल में, दाता तनाव प्राप्तकर्ता तनाव के रूप में ही है. इस प्रकार, islets के प्राप्तकर्ताओं से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नहीं लागू होगा. यह शोधकर्ताओं आसपास के मुद्दों की जांच करने के लिए अनुमति देता है एक शिथिलता और प्राप्तकर्ताओं द्वारा विशिष्ट प्रतिरक्षा अस्वीकृति के अलावा अन्य कारणों की वजह से नुकसान आइलेट चर्चा करते हुए शब्द "गैर प्राथमिक समारोह,". प्राथमिक गैर - समारोह जल्दी प्रत्यारोपण चरण में है और islets की एक बड़ी संख्या (≥ 2 pancreata / रोगी) euglycemia प्राप्त करने की आवश्यकता के लिए आइलेट विफलता के लिए मुख्य कारण माना जाता है. इस प्रकार, यह आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है. इस मॉडल में एक सीमांत आइलेट जन है कि पूरी तरह से normoglycemia और इस्तेमाल किया जाना चाहिए चूहों रक्त ग्लूकोज के लिए प्रारंभिक चरण में जांच होना चाहिए प्रत्यारोपण के बाद आम तौर पर 1 POD के बीच 7 पॉड बहाल नहीं करता. हमारे अनुभव में, islets की एक सीमांत जन आम तौर पर 150 और 250 के बीच प्रति 20 ग्राम प्राप्तकर्ता के औसत आकार islets / 6 C57BL चूहों के तनाव का उपयोग. Syngeneic मॉडल के साथ, एक आनुवंशिक या संशोधित pharmacologically islets का उपयोग करने के लिए परीक्षण है कि क्या एक विशेष मॉडुलन प्रारंभिक चरण में प्रत्यारोपण के बाद islets की चिकित्सीय प्रभावकारिता को प्रभावित करता है सकते हैं.

Allogeneic और autoimmune मॉडल में, आइलेट grafts मेजबान अनुकूली प्रतिरक्षा, जो टी lymphocytes, बी लिम्फोसाइटों, और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं शामिल है एक विशिष्ट प्रतिरक्षा हमले को उजागर कर रहे हैं. अनुकूली - उन्मुक्ति एक देरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, इस प्रतिक्रिया की परख के लिए, यह आवश्यक है islets कि प्रभावी ढंग से प्रारंभिक चरण में normoglycemia पुनर्स्थापित saturating संख्या प्रत्यारोपण के बाद प्रत्यारोपण के प्राथमिक गैर - समारोह के प्रभाव को कम करने के लिए. एक तो समय की लंबाई की निगरानी पहले islets के रूप में खारिज कर रहे हैं normoglycemia की हानि द्वारा संकेत भ्रष्टाचार अस्वीकृति पर islets के किसी भी संशोधन के प्रभावों का निर्धारण कर सकते हैं. हमारे अनुभव में, 300 से अधिक islets के प्रति 20 ग्राम माउस के लिए आवश्यक हैं और 15 से 21 दिनों के दाताओं और Balb / ग का उपयोग कर एक allogeneic प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकृति समय (एच - घ 2) के रूप में कर रहे हैं C57BL / 6 (एच 2 बी) के रूप में प्राप्तकर्ताओं.

चित्रा 1
चित्रा 1 आम पित्त नली का ग्रहणी खोलने का पता लगाने. अंतर्जात पाचन एंजाइमों, जिगर से draining अग्न्याशय और पित्ताशय ग्रहणी में आंत्र पथ में प्रवेश करने से पहले आम पित्त नली के माध्यम से गुजरती हैं. अगर दबाव बाह्य तरल पदार्थ जोड़कर व्यवस्था करने के लिए लागू किया जाता है इस नली के माध्यम से प्रवाह की दिशा उलट हो सकता है. यह पूर्ण और distended बनने अग्न्याशय में परिणाम देगा.

