Summary
절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.
Abstract
당뇨병 설치류에 Langerhans의 아일 레츠의 이식을 입증 볼링거하고 Reckard의 초기 개척 작품들이 혈당 수치를 정상화 수 있으므로, 아일릿 이식은 1 형 당뇨병의 1,2에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 최근 인간의 아일릿 이식의 진보가 더 이상이보기 1,3를 강화했습니다. 그러나, 두 가지 주요 한계는 광범위한 임상 현실되는 아일릿 이식을 막기 : 크게 영향을 심각하게 잠재받는 사람 수를 줄여 환자 당 아일 레츠의 큰 숫자는 (a) 요구 사항, 그리고 무거운 immunosuppression에 대한 (B) 필요 장기 immunosuppression 자신의 취약점으로 인한 환자의 소아 인구. 이러한 한계를 극복 할 수 전략은 아일릿 이식의 치료 유틸리티를 향상시킬 가능성이있다.
마우스 신장 캡슐 아래 아일릿 이식은 아일릿 이식을 향상시키기 위해 다양한 전략을 조사하기 위해 널리 인정 모델입니다. 이 실험은 고품질 아일 레츠과 당뇨병 수신자에게 아일 레츠의 주입의 절연을 필요로합니다. 두 절차는 더 나은 텍스트보다 동영상으로 보여준 수있는 수술 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 비디오 및 서면 프로토콜 모두 이러한 절차에 대한 자세한 단계를 문서화합니다. 우리는 또한 잠시 다른 이식 모델을 토론 : syngeneic, allogeneic, syngeneic 면역 및자가 면역 질환 allogeneic.
Protocol
1. 준비 및 Liberase 시약의 보정
- 이 프로토콜은 Liberase TL (로체, 고양이 # 05 401 020 001) 췌장 소화 효소에 대한을 활용합니다.
- 한 번에 100 200mg을 구입하고 큰 배치합니다. 무균 HPLC 등급의 물이 동결 건조된 분말 너무 농도가 ML 당 약 26 Wünsch 단위임을 다시 일시 중지합니다. 이것은 약 5 MG / ML해야합니다. 특정 주차장에 포함된 Wünsch 단위에 대한 자세한 내용은 패키지 삽입을 참조하십시오. 몇 분 간격 소용돌이 이방인과 함께 30 분 동안 얼음에 튜브를 놓으십시오. 분말이 완전히 30 분 끝에 해산한지 확인하십시오.
- 풀 모두 녹아 함께 Liberase과 (와동 또는 흔들지 마세요) 부드러운 소용돌이와 함께 섞는다. 사전 냉장 Eppendorph 튜브, 액체 질소에 대한 빠른 프리즈 (모든 효소로 처리) 및 -80 ° C.에 저장하기 위해 나누어지는 24.3 Wünsch 단위 이것은 Eppendorph 관 약 0.935ml해야합니다. 각 나누어지는 단일 사용 (충분한 11 쥐)을 위해하고 저장하거나 다시 한번 냉동 해동해서는 안됩니다. 일반적으로 주식은 적어도 6 개월 안정됩니다.
- 각각의 새로운 배치의 경우 최적의 배양 시간을 보정합니다. 최대한 실제 실험 조건을 모방하기 위해 보정을위한, 냉동 주식이 아닌 신선한 해산 주식을 사용합니다.
- 물 정확히 37을 사용하려는 목욕 ° C 수은 온도계를 사용합니다.를 보정 이후의 실험에서 동일한 배양기를 사용합니다.
- 전에 사용, 얼음 Liberase의 튜브를 해동하고 마지막 작업 농도 ML 당 1.08 Wünsch 단위 만들기, 21.6ml 혈청 무료 RPMI로 (0.935ml)을 추가합니다. 혈청, BAS 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 Liberase을 억제. 아연과 칼슘이 cofactors 있습니다. 1.5 시간 이내에 얼음과 사용에 저장. 이 정도면 약 11 생쥐 (2ml/mouse)입니다.
- 췌장의 재관류에 대한 2.3 단계를 참조하십시오. 1 시간에 가능한 많은 생쥐로 Perfuse. 다음 각 배양 시간 및 테스트 10 하나 또는 두 개의 마우스, 12, 14, 16, 18 분 배양 시간을 사용합니다. 가능하면 소화의 타이밍이 매우 중요하다로, 시간 사이 30초 간격을 포함합니다.
- 아일릿 격리 프로토콜을 작성하고 각 배양 시점에서 아일릿 수율과 품질을 분석할 수 있습니다. 궁극적으로 수확량이 최고 배 사이에 너무 많은 변화하지 말아야하지만, 그 간격 아일 레츠의 품질이 달라질 수 있습니다. 이후의 실험은 조건 격리 후 건강 48시간 아르 아일 레츠의 가장 큰 숫자에 결과를 사용합니다. 생쥐의 시대 최적의 배양 시간에 영향을 미칠 것으로 보인다. 그래서, 비슷한 나이 범위 내에서 마우스를 사용합니다. 이상적으로, 8~12주 오래된 마우스를 사용되지만, 심지어 80~10개월 된 생쥐 좋은 아일 레츠를 얻을 수 있습니다. 교정을 위해 어린 생쥐를 사용합니다.
2. 수술
- 아일릿 기증자 쥐를 euthanizing하기 전에 모든 장비와 미디어를 준비합니다.
- 압력솥이나 화염 사용하기 전에 악기 소독. 모든 시약과 장비 (샘플을 감동) 멸균해야합니다. 아일 레츠의 고립과 손 수확이 크게 오염의 발생을 증가하지 않고 층류 후드 밖에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 췌장이나 아일 레츠와 접촉 도구의 살균은 오염을 피하는 것이 중요합니다. 다음과 같은 도구가 필요합니다 :
- 복부 절개에 대한 가위를 해부 1 쌍.
- 포셉의 이쌍.
- 담즙 덕트를 클램프 1 hemostatic 포셉.
- 0.419 mm 직경의 와이어 메쉬.
- 0.1 mm 직경의 나일론 메쉬.
- 70도 각도는 바늘의 길이 아래로 약 절반을 도입 있도록 몇 가지 27 게이지 바늘을 구부. 바늘의 beveled 가장자리는 팔꿈치의 안쪽을 직시해야합니다.
- 70 % 에탄올로 스프레이 병을 채우십시오.
- 실험실 벤치에서 또는 모자에 적절한 광원과 해부 현미경을 설정합니다.
- 4 ° C. 미리 냉기 원심 분리기 원심 분리기는 스윙 버켓 로터를 900xG 수 있어야, 냉장 수 있으며, 해지 할 수있는 휴식이 있어야합니다. Sorvall H1000B 회전자와 RT6000D Sorvall에서 900xG 속도는 2400RPM입니다. 천천히 돌면서는 800RPM에서 할 수 있습니다.
- 얼음에 다음과 같은 시약를 놓습니다.
- RPMI (10 % 혈청 1리터)
- RPMI (혈청없이 200ml)
- 50ml 원뿔 튜브 (각 췌장 1)
- 5ml 주사기.
- 객실 템피에 Histopaque1077를 평형rature.
- 얼음 보정 Liberase의 단일 사용 나누어지는를 해동 및 22.5ml 혈청 무료 RPMI에 희석. 혈청, BAS 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 Liberase을 억제. 아연과 칼슘이 cofactors 있습니다. 1.5 시간 이내에 얼음과 사용에 저장. 이 정도면 약 11 생쥐 (2ml/mouse)입니다.
- 따뜻한 37 ° C의 물 목욕.
- 당신은 1 시간 (- 18 마우스 약 10)에 cannulate 가능한 많은 생쥐로 손에있다.