चित्रा 2
चित्रा 2 आम पित्त नली का ग्रहणी खोलने Clamping. Liberase साथ अग्न्याशय को भरने के लिए आदेश में, यह आम पित्त नली का ग्रहणी खोलने ब्लॉक करने के लिए आवश्यक है. अगर यह ठीक से नहीं हासिल की है, Liberase अग्न्याशय के बजाय आंतों भरना होगा.

चित्रा 3
चित्रा 3 डायाफ्राम के खिलाफ जिगर बदलना. आम पित्त नली के समीपस्थ क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देता है. आम पित्त नली का Cannulation सबसे सफलतापूर्वक हासिल किया जा सकता है, अगर यह अपनी प्रॉक्सिमल अंत के पास करने का प्रयास है (2.3.1 में वर्णित वी के आकार का संगम पर).

चित्रा 4
चित्रा 4 'मुक्त द्वारा आम पित्त नली Cannulating.'हाथ विधि है. आम पित्त नली का एक संगम दिखाई हो जाता है जब कि ग्रहणी पर clamped है hemostat माउस के पीछे के अंत की ओर खींच लिया है. वाहिनी cannulation इस संगम पर 27 गेज सुई रखने और इसे माध्यम से ड्राइविंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5 के द्वारा आम पित्त नली Cannulating. विधि 'संदंश सहायता' . के रूप में उल्लेख पाठ में, कभी कभी fascial वाहिनी आसपास के ऊतकों यह मुश्किल cannulate के लिए बनाता है. (ए) इन मामलों में, यह 27 गेज सुई के साथ चेहरे की परत को साफ करने के लिए उपयोगी है. (बी) वाहिनी तो स्पष्ट रूप से कल्पना और तुला हाथ संदंश की एक जोड़ी के द्वारा समर्थित किया जा सकता है. (सी) एक backstop रूप संदंश का प्रयोग, 27 गेज सुई Liberase की डिलीवरी के लिए वाहिनी में डाला जा सकता है.

चित्रा 6
6 चित्रा अग्न्याशय का भी विस्तार इष्टतम सुई स्थान इंगित करता है. वाहिनी और आसपास के fascial ऊतकों के पारदर्शी प्रकृति को देखते हुए, यह कुछ उदाहरणों में प्रकट हो सकता है जब वास्तव में ऐसा नहीं है कि वाहिनी गया cannulated है. यदि ऐसा होता है और सुई अग्नाशय के कैप्सूल में प्रवेश, अग्न्याशय के ग्रहणी क्षेत्र Liberase की डिलीवरी पर विस्तार शुरू हो जाएगा. हालांकि, पूरे अग्न्याशय और नहीं किया जा perfused इस कम आइलेट उपज में परिणाम देगा. इस समस्या से बचने के लिए, विशेष रूप से एंजाइम के लक्षण पेट के पूर्वकाल भाग से जुड़ी अग्न्याशय के क्षेत्र में प्रवेश करने के लिए तलाश द्वारा भी अग्न्याशय के विस्तार के लिए देखो.

7 चित्रा
7 चित्रा perfused अग्न्याशय हटाना. माउस से अग्न्याशय निकालने के लिए, आंत के साथ संपर्क के कई बिंदुओं को तोड़ दिया जाना चाहिए. (एबी) अलग आंतों से अग्न्याशय. (सी) अलग पेट से अग्न्याशय. (डी) आंतों से अग्न्याशय अलग. (एफई) peritoneal गुहा के साथ किसी भी शेष संपर्कों कट.

8 चित्रा
8 चित्रा islets के प्रतिनिधि छवियाँ. रिश्तेदार और islets की शुद्धता और गुणवत्ता अलगाव प्रक्रिया के पूरा होने पर microscopically अनुमान कर सकते हैं. (ए) जबकि लक्ष्य अग्न्याशय से islets शुद्ध है, exocrine कोशिकाओं और मलबे कभी कभी मौजूद हैं. (बी) आइलेट अलगाव के तनाव कि islets और आइलेट परिधि से कोशिकाओं के sloughing के अंधेरे केंद्रीय क्षेत्रों के रूप में प्रकट होता है कोशिका मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं. (सी) जब एक प्रयोग के लिए उठा islets, contaminating exocrine कोशिकाओं उठा से बचने के. (डी) Islets संस्कृति में समय के साथ उपस्थिति में परिवर्तन. के रूप में islets के अलगाव से उबरने के लिए, वे एक चिकनी परिधीय सतह के अधिग्रहण. कभी कभी बड़े islets में एक अंधेरे मध्य क्षेत्र दिखाई देता है. इन कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु के लिए सकारात्मक दाग.