- 압력솥이나 화염 사용하기 전에 악기 소독. 모든 시약과 장비 (샘플을 감동) 멸균해야합니다. 아일 레츠의 고립과 손 수확이 크게 오염의 발생을 증가하지 않고 층류 후드 밖에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 췌장이나 아일 레츠와 접촉 도구의 살균은 오염을 피하는 것이 중요합니다. 다음과 같은 도구가 필요합니다 :
- cannulation을 위해 마우스를 준비합니다. 먼저 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 마우스를 안락사. 마우스가 만료되는 동안, 2ml Liberase 작업 주식 (1.08 Wünsch 단위 / ML)와 5ml 주사기를 입력합니다.
- 종이 해부 범위에 타월을 두 앞 다리로의 음모 지역에서 V - 절개와의 복부를 열기 전에 70 %의 에탄올과 복부를 스프레이에 위로 향한 위치에 플레이스 마우스. 복강을 나타내기 위해 가슴 배 피부.
- 머리가 가리키는 방향으로 마우스를 놓습니다. 로 FIG.1으로 강조 일반적인 담즙 덕트의 십이지장 항목을 찾습니다. 이것은 해부 범위 객관적으로 보지 않고 할 수 있습니다.
- 로 FIG.2에서 보여주 hemostat과 십이지장 개막을 고정. 클램프 위치는 내장에 Liberase의 흐름을 차단을위한 중요합니다. 클램프가 너무 높거나 너무 낮으면 Liberase는 췌장을 perfuse하지 않습니다. 위치 hemostat은, 너무 압축하면, 그것은 췌장 / 소장 보더 따라 정확하게 실행됩니다.
- 일반적인 담즙 덕트를 cannulating하기 전에, 그것은 일반적인 담즙 덕트의 전체 길이가 (FIG.3) 노출되도록, 횡경막을 그것을 눌러 간을 조정해야 할 수도 있습니다. 일단 담즙 덕트의 길이가 노출, cannulation에 대한 Liberase 가득한 주사기에 부착된 벤트 27 gague 바늘을 사용합니다. 담즙 덕트를 cannulating 두 가지 방법이 있습니다.
- 첫 번째 기술, 또는 '자유 재량'방식에서 hemostat는 일반적인 담즙 덕트 긴장 늦추지 될 수 있도록 십이지장이 꼬리를 향해 마우스의 머리에서 끌려나옵니다에 고정되어. 담즙이 장내에 들어가기 전에 함께 간을에서 담즙 방광과 효소의 배수간에 담즙 덕트 가까이에 합류가 있습니다. 이 합류하여 형성된 V의 내부는 꽉 담즙 덕트를 당겨 노출과 (FIG.4) 덕트의 cannulation을 시작하는 이상적인 장소입니다. 정확하게 위치하는 경우, 바늘은 V를 뚫고 슬라이드, 직접 덕트의 하단 부분을 cannulate 것입니다. Liberase을 분배하기 전에 덕트에 바늘 몇 mm를 삽입합니다. 최적의 바늘 위치는 간 및 담즙 방광으로 역류를 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 바늘은 지금까지 그것이 지라 덕트를 방해 것을 삽입하지 않는 것이 중요합니다. 지라 덕트는 일반적인 담즙 덕트의 지점을 보시려면 어렵습니다 그리고 그것은 췌장, 아일릿 풍부한 지역의 지라 꼬리를 빼낸. 바늘이 지라 덕트에 대한 개방 과거 슬라이드하면, 지라 꼬리 완전 재관류이 지역의 잠재적으로 감소 소화 미만있을 것입니다. 최적의 아일릿 수율은 바늘의 깊이가 멀리 더 Liberase 지금까지 당신이 지라 덕트를 통과했다는 간 / 담즙 방광을 기약 없지만하지 않는 것이 경우에 발생합니다. 당신은 Liberase의 작은 금액을 분배하여 성공 cannulation에 대해 테스트할 수 있습니다. 당신이 덕트를 작성 Liberase 표시되면 다음 2mls의 나머지 부분을 분배. 덕트 주변 지역 채우기 시작하면, 분배 중지 바늘 위치를 조정하고 다시 시도해보십시오.
- 두 번째 기술, 또는 '포셉가 지원'방식에서 hemostat는 일반적인 담즙 덕트 긴장 늦추지 될 수 있도록 꼬리쪽으로 마우스의 머리에서 끌려나옵니다 십이지장에 고정되어. 그런 다음, 벤트 27 gague 바늘 가까이 간으로 덕트 일반적인 담즙 아래 근막 펑크, 5ml 주사기에 부착된를 사용합니다. 덕트 (FIG.5)에서 근막을 취소 바늘을 사용합니다. 아직 장소에 바늘로, hemostat을 설정하고 포셉 한 쌍의를 선택하십시오. 바늘이 근막를 받았 담즙 관을 세운 열린 포셉의 팔 하나를 사용하십시오. 포셉의 산등성이는 덕트에 바늘을 안내하는 데 사용할 수있는 넓이를 만듭니다. 당신쪽으로 덕트와 집게를 당기지만, 역전으로 포셉를 사용하여 덕트로 바늘을 슬라이드. Liberase의 작은 금액을 분배하여 cannulation에 대한 테스트합니다. 덕트가 (FIG.5 화살표) 작성하기 시작하면, 2mls의 나머지 부분을 분배. 덕트 주변 지역 채우기 시작하면, 분배 중지 바늘 위치를 조정하고 다시 시도하십시오.
- Liberase의 2mls은 췌장, 십이지장은 위장의 상단에있는 지역, 그리고 마지막으로 지라 꼬리 (FIG.6) 다음 먼저 확장하기 시작 근처 지역을 채우고로. 췌장도 확장 (FIG.6를 찾습니다). 한 분야가 확장하기 시작하고 흰색 조직이 균일하게 팽창하고 퍼지는가 표시되지 않으면, 그것은 일반적인 담즙 덕트가 cannulated되지 않은 가능성이 높습니다, 아직 바늘은 췌장 캡슐 안에있다. 효소에 노출 표면적이 부족 될 것이다 Liberase로 캡슐을 작성하면 높은 아일릿 수율 발생하지 않습니다. 이 경우 재관류를 중지하고 바늘을 조정.
- 췌장이 perfused되면, 그것은 창자, 위장, 비장 및 접촉의 지점에서 무료로 그것을 당기는하여 마우스에서 제거할 수 있습니다. 십이지장에서 hemostat을 제거하여 시작합니다. 그런 다음, 십이지장을 리프트와 포셉의 두 번째 쌍 (FIG.7A - B)과 내장에서 췌장을 분리 포셉을 사용합니다. 이것은 복부의 내장을 꺼내면서 포셉의 두 번째 쌍의이 안정을 통해 이루어집니다. 다음, 복부의 위쪽과 비장 (FIG.7C - D)에서 무료로 췌장을 가져옵니다. 마지막으로, 복부의 췌장을 채취해서 남아있는 근막 연결 (FIG.7E - F)에서 무료로 잘라.
- 다른 생쥐에서 작업하는 동안 50ml 원뿔 관에있는 췌장을 넣고 얼음에 둡니다. 1 시간 타이머를 시작합니다. 최대한 아일릿 수율은 각 튜브에서 단 1 개의 췌장을 놓으십시오. Liberase이 조직을 저하 시작되므로 이것은 이상 1 시간 동안 얼음에 perfused pancreata를 떠날하지 않는 것이 좋습니다. 시간의 끝에, 즉시 perfused 있었다 모든 pancreata에 대한 3.0 단계로 이동하십시오.
- 단계 2.3 반복 - 2.6 나머지 생쥐를위한 것이거나 1시간 타이머 단계 2.6 시작하기 전에 만료되었습니다.