पूरक 1 वीडियो समय बाद अलगाव islets की चूक माइक्रोस्कोपी. इस 16hr समय व्यतीत हो वीडियो में islets अलग हो कर रहे हैं कि अंततः परिगलित केन्द्रों के विकास देखा जा सकता है. कृपया वीडियो के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

ऊपर के वर्गों में, हम अलग और माउस अग्नाशय islets की रोपाई के लिए विस्तृत कदम का वर्णन. यहाँ, हम संक्षेप में कदम है कि प्रक्रियाओं की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं पर प्रकाश डाला.

1. आइलेट अलगाव

प्रमुख चरणों की पहचान कर रहे हैं एक इष्टतम enzymatic पाचन समय (1.4), आम पित्त नली (2.2.3) के ग्रहणी खोलने पर hemostat दबाना स्थिति, 37 के बाद आम पित्त वाहिनी (2.3), अग्न्याशय के जोरदार झटकों के cannulating डिग्री सेल्सियस (3.2), पचाने में और exocrine सेल संदूषण (3.3.7 और 3.3.16) को हटाने. इन चरणों गुणवत्ता, और islets की उपज और शुद्धता पर एक नाटकीय प्रभाव है. शायद सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम आम पित्त नली का cannulation है. कई चूहों में आम पित्त नली मुश्किल हो आसपास प्रावरणी के कारण कल्पना कर सकते हैं. इसलिए, यह आम है कि प्रयास केवल प्रावरणी ऊतक के प्रवेश में आम पित्त नली परिणाम cannulate. इन उदाहरणों में, Liberase आसपास के संयोजी ऊतक को भरने के लिए शुरू होता है और अग्न्याशय perfuse नहीं. यदि यह मनाया जाता है, Liberase के प्रवाह को रोकने के लिए और इतना है कि यह पित्त नली के लुमेन में प्रवेश सुई reposition. अभ्यास के साथ, यह संभव है करने के लिए जल्दी से सुई की नियुक्ति के लिए इष्टतम स्थिति की पहचान और नाज़ुक वाहिनी को नुकसान पहुँचाए बिना cannulation पूरा.

2. आइलेट प्रत्यारोपण

महत्वपूर्ण कदम मधुमेह (5.1) के STZ प्रेरण और islets के कुशल subcapsular पाउच (5.3.14-5.3.16) को प्रसव हैं. STZ एक स्वाभाविक रूप से होने वाली ग्लूकोज अनुरूप है कि चुनिंदा इंसुलिन स्रावित β 9 islets की कोशिकाओं कोशिकाओं को विषाक्त है . हालांकि, इस चयनात्मक विषाक्तता एक अपेक्षाकृत संकीर्ण एकाग्रता रेंज में होता है. यह तथ्य यह है कि STZ की उच्च खुराक तेजी मारक (2-3 दिन) में hyperglycemia के अभाव में परिणाम कर सकते हैं द्वारा evidenced है. इसलिए, ध्यान STZ के किसी भी बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू कर रहे हैं इससे पहले कि इस्तेमाल किया जा रहा तनाव और चूहों की उम्र के लिए इष्टतम खुराक की पहचान करने के लिए लिया जाना चाहिए. islets की शारीरिक subcapsular थैली को प्रसव भी एक महत्वपूर्ण कदम है. अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह जरूरी है अपने प्रसव के दौरान islets के नुकसान को कम. यह हो सकता है अगर वहाँ दोष या गुर्दे की थैली को कवर कैप्सूल में आँसू हैं या यदि इंजेक्शन की मात्रा बहुत बड़ी है. कैप्सूल के लिए नुकसान है, और चिकनी कांच जांच का उपयोग करने के लिए subcapsular पाउच तैयार करके कोमल और सावधान हेरफेर से बचा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन की मात्रा 5.3.6.3 कदम में सतह पर तैरनेवाला सावधान हटाने के साथ कम से कम किया जा सकता है. यदि सतह पर तैरनेवाला नीचे sedimented islets के स्तर के लिए हटा दिया जाता है, वहाँ आमतौर पर subcapsular 400 500 islets जगह थैली में पर्याप्त कमरे से अधिक है. हालांकि, अगर इंजेक्शन की मात्रा बहुत बड़ी है, islets अधिक थैली के प्रत्यारोपण की प्रक्रिया के दौरान बाहर रिसाव प्रयोग के reproducibility समझौता होने की संभावना हैं.