3. Perfused Pancreata에서 정화 아일 레츠
- 아일 레츠이 췌장에서 정화 수 있습니다 전에 조직이 37 소화해야 ° C. 그룹 37 ° C의 물을 욕조에 맞는 오픈 하단 선반에 perfused 아일 레츠를 베어링 50ml 튜브. 모두 대문자가 잘 (단계 1.4 참조) Liberase의 현재 배치를 위해 미리 정해진 보안 및 시간의 정확한 금액을 37 ° C의 물을 욕조에서 잠수함 튜브 있는지 확인합니다. 부화의 마지막에는, 얼음 튜브를 이동하고 관 당 20mls에 혈청 10 % RPMI1640를 추가합니다. 혈청이 포함된 미디어 Liberase의 소화를 중지합니다.
- 10 초안에 적극적으로 40 번 튜브를 흔들어하여 조직을 끊을. 이 단계는 아일 레츠 최적의 복구를 위해 중요합니다. 조직이 깨진되지 않은 경우에도 최적의 Liberase 재관류와 밀접하게 보정 소화 시간과 아일릿 수율이 낮은 것입니다. 이 단계에서 샘플의 공격적인 취급은 마우스 아일 레츠에게 해를 나타납니다 exocrine 세포 클러스터에서 그들을 자유롭게하는 데 필요한되지 않습니다.
- 소화 췌장에서 아일 레츠을 분리하려면 다음 단계를 완료하십시오.
- 튜브 당 약 2.5 pancreata이되도록 풀 pancreata을 소화. 이렇게에서는, 열 튜브는 미디어 각 50mls 4 개의 튜브로 응축됩니다.
- 800RPM 4 2 분 튜브를 원심 분리기 ° C.
- 뜨는을 붓고 여러 초 (최대 약 50 % 소용돌이 강도를 조정) 부드럽게 vortexing 10 % FBS와 15 - 25mls 미디어 알약을 resuspend.
- 0.419mm 와이어 메쉬를 통해 resuspended 슬러리를 붓고하고 신선한 50ml 원뿔 관에 유입 경로. 이것은 비 소화 조직, 지방과 림프를 분리합니다. 10% FBS 및 와이어 메쉬를 통해 붓다를 포함하는 미디어의 추가 10mls으로 초기 튜브 린스. 남은 튜브에 대해이 과정을 반복합니다.
- 800RPM 4에서 2 분 동안 튜브를 원심 ° C.
- 뜨는을 붓고 조심스럽게 종이 타월에 튜브를 반전. 아일 레츠가 밀어하지 않도록 조심해. 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 잔류 미디어를 제거하는 종이 타월로 튜브의 내부를 닦아주십시오. 직립 위치로 튜브를 반환합니다.
- 몇 초 동안 부드럽게 vortexing하여 실온 histopaque1077의 5mls에서 알약을 Resuspend. 정지는 튜브의 내부 주변 histopaque의 추가 5mls를 추가하기 전에 균질 있는지 확인하십시오. 이것은 튜브의 벽 아일 레츠를 씻는다.
- 혈청 무료 RPMI의 10mls와 중첩 histopaque, histopaque 및 미디어 사이에 날카로운 인터페이스를 유지하기 위해주의하고. 10초 당 1ml의 속도로 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting하여 미디어를 추가합니다. 미디어 상단에있을, 그리고 하단에 histopaque해야합니다. 혈청 미디어의 밀도에 영향을 미치는이 단계에서 사용할 수 없습니다.
- 에 equilibrated 원심 분리기에 샘플을 스핀 20 ° 20 아주 느린 가속 분없이 제동을위한 2400RPM (900xG)에서 C. 이 단계는 exocrine 세포에서 아일 레츠를 분리합니다. 아일 레츠는 혈청 무료 미디어 Histopaque 사이의 인터페이스로 마이 그 레이션됩니다 exocrine 세포 WI 동안튜브 하단의 펠렛을 형성됩니다.
- 일회용 피펫 10ml serological와 미디어 / histopaque 인터페이스에서 아일 레츠를 수집합니다. 아일 레츠 유리에 붙어 것입니다 그러므로 그들이 siliconized되었습니다 않는 유리 pipettes를 사용해서는 안됩니다. 신선한 50ml 원뿔 관에 아일 레츠를 놓습니다. 여러 튜브는이 시점에서 풀링된 수 있습니다. 혈청이 포함된 RPMI와 50ml로 튜브를 입력합니다.
- 800RPM 4 2 분 튜브를 원심 분리기 ° C.
- 뜨는을 붓고 부드럽게 vortexing하여 혈청이 포함된 RPMI의 50mls에서 아일 레츠를 resuspend.
- 800RPM 4 90 초 동안 튜브를 원심 ° C.
- 뜨는을 붓고 1 시간을 더 씻어 반복합니다.
- 뜨는을 붓고와 조직 문화 후드에 튜브를 가져가라. 아일릿 문화 미디어를 만들기 위해 1 % 최종 농도 10 % FBS가 포함된 RPMI 위해 펜을 / strep을 추가합니다. 이 문화 미디어의 5mls에서 아일 레츠를 Resuspend.
- 0.1mm 나일론 셀 스트레이너를 반전하고 15ml 원뿔 관에 놓으십시오. 천천히 스트레이너를 통해 resuspended 아일릿 슬러리를 전달합니다. exocrine 세포 15ml 원뿔 튜브에 통과하는 동안 아일 레츠는 여과기에 의해 유지됩니다. 이 단계는 크게 프로토콜의 끝에 exocrine 세포 오염에 대하여 아일 레츠의 순결을 증가시킵니다.
- 미디어의 추가 6mls로 50ml 원뿔 튜브를 씻어 스트레이너를 통해 피펫.
- 10 cm 배양 접시에있는 큰 드롭으로 문화 미디어 플레이스 3mls. 아일 레츠를 캡처하는 데 사용되는 표면 미디어 드롭을 과감하게 수 있도록, 셀 스트레이너 오른쪽 사이드를 반전. 언론에 필터를 감동하면 배양 접시 처리가 아닌 조직 문화로 아일 레츠의 대부분을 전송합니다. 비 취급 페트리 접시를 사용하면 접시의 표면에 부착 아일릿과 분산을 피하기 위해 중요합니다. 무료 부동 아일 레츠는 훨씬 더 쉽게 실험 그룹으로 분리 포착하고 있습니다.
- 그릇에 스트레이너의 잔여 아일 레츠 씻어 수있는 배양 접시에 스트레이너를 통해 문화 미디어의 추가 5 7mls을 피펫.
- 거꾸로 현미경에 4X 목표 아래 아일릿 수확량과 품질을 확인하십시오. 꽉 타원형의 접시를 소용돌이 치는 것은 접시의 중앙에있는 아일 레츠를 수집합니다. 아일 레츠 잘 보면, 그들은 실험 중 사용하기 위해 즉시 수거 또는 4-6 10cm 배양 접시 (10 생쥐 당) 사이에 균일하게 분리하실 수 있습니다. 같은 접시에 Culturing 너무 많은 아일 레츠는 아일 레츠가 괴사 및 저하될 될됩니다. 실험, 미디어의 2 3mls와 6cm 접시 당 250-300 아일 레츠는 아일 레츠 스트레스를 나타나지 않습니다.
- 을 통해 0.1mm 나일론 셀 스트레이너 흐름을 수집한 15ml 원뿔 관의 일부 사용할 아일 레츠있을 것입니다. 이 아일 레츠는 중력 침강의 3-4 순찰 다음 복구할 수 있습니다. 침전의 약 4 분 후에 모든 대기음하지만 문화 미디어로 가기 튜브 및 리필 그것에서 미디어의 약 1ml. 튜브 뚜껑과 섞어 반전. 이 과정을 여러 번 반복하면 침전을 느리게하는 단세포 exocrine 세포 중 많은 것들을 제거하고 풍요롭게 신속하게 싱크 내분비 세포 (아일 레츠)의 무거운 집계합니다. 최종 흡인 후, 문화, 미디어 및 새로운 배양 접시에있는 접시의 7mls에 resuspend.
4. 절연 아일 레츠 작업
- 고립의 프로세스는 아일 레츠에 상당히 스트레스가되며 histopaque 떨고, 독성하고 원심 분리 단계는 순전히 스트레스를 유발하고, 호스트 혈액 공급뿐만 아니라에서 제거로 체외 문화에 hypoxia 유발 수 있습니다. 우리와 다른 절연이 베타 세포 죽음을 유도 4-5 것으로 나타났습니다. 이러한 스트레스의 효과는 아일릿의 주변 세포 sloughing과 고난의 아일릿의 중앙 핵심 (중앙 괴사)의 퇴학으로 볼 수 있습니다. 주변 세포 sloughing가 용납 수 있지만, 아일릿의 중심 괴사가 실험에 사용하기 위해 그것을 disqualifies. 일반적으로 큰 아일릿, 중앙 괴사가 문제가 될 확률이 큰. 아일릿의 게시물 절연 스트레스 반응을 감소하기위한 노력은 사용할 수 아일 레츠의 수율을 높일 것입니다.
- 따라서, 우리는 절연 6-8 다음과 같은 첫 번째 48~72시간에 22-27 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 아일 레츠를 잠복기의 이전에 보고된 기술을 사용합니다. 이 감소 온도 아일 레츠 스트레스 응답을 dampens 및 체외 문화에 그들의 전환을 부드럽게. 22-27 ° C의 조직 문화 인큐베이터를 사용할 수없는 경우, 그것은 열 제어를 해제하고 약 20파운드 배치에 의해 표준 조직 문화 인큐베이터에서 원하는 온도 범위를 달성하는 가능-80에 equilibrated 냉동고 벽돌 ° C. 인큐베이터에있는 감소의 온도를 약 16~24시간이 발생합니다. 필요에 따라 -80 ° C 냉동고에 벽돌을 교체하십시오. 우리는 72hrs 이상이 낮은 온도에서 부화에서 추가 혜택을 관찰하지 않았습니다.
- 저온 배양 이외에, 우리는 격리 후 미디어 24~48시간를 변경하는 것이 좋습니다. 스트레스와 죽은 아일 레츠에서 분비 요인 미디어 다음 격리 축적 및 추가 아일릿 스트레스를 홍보할 수 있습니다. 미디어를 변경하려면 다음 단계를 완료하십시오.
- 플라스틱 피펫을 사용하여 15ml 원뿔 관에 페트리 접시에서 미디어 아일 레츠을 전송합니다.
- 잔류 아일 레츠를 수집하는 문화 미디어의 추가 3mls와 접시를 씻으십시오.
- 15ml 원뿔 관이 추가 3mls를 추가하고 5 분에 대한 중력 침전에 아일 레츠하실 수 있습니다.
- 15ml 원뿔 관에서 미디어를 제외한 모든 1ml를 대기음 다음 아일릿 문화 미디어의 4mls에서 아일 레츠를 resuspend.
- 새로운 배양 접시에 아일 레츠와 미디어를 전송합니다. 잔여 아일 레츠를 수집하고 배양 판에 이것을 추가하는 15ml 원뿔 관에 문화 미디어의 추가 3mls를 추가합니다.
- 모든 3-5일 이후 아일릿 미디어를 변경합니다.
- 실험 아일 레츠를 채취하면, 그것은 다른 isolations에서 아일 레츠를 섞어 사용하지 않는 것이 좋습니다. 아일 레츠의 분자 기준은 그들이 문화에있다 시간의 금액 및 초등학교에서 준비 다릅니다 절연 스트레스를 포함하여, 많은 것들에 의해 영향을받습니다. 다양성을 줄이기 위해, 아일릿 실험이 동시에 고립되었다 아일 레츠에서 수행되어야합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 단, 우리는 강력하게 실험을 채취하기 전에 하나의 그룹에 모든 아일 레츠를 풀링하는 것이 좋습니다. 실험 아일 레츠을 선택하려면 다음 단계를 완료하십시오.
- 아일 레츠는 위에 나열된 4.3.5 단계 4.3.1에 따라 하나의 그릇에 하나 이상의 요리, 수영장, 모든 아일 레츠에게의 잠복기 경우. 아일 레츠 여러 요리가 관련된 경우, 50ml 원뿔 관은 15ml 튜브 대신 사용해야합니다. 이것은 이후 절연 복구 기간 동안 플레이트 사이의 문화 환경의 미묘한 차이에 의해 유발되는 변화를 줄일 수 있습니다.
- 아일 레츠의 중력 침전하는 동안, 4X 또는 10X 목적을 갖춘 거꾸로 현미경을 설정합니다. p200의 micropipette 및 살균 p200 도움말 상자를 수집합니다.
- 하나의 접시에 sedimented 아일 레츠를 전송하고 현미경으로 플레이트를 이동합니다. 소용돌이 접시는 중앙에 아일 레츠를 수집합니다. 접시에 뚜껑을 제거하고 건강한 아일 레츠를 선택하기 위해 p200 피펫을 사용합니다. 건강한 아일 레츠 부드러운 경계선없이 어두운 중심 지역 (그림 8)이. 아일릿 크기가 치료 반응을 변경할 수있는 실험적인 요리를 통해 아일릿 크기의 균등을 유지하기 위해보십시오.
- 실험 그룹마다 아일 레츠의 숫자는 실험의 필요에 따라 다를 수 있습니다. 우리가 하나 아일릿 약 1000-2000 세포를 보유하고 단백질과 총 RNA의 25ng의 0.3 - 1μg을 낼 것으로 예상하고있다. 시험 관내 assays에 들어, 일반적인 실험 그룹은 미디어의 1 - 3ml와 35mm 또는 6cm 요리 100 사이 250 아일 레츠 도금 수 있습니다. 이식은 각받는 마우스 (자세한 내용은 5.2.2 단계 및 토론 참조) 실험 설계에 따라 150 사이 400 아일 레츠 필요합니다.
- 손으로 따기 프로세스 도입 변형을 최소화하기 위해, 우리는 아일릿 크기를 추정하기 위해 가이드로 p200 - 피펫 팁의 구멍을 사용합니다. 대부분의 아일 레츠은 구멍 직경의 약 절반 직경을 가지고, 우리는 하나의 표준 아일릿로 각각 계산. 모든 아일 레츠 큰 또는보다 작은, 우리는 그에 따라 다른 아일릿 수를 지정합니다. 우리는 20-50의 일괄 아일 레츠를 수집하고 지정된 실험 요리로 전송할 수 있습니다. p200 - 피펫은 180 microliters의 볼륨에 설정하면, 하나 하나의 팁으로 여러 아일 레츠를 (일반적으로 50 개 이상의 아일 레츠) 수집할 수 있습니다. 따라서 아일 레츠가 한 번에 하나를 선택한 경우에도, 하나는 pipetman 릴리스 메커니즘을 제어하여 각 p200 - 팁 내에 많은 아일 레츠를 수집할 수 있습니다. 이것은 수백 따기 또는 더 많은 실험에 필요한 아일 레츠의 수천 이상을 용이하게합니다. 우리는 또한 유사한 품질과 크기 아일 레츠의 분포 밖에도 도움이 배치 현명한 작업을 사용합니다.
5. Subcapsular 신장 이식 아일릿
- 이식받는 마우스의 당뇨병을 유발.