इस प्रोटोकॉल के भीतर, यह संभव है करने के लिए कदम से कुछ को संशोधित करने और अभी भी संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने. ये निम्नलिखित शामिल हैं: (क) अग्न्याशय को पचाने के लिए एक अलग एंजाइम का उपयोग, (ख) अग्न्याशय एंजाइम देने के लिए एक अलग तरीका है, (ग) का उपयोग एक निरंतर Ficoll सोडियम diatrizoate ढाल (FSD) एकल घनत्व Histopaque1077 कदम है, और (घ) आइलेट गुर्दे subcapsule के अलावा अन्य स्थानों के लिए प्रत्यारोपण के बजाय.

  1. इस प्रोटोकॉल में, Liberase अग्न्याशय के भीतर सेल सेल संपर्कों को कमजोर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Liberase अनिवार्य रूप से अत्यधिक collagenases कि अग्न्याशय से islets के जारी करने में उपयोगी सिद्ध कर दिया है शुद्ध का एक मिश्रण है. हालांकि, कम शुद्ध collagenases एक समान परिणाम को पूरा करने में सक्षम हैं. इसलिए, यह संभव है अग्न्याशय को पचाने के लिए विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम की तैयारी का उपयोग, उपज के रूप में लंबे समय के रूप में पाचन हालत के उच्च आइलेट गुणवत्ता हासिल करने के लिए अनुकूलित है, और पवित्रता.
  2. यह भी संभव है एंजाइम की ductal छिड़काव के बिना अग्न्याशय को पचाने. आम पित्त नली के माध्यम से Liberase की डिलिवरी अग्नाशय के सतह क्षेत्र के अधिक से अधिक एंजाइम के लिए जोखिम के लिए अनुमति देता है. अग्न्याशय और बरकरार islets की अधिक से अधिक रिलीज के भी पाचन में यह परिणाम है. हालांकि, अन्य एंजाइम अग्न्याशय की सतह क्षेत्र को बढ़ाने के कदम को इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, पहले यह Liberase में incubating या अग्नाशय के कैप्सूल के माध्यम से सीधे Liberase इंजेक्शन नख़रेबाज़ अग्न्याशय islets अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, Liberase प्रसव के कोई अन्य विधि के रूप में आम पित्त नली के माध्यम से छिड़काव के रूप में प्रभावी है. इसलिए, नख़रेबाज़ या प्रत्यक्ष इंजेक्शन एक अंतिम उपाय के रूप में आरक्षित किया जाना चाहिए, अगर आम पित्त नली और क्षतिग्रस्त नहीं perfusable है.
  3. Exocrine कोशिकाओं से अलग islets के लिए एक वैकल्पिक पद्धति शामिल10 Histopaque1077 के एक FSD ढाल के बजाय का उपयोग. इस प्रोटोकॉल में exocrine कोशिकाओं से islets के कुशल जुदाई हिस्से में दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच एक घनत्व अंतर के कारण है. Histopaque1077 25 में 1.0771 ग्राम / मिलीलीटर की एक घनत्व डिग्री सेल्सियस है इस तापमान में Histopaque islets लेकिन कम exocrine कोशिकाओं की तुलना में घने तुलना में denser है. इसलिए, centrifugation, Histopaque1077 exocrine कोशिकाओं छर्रों के बल के तहत जबकि सतह को islets उठाने. सिद्धांत रूप में, एक घनत्व के साथ किसी अन्य पदार्थ है कि है कि exocrine कोशिकाओं से islets अलग कर सकते हैं इस चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है और FSD ढाल एक ऐसा पदार्थ है.
  4. Islets के प्रत्यारोपण के लिए स्थान के लिए सम्मान के साथ, गुर्दे कैप्सूल इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कुछ संभावित स्थलों में से एक है. गुर्दे subcapsule चूहों में प्रत्यारोपण के सबसे अधिक रिपोर्ट साइट है, जबकि अन्य प्रत्यारोपण साइटों के लिए प्रभावी होना पाया गया है और वे यकृत पोर्टल शिरा, subretinal अंतरिक्ष, वृषण, अधिवृषणी वसा पैड, तिल्ली, और भी 11-14 अग्न्याशय शामिल हैं. इन स्थानों में से प्रत्येक के अपने फायदे और चुनौतियों का सामना किया है. इसलिए, आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक साइट का चयन संबोधित सवालों और प्रयोगों की विशिष्ट परिस्थितियों के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.