- 4-6시간의 빠른 플레이스 마우스. 최적의 이식받는 사람은 10-6 사이 주 나이가 빠른 시간에 20~25g의 무게를해야합니다. 빠른 생쥐하려면, feedi에서 음식을 제거NG 걸이 항상 신선한 케이지에 생쥐를 놓습니다. 이것은 이전에 자신의 새장에 떨어진 있습니다 식품의 잔여 비트에서 마우스를 구분하여 진정한 빠른를 보장합니다. 생쥐의 80 % ~ 90 %가 당뇨병이 될 수 있도록 계획을 세우십시오.
- 빠른에 3 시간, 나트륨 구연 산염 버퍼를 준비합니다. 효소 학년 나트륨 구연 산염의 0.735g을 무게 (나 구연 산염, 미스터 294.10 g / 몰) 및 멸균 탈이온수의 25mls에 용해. HCL을 사용하여 4.5 산도를 조정합니다. 이 버퍼는 실험의 각 라운드 신선한하여야한다.
- 1.5ml 튜브에 Eppendorph 플레이스 0.05g Streptozotocin (STZ, M R 265.2 g / 몰). 이 금액은 약 8 생쥐에서 당뇨병을 유발하기 충분하다. 주입하는 생쥐의 번호를 1.5ml 튜브의 적절한 숫자를 준비합니다. STZ가 민감한 빛 때문에, 알루미늄 호일 각 튜브를 커버.
- 빠른 4 시간 후, 갓 버퍼 구연 산염 나 만들의 1ml와 STZ 중 하나 튜브를 resuspend. 일단 resuspended, STZ - 나의 구연 산염 솔루션 15 ~ 20 분 이내에 작업을 잃고, 그래서이 단계는 생쥐를 주입하기 전에 즉시 수행하여야한다.
- 마우스를 190mg/kg의 마지막 복용량을 달성하기 STZ - 나의 구연 산염 솔루션의 적절한 볼륨 각 마우스 intraperitoneally을 주사. 이 선량은 변형 마우스의 연령에 따라 다를 수 있으므로 너무 많은 쥐가 다음 주사 3~5일에 죽어있다면 당뇨병의 발병률이 너무 낮거나면 그것은 선량 최적화를 수행하기 위해 필요할 수 있습니다. 일반적인 복용량은 250mg/kg 마우스 마우스를 150mg/kg에서 범위를 사용합니다.
- 모든 마우스가 주입되고 나면 먹이와 물을 공급한다.
- 비 금식 고혈당증에 대한 테스트 마우스 2-4일 사출 후 (> 350mg/kg). 비 금식 고혈당증 3 일 연속을 보여주 생쥐 이식받는 사람으로 사용할 수 있습니다.
- 이식에 대한 아일 레츠 준비
- 4.0 단계 2.0에서 위에서 설명한 아일 레츠를 분리. 필요한 경우, 아일 레츠는 이식이나 전날에 격리 수 있습니다.
- 무균 1.5ml Eppendorph 튜브에 그들을 배치하여 이식에 대한 그룹으로 아일 레츠를 선택하십시오. 얼음 튜브 보관하십시오. normoglycemia를 복원하는 데 필요한 아일 레츠의 숫자는 실험 (아일릿 기증자 스트레인, 무게와 수신자의 변형, 그리고받는 사람에게 주어진 추가 치료)와 아일 레츠를 따기있는 사람의 조건을 주어 다를 수 있습니다. 받는 마우스의 크기가 큰 쥐가 더 아일 레츠를 필요로하므로, 최소한의 아일릿 번호에 영향을 미치는 한 가지 주요 변수이다. 우리는 지속적으로 300 아일 레츠 이상이 C57BL / 6 마우스를받는 20g에 18 치료하는 동안 150-250 아일 레츠는 marginally normoglycemia을 복원 것을 발견했습니다. 이 실험에서, 아일릿 기증자 마우스 C57BL / 6 또는 Balb / C도 있었다
- subcapsular 신장 주머니에 이식 아일 레츠
- 다음 자료 (모든 수술기구를 소독해야합니다)를 조립 :
표 1. 이식을위한 장비25μl 해밀턴 주사기 한쪽이 beveled되도록 PE 50 유연한 튜브의 6 "컷 젤 로딩 및 p200 피펫 팁 무균 Eppendorph 튜브 (수신자 당 1) Isoflurane 및 Isoflurane 기화기 Eppendorph 튜브 랙 맥퍼슨 - Vannas 가위 (1) 벤트 암 포셉 (2) Hemostats (1) 클립 상처 클립 27 게이지 바늘 화염 * 유리 모세관의 프로브를 뽑아 커튼 applicators를 스쳐 멸균 PBS의 50ml 원뿔 튜브 봉합 전기 가위 70 % 에탄올 스프레이 병 볼펜 Betadine 투명한 플라스틱 무균 드레이프
* 참고 :이 프로브를 비교할 때, 마우스 신장의 각도를 모방 프로브에 원호를 만들려고. 또한, 탐침의 끝 부분이 충분히 더 날카로운 가장자리가 존재하지 않도록 광택 골조 있는지 확인합니다. - 무게 및 모든 당뇨병받는 마우스 태그. 각 그룹은 마찬가지로 몸의 무게를 일치가되도록 사전에 이식하는 실험적인 그룹에 각각 마우스를 할당합니다.
- Isoflurane 기화기에서 가스 배출구를 갖춘 오픈 프론트 후드 내에서 수술 필드를 설정합니다.
- 전기 가위로의 측면을 면도 후 isoflurane과 함께받는 마우스를 마취. 이식이 수행되는 지역 밖에서 마우스를 면도.
- 마취와 위치 면도 측면가 직면 그래서가 직접 유리 막대의 축을 통해 수직 거짓말 마우스를 반환합니다. 70 % 에탄올로 스프레이 플랭크. 마우스 betadine과 알코올이 세 번 반복 교대의 수술 스크럽과 함께 준비되어야하는 것입니다. 면도 측면에 대한 액세스를 허용 취소 무균 드레이프와 마우스를 내리면 t.
- 마우스 anesthetized되는 동안 이식에 대한 아일 레츠를 준비합니다. 다음 단계를 완료하여이 작업을 수행합니다.
- 팁의 좁은 끝에 U 모양을 만드는 부드러운 벤드가 있도록 1.5ml Eppendorph 튜브의 개통에 살균 젤 로딩 팁 놓으십시오. 팁의 개통은 밖으로 Eppendorph 튜브의 직접 직시해야합니다. 이 아일 레츠 및 이식 아르 아일 레츠의 수를 감소의 전단집니다로 겔 로딩 팁 어느 시점에서 꼬임을 소개하지 마십시오.
- 부드럽게 얼음 단계 5.2.2에서 준비되었다 아일 레츠의 튜브를 제거합니다. 아일 레츠 모든 튜브의 하단에 정착되어야합니다. p200의 피펫을 사용하여 부드럽게 튜브의 바닥에서 최소 볼륨에서 아일 레츠를 수집합니다. 5.3.6.1 단계에서 준비 겔 로딩 팁의 큰 개방을 통해 이러한 아일 레츠을 전송합니다. 아일 레츠는 겔 로딩 팁의 좁은 길이 또는 폭이 좁은 제한에 정착한다.
- 아일 레츠가 sedimented 후, 가능한 한 겔 로딩 팁에서 많은 미디어를 제거합니다. 이것은 아일릿 베어링 겔 로딩 팁의 큰 개방을 통해 미디어를 aspirating하여 p200 피펫에 연결된 새로운 젤 로딩 팁을 사용하여 수행할 수 있습니다.
- PE 50 유연한 튜브 (~ 15cm 길이)에 sedimented 아일 레츠을 전송합니다. 이것은 먼저 p200의 피펫으로 팁을 부착하기 전에 아일릿 베어링 겔 로딩 팁의 좁은 개방에 튜브가 아닌 beveled 엔드를 부착하여 수행할 수 있습니다. 아일 레츠 그런 다음 튜브의 길이의 60 %를 강요 수 있습니다.
- 25μl 해밀턴 주사기에 아일릿 베어링 PE 50 튜빙을 전송합니다. 주사기의 플런저가 튜브를 전송하기 전에 철회되어 있는지 확인하십시오. 주사기의 바늘에 PE 50 튜브의 비 beveled 가장자리를 연결합니다.
- 아일 레츠 떠나 beveled 오프닝에서 약 0.5cm까지 주사기의 플런저를 놓으면 되죠.
- 신장이 아일 레츠를받을 준비가되는 동안 아일 레츠는 튜브의 beveled 개방 근처에 하나의 덩어리로 정착 수 있도록 별도로 주사기를 설정합니다.
- 손가락을 사용하면, 마취에서 마우스의 피부를 통해 신장을 집중. 볼펜의 통로가 직접 신장이 위치하고 척수에 수직 위치에있는 지역의 아래에 있어야합니다.
- 신장이 현지되면 척수 방향 직각으로 바로 그 위에 진피를 통해 2cm 절개를 만들기 위해 맥퍼슨 - Vannas 가위를 사용합니다. 이것은 절개는 복막 벽을 노출됩니다.
- 맥퍼슨 - Vannas 가위는 피부 레이어를 통해 상처와 같은 방향으로 복막 벽을 통해 1cm 절개를 함께. 이 절개 만든 자리가 신장이 노출되는보다 작아야 것이 중요합니다.
- 역전로 유리 막대의 샤프트를 사용 일에 아래로 눌러 복막 개방을 통해 신장을 강제E 인접한 표면. 오프닝이 신장보다 약간 작은 경우, 신장이 추가 조작이나 연락도없이 안정적으로 마우스의 표면에 개방과 휴식을 통해 찌그러지고합니다. 이 위치는 이후 이식 단계에 최적입니다. 오프닝이 너무 큰 경우, 신장은 어려운 이후 단계를 완료하고, 복막 캐비티에 다시 떨어질 것이다.
- 젖었 면화를 사용하여 얼음 추위 멸균 PBS로 노출된 신장의 표면을 젖은이 작은 주걱 줬지. 이 단계마다 몇 분을 반복 또는 밖으로 건조에서 신장 캡슐을 방지하기 위해 필요.
- 27 게이지 바늘을 사용하여, 오른쪽 측면 쪽을 향해 왼쪽 측면 측면에서 이동하는 신장의 앞쪽에 표면에 걸쳐 신장 캡슐을 통해 0.2cm 절개합니다.
- 불꽃을 사용하면 신장 캡슐 및 신장 실질 사이에 주머니를 만들고, 유리 모세관 튜브 프로브를 뽑아. 단계 5.3.12에서 만든 절개를 통해 프로브를 삽입하여 그렇게하고 신장의 지느러미 - 측면 표면을 따라 사후 방향으로 이동합니다. 이상적인 프로브는 신장의 표면의 자연 아크 일치 안에 벤드됩니다. 이 탐사선이 큰 앞쪽에 오프닝을 열고 찢어 않고 신장의 가장 뒷부분 끝을 도달할 수있을 것입니다. 긴 가능한 좁은으로 주머니를하는 것이 중요합니다. 그들이 아일 레츠는 캡슐에서 탈출하도록 같은 짧은 광범위한 파우치가 적합하지 않습니다. 좁고 긴 파우치는 아일 레츠가 capsular 주머니에서 최소한의 손실로 신장의 뒷부분 끝쪽으로 입금 될 수 있습니다.
- 5.3.6 단계에서 준비한 25μl 해밀턴 주사기를 검색하고 유연한 튜브 beveled 개방의 매우 가장자리에 아일 레츠 이동합니다.
- 단계 5.3.13에서 준비한 subcapsular 주머니에 유연한 튜브의 beveled 가장자리를 넣습니다. beveled 가장자리는 긴 가장자리는 신장 실질 조직과 접촉되도록, 최대 직면해야합니다. 캡슐의 가장 뒷부분 끝에 튜브를 이동합니다.
- 천천히 주사기의 플런저를 우울하여 subcapsular 주머니에 PE 50 관에서 아일 레츠를 전송합니다. 아일 레츠는 침전 수 아일 레츠에 대한 더 많은 공간을 만들어보세요 천천히 다시 유연한 튜브를 주머니를 채울 때. 모든 아일 레츠이 주머니에 튜브에서 전송 있는지 확인합니다. 공기 또는 초과 액체로 주머니를 채우는하지 마십시오.
- 주머니에서 PE 50 튜브를 제거 후, 불꽃이 부드럽게 주머니의 근위 끝에 아일 레츠 짐을 유리 모세관 튜브 프로브를 뽑아 사용합니다. 방향을 사후에 앞쪽에 이사 신장의 외부 표면을 따라 유리 프로브를 슬라이딩하여이 작업을 수행합니다. 너무 단단히 수 있습니다 파열 subcapsular 주머니의 사후 엔드로 아일 레츠를 싸서 아일 레츠를 공개하지주의하시기 바랍니다. 이 단계는 신장이 복막 구멍 안으로 배치하는 주머니의 앞쪽에 열 아일 레츠의 손실을 최소화합니다.
- 벤트 암 포셉는 PBS 젖었 면화를 사용하여 다음 신장을 위해 만든 구멍에 인접한 복막 안감 채취해서 사용하면 부드럽게 복막 구멍에 다시 신장을 밀어 작은 주걱을 밀고.
- 피부 레이어 복막 벽과 상처에 클립으로 봉합을 적용하여 마우스를 닫습니다.
- 나머지 생쥐에 대한 5.3.19 통해 케이지와 단계를 반복 5.3.4 마우스를 반환합니다. 마우스가 완전히 마취에서 회복까지 생쥐는 새장 아래 손난로 또는 보호 눈으로 난방 램프로 따뜻하게 보관해야합니다. 동물은 물 (6 MG / ML)에 acetominophine와 함께 제공되어야합니다.
- 나중에 비 공복 혈당 수준의 24 시간을 확인합니다. 모든 마우스는 수술 일 (POD) 1 (혈당 <200mg/dl) normoglycemic해야합니다.
- 다음 자료 (모든 수술기구를 소독해야합니다)를 조립 :
6. 대표 결과
두 가지 주요 절차는이 프로토콜에 설명되어 있습니다 : (1) 아일릿 절연 및 신장 캡슐 이하 (2) 아일릿 이식. 아일릿 절연 절차에서 아일릿 수확량은 일반적으로 나이와 변형에 따라 마우스를 당 100-150 아일 레츠 사이의 범위. 췌장의 exocrine 세포에서 그들의 분리에 관하여이 아일 레츠의 순도는 각각 준비 사이에서 광범위하게 다를 수 있습니다. 그러나 단계 3.3.7 및 3.3.17 단계에서 0.1mm 나일론 필터에 실내 온도 Histopaque1077의 사용은 일반적으로 아일 레츠의 이상 99 % 순도에 대한 수 있습니다. 이 순결은 아일 레츠의 추가 손으로 따기 전에 이루어진다. 아일 레츠 다음과 고립의 대표 이미지는 그림 8D에 표시됩니다. 이러한 이미지에서 볼, 아일 레츠는 일반적으로 거친 주변 테두리 즉시 다음과 같은 고립 있습니다. 그러나 문화 시간, 건강한 아일 레츠는 확보하고 부드러운 테두리 (그림 8D)을 유지합니다. 일부 아일 레츠에서는 중앙 괴사 지역, 개발합니다핵심에 어두운 지역으로 나타나는. 시간 경과 영상 (보충 비디오 1)로 촬영한로 괴사성 센터는 자주 아일릿에서 퇴학입니다. 나머지 아일 레츠는 중앙에 홀로 (데이터가 표시되지 않음) 그리고 아마도 기능성 표시되지 않습니다. 따라서, 우리는 그 손을 따기 과정에서 어두운 센터 아일 레츠을 제외할 수 있습니다. 중요한 것은, 우리는 고립 절차에 따라 저온 보육 (단계 4.2)이 극적으로 시간이 지남에 따라 문화 중심 괴사을 개발합니다 아일 레츠의 수를 줄일 수있는 것으로 나타났습니다.