यह माना जाता है कि रणनीति है कि आइलेट प्रत्यारोपण पर सीमाओं को पार कर सकते हैं नाटकीय रूप से अपनी चिकित्सीय क्षमता में वृद्धि होगी. इसलिए, विस्तृत रूप में एक murine मॉडल के इस प्रोटोकॉल द्वारा उपयोग ऐसी रणनीतियों की पहचान करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम DK064938 RO1 (HI) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 31800-022
Liberase TL Reagent Roche Group 05401020001
Fetal Bovine Serum Reagent GIBCO, by Life Technologies 10437-028
Histopaque1077 Reagent Sigma-Aldrich 10771
Penicillin Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140
Sodium Citrate Reagent Sigma-Aldrich S4641
Streptozotocin Reagent Sigma-Aldrich S-0130
HCl Reagent Fisher Scientific A144-212
Isoflurane Reagent Vedco, Inc. ISOSOL
Glass Capillary Tubes Equipment Fisher Scientific 22362574
Insulin Syringe Equipment BD Biosciences 329461
27 Gauge Syringe Needle Equipment BD Biosciences 305109
Hamilton Syringe #1702 Equipment Fisher Scientific 14813133
10cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 0875712
6cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 07770212
6-0 Suture Equipment Ethicon Inc. 8726H
PE 50 Flexible Tubing Equipment Fisher Scientific NC9083963
5ml Disposable Syringe Equipment BD Biosciences 309603
50ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352098
15ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352097
0.1mm Nylon Mesh Equipment Fisher Scientific 22363549
0.419mm Wire Mesh Equipment Newark Wire Cloth Company 0300241
Water Bath Incubator Equipment Fisher Scientific 15-462-5
Dissecting Microscope Equipment Carl Zeiss, Inc. Stemi SV6
Inverted Microscope Equipment Nikon Instruments TMS
Tissue Culture Incubator Equipment Napco 6300
Dissecting Scissors Equipment Kent Scientific INS14393
McPherson-Vannas Scissors Equipment Kent Scientific INS500260
Curved Forceps Equipment Kent Scientific INS15915
Hemostatic Forceps Equipment Kent Scientific INS 500451
Isoflurane Nebulizer Equipment Smiths Medical ISOTech 4 OHMEDA
Swing Bucket Centrifuge Equipment Dupont – Sorvall RT6000D
Swing Bucket Rotor Equipment Dupont – Sorvall H1000B
pH Meter Equipment Mettler Toledo 09313509
Gel Loading Tips Equipment Fisher Scientific 05408151
p200 Tips Equipment USA Scientific, Inc. 111-0730

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Murine आइलेट अलगाव और Subcapsular गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए एक विधि
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Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. … More

Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096, doi:10.3791/2096 (2011).

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