아일릿 이식 절차에서는 두 단계는 중요한 위치 : 당뇨병과 신장 하위 캡슐 영역에 아일 레츠의 제공 화학 유도. 당뇨병 유도 들어, 목표는 STZ - 주입된 생쥐보다 90 % 이상의 hyperglycemic를 달성하는 것입니다. 이 마우스는 몇 주 동안 이식하지 않고 살아남을 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 STZ의 최적 투여량은 마우스 변종과 나이에 따라 다릅니다하고, 실험적으로 결정되어야합니다. 우리는 체중을 20mg/kg로 작은 차이가 큰 차이를 만들 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서 좁은 간격과 적정가 진행되어야합니다. allogeneic, syngeneic 면역 및자가 면역 질환 allogeneic syngeneic, : 아일릿 이식의 경우, 주요 고려 네 면역 컨텍스트를 가질 수 모델입니다. syngeneic 모델에서 기증자 변형이받는 부담과 동일합니다. 따라서 아일 레츠는받는 사람의 적응형 - 면역 반응을 호출하지 것이다. 이것은 연구자 둘러싼 문제를 조사할 수있는 "기본 이외의 기능을,"장애와 수신자가 특정 면역 거부 반응이 아닌 다른 이유로 인해 손실을 아일릿를 참조 용어입니다. 기본 이외의 기능은 초기 이식 단계에서 euglycemia를 달성하기 아일 레츠 많은 (≥ 2 pancreata / 환자)의 요구 사항에 대한 아일릿 실패의 주된 이유로 생각됩니다. 그러므로, 그것은 아일릿 이식을위한 중요한 문제입니다. 이 모델, 완전히 normoglycemia을 사용해야하고 생쥐는 일반적으로 1 ~ POD POD 7, 이식 다음과 같은 초기 단계에 혈당에 대해 검사해야 복원되지 않는 한계 아일릿 질량에. 우리의 경험에서 아일 레츠의 한계 질량은 일반적으로 150 사이 생쥐의 C57BL / 6 변형을 사용하여 20g받는 사람 당 250 평균 크기 아일 레츠입니다. syngeneic 모델로, 하나는 특정 변조가 이식 후 초기 단계에서 아일 레츠의 치료 효능에 영향을 미치는지를 테스트하는 유전자 또는 pharmacologically 수정 아일 레츠를 사용할 수 있습니다.
allogeneic 및 면역 모델에서 아일릿 이식은 호스트 T - lymphocytes, B - lymphocytes, 다른 면역 세포를 포함 적응형 - 면역에 의해 특정 면역 공격에 노출되어 있습니다. 적응형 - 면역력이 지연 면역 반응이며 이식은 기본이 아닌 기능의 영향을 최소화하기 위해 후 분석이 응답을 위해, 그것은 효과적으로 초기 단계에 normoglycemia을 복원 아일 레츠의 포화 번호를 이식하는 것이 필요합니다. 아일 레츠가로 이식 거부에 아일 레츠의 변경의 효과를 결정하기 위해 normoglycemia의 손실에 의해 표시 거부되기 전에 한 다음 시간을 모니터링할 수 있습니다. 우리의 경험에서 큰 300 아일 레츠는 20g 마우스 따라 필요하고 15-21일은 기증자와 같은 Balb / C를 사용하여 allogeneic 이식에 대한 거부의 시간 (H - 2 D)입니다 C57BL / 6 (H - 2 B)로 수신자.
그림 1. 일반적인 담즙 덕트의 십이지장 오프닝을 찾기. 간장에서 배수 내생 소화 효소가 췌장 및 담즙 방광은 십이지장에서 창자를 입력하기 전에 일반적인 담즙 관을 통해 전달합니다. 압력이 외부의 유체를 추가하여 시스템에 적용되는 경우에는이 덕트를 통해 흐름의 방향을 바꿔서 수 있습니다. 이것은 전체와 팽창되는 췌장에 발생합니다.
그림 2. 일반적인 담즙 덕트의 십이지장 오프닝을 클램핑. Liberase과 췌장을 채우기 위해서는, 그것은 일반적인 담즙 덕트의 십이지장 열기를 차단하는 것이 필요합니다. 이것이 제대로 실현되지 않는 경우, Liberase 대신 췌장의 창자를 채울 것입니다.
그림 3. 횡경막을 간 재배치는 일반적인 담즙 덕트의 근위 지역의 시각화 수 있습니다. 그것이 (2.3.1에서 설명한 V - 모양의 합류에서)의 근위 끝 가까이에 시도하는 경우 일반적인 담즙 덕트의 Cannulation는 가장 성공적으로 형성될 수 있습니다.
그림 4. '무료로 일반적인 담즙 덕트를 Cannulating손 '방법입니다. 십이지장을 통해 고정되어있는 hemostat이 마우스의 뒷부분 끝 부분 뽑아 때 일반적인 담즙 덕트의 합류가 표시됩니다. 덕트 cannulation이 합류에서 27 게이지 바늘을 배치하고 그것을 통해 운전에 의해 달성될 수있다.
그림 5. 의한 일반적인 담즙 덕트를 Cannulating 방법 '을 포셉 방어. 텍스트, 때로는 덕트를 둘러싼 fascial 조직이 어려운 cannulate 수 있습니다 언급했듯이. (A) 이러한 경우에는, 그것은 27 게이지 바늘로 얼굴 레이어를 지우 유용합니다. (B) 덕트 다음 명확하게 시각 및 구부러진 팔 포셉 한 켤레에 의해 지원하실 수 있습니다. (C) 역전으로 포셉를 사용하여 27 게이지 바늘이 Liberase의 제공을위한 덕트에 삽입하실 수 있습니다.
그림 6. 췌장도 확장 최적의 바늘 위치를 나타냅니다. 덕트 및 주변 fascial 조직의 투명한 자연을 감안할 때, 어떤 경우에는 그것은 사실이되지 않은 경우 덕트가 cannulated 것으로 나타날 수 있습니다. 이러한 경우가 발생하고 바늘이 췌장 캡슐에 침투하면, 췌장의 십이지장 지역 Liberase 배달시 확대됩니다. 그러나, 전체 췌장은 perfused되지 않습니다이 낮은 아일릿 수율집니다. 이 문제를 피하려면, 특히 복부의 앞쪽에 부분에 붙어있는 췌장의 영역을 입력 효소의 흔적을 찾고하여 췌장도 확장보세요.
그림 7. perfused 췌장을 제거. 마우스의 췌장을 제거하려면 내장과 접촉의 여러 지점은 고장해야합니다. (AB) 내장에서 췌장을 분리합니다. (C) 위에서 췌장을 분리합니다. (D) 내장에서 췌장을 분리합니다. (EF) 복막 캐비티와 함께 남아있는 연락처를 자르고.
그림 8. 아일 레츠 대표 이미지. 아일 레츠의 상대적인 순도와 품질은 격리 절차의 완료시 미세 추정 수 있습니다. 목표는 췌장에서 아일 레츠 정화하는 동안 (A), exocrine 세포 파편이 가끔 존재합니다. (B) 아일릿 고립의 스트레스는 아일릿 주변에서 세포의 아일 레츠와 sloughing의 어두운 중심 지역으로 명부를 세포 죽음을 유도하실 수 있습니다. (C) 실험 아일 레츠를 수확하면, 오염 exocrine 세포를 채취하지 마십시오. (D) 아일 레츠 문화 시간과 외관으로 변경합니다. 아일 레츠는 고립에서 복구로, 그들은 부드러운 주변 표면을 취득. 때때로 큰 아일 레츠의 어두운 중심 지역 표시됩니다. 이러한 세포들은 세포 죽음에 대한 긍정적인 얼룩.
포스트 절연 아일 레츠의 보충 비디오 1. 시간 저속 현미경. 이 16hr 시간 경과 비디오에서 아일 레츠는 궁극적으로 배출 아르 괴사성 센터 개발을 볼 수 있습니다. 주십시오 비디오를 보시려면 여기를 클릭 .
Discussion
위의 섹션에서, 우리는 마우스 췌장 아일 레츠를 분리하고 이식에 대한 자세한 단계를 설명했다. 여기서는 간략하게 절차의 성공을 위해 중요 단계를 강조 표시합니다.
1. 아일릿 절연
주요 단계는 37 후 일반적인 담즙 덕트 (2.3), 췌장의 힘차게 흔드는 걸 cannulating, 일반적인 담즙 덕트 (2.2.3)의 십이지장 개방을 통해 hemostat 클램프를 위치, 최적의 효소 소화 시간 (1.4) 식별 ° C 다이제스트 (3.2) 및 exocrine 세포 오염 (3.3.7 및 3.3.16)의 제거. 이 단계 아일 레츠의 품질, 수율과 순도에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 아마 가장 기술적으로 어려운 단계는 일반적인 담즙 덕트의 cannulation입니다. 많은 생쥐에서 일반적인 담즙 덕트는 주변 근막에 의한 시각화하기 어려울 수 있습니다. 따라서, 그것은 시도는 근막 조직의 침투에있는 일반적인 담즙 덕트 결과를 cannulate에게 일반적입니다. 이러한 경우에는 Liberase는 주위 결합 조직을 채우기 시작과 췌장을 perfuse하지 않습니다. 이것이 관찰되면, Liberase의 흐름을 중지하고 담즙 덕트의 루멘으로 침투되도록 바늘을 조정. 연습을 통해 빨리 바늘 배치를위한 최적의 위치를 파악하고 분쇄가 용이한 덕트를 손상하지 않고 cannulation을 완료 할 수 있습니다.
2. 아일릿 이식
중요한 단계는 당뇨병 (5.1)의 STZ 유도 및 subcapsular 파우치 (5.3.14-5.3.16)에 아일 레츠의 효율적인 전달됩니다. STZ은 인슐린 secreting 세포 아일 레츠 9 β - 세포에 선택적으로 독성 자연스럽게 발생 포도당 아날로그입니다. 그러나,이 선택적 독성은 상대적으로 좁은 농도 범위에서 발생합니다. 이것은 STZ의 다량으로 복용는 고혈당증의 부재에서 급속한 (2-3 일) 파괴 장면을 보여 주죠 초래할 수있다는 사실에 의해 입증됩니다. 따라서, 어떠한 대규모의 실험이 시작되기 전에 사용중인 마우스의 변형과 시대에 STZ 최적의 복용량을 식별할주의 주의해야한다. subcapsular 주머니에 아일 레츠의 실제 배달도 중요한 단계입니다. 일관된 결과를 달성하기 위해, 그것은 그들의 배달하는 동안 아일 레츠의 손실을 최소화하기 위해 필수적입니다. 주입 부피가 너무 큰 경우이 결함이나 주머니를 덮고있는 신장 캡슐에 눈물이 있거나 경우에 발생할 수 있습니다. 캡슐을 손상하고, subcapsular 주머니를 준비하는 부드러운 유리 프로브를 사용하여 온화하고 신중 조작에 의해 피할 수 있습니다. 또한, 사출 볼륨이 단계 5.3.6.3에서 뜨는주의 제거와 최소화할 수 있습니다. 뜨는이 sedimented 아일 레츠의 수준까지 제거하는 경우, 일반적으로 400-500 아일 레츠를 배치하는 subcapsular 주머니에 충분한 공간보다 더있다. 사출 볼륨이 너무 큰 경우에는, 아일 레츠는 실험의 재현성을 손상, 장기 이식 과정 주머니 밖으로 누출 가능성이 더 높습니다.
이 프로토콜 내에서이 단계의 일부를 수정하고 여전히 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다. 이들은 다음과 같습니다 (A) 췌장을 소화하기 위해 다른 효소의 사용, 췌장에 효소를 전달하기위한 (B) 다른 방법, (C) 연속 Ficoll - 나트륨 - diatrizoate (FSD) 그라디언트의 사용 대신 하나의 밀도 Histopaque1077 단계, 그리고 신장 subcapsule 이외의 위치 (D) 아일릿 이식니다.
- 이 프로토콜에서는 Liberase는 췌장 내의 세포 세포 접촉을 약하게하는 데 사용됩니다. Liberase은 기본적으로 높은 췌장에서 아일 레츠를 방출에 유용 증명 collagenases을 정화의 혼합물이다. 그러나, 덜 정제된 collagenases는 비슷한 결과를 달성 할 수 있습니다. 따라서 한 소화 상태가 높은 아일릿 품질을 달성하기 위해 최적이므로, 수율과 순도, 췌장을 소화에 대해 다른 상용 효소 준비를 사용할 수 있습니다.
- 그것은 효소의 ductal 재관류없이 췌장을 소화하는 것도 가능합니다. 일반적인 담즙 덕트를 통해 Liberase의 배송은 효소로 췌장 표면 영역의 최대한의 노출을 허용합니다. 췌장 및 손상 아일 레츠보다 릴리스보다 소화도이 결과를. 그러나 효소로 췌장의 표면 영역을 증가하기 위해 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Liberase에서 잠복기하거나 직접 췌장 캡슐을 통해 Liberase를 주입하기 전에 닦지 췌장은 아일 레츠를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, Liberase 전달의 다른 방법은 일반적인 담즙 덕트를 통해 재관류만큼 효과가 없다. 따라서, 닦지 또는 직접 분사는 일반적인 담즙 덕트가 손상 perfusable되지 않을 경우 최후의 수단으로 예약해야합니다.
- exocrine 세포에서 아일 레츠 분리에 대한 다른 방법은 관련된Histopaque1077 10 대신 FSD 그라디언트 중 하나를 사용하십시오. 이 프로토콜의 exocrine 세포에서 아일 레츠의 효율적인 분리는 부분에 두 세포 유형 간의 밀도 차이에 의한 것입니다. Histopaque1077 25에서 1.0771 g / ML의 밀도 ° C. 있습니다 이 온도에서 Histopaque는 아일 레츠하지만 exocrine 세포보다 밀도보다 밀도이다. 따라서, 원심 분리, Histopaque1077 쥐똥 exocrine 세포의 힘 아래 표면에 아일 레츠 리프팅하는 동안. 원칙적으로, exocrine 세포에서 아일 레츠 분리 수있는 밀도 다른 물질이 단계에서 사용되며 FSD 그라디언트는 하나의 물질 수있다.
- 아일 레츠 이식의 위치와 관련하여,이 프로토콜에서 사용되는 신장 캡슐은 몇 가지 사이트 중 하나입니다. 신장 subcapsule 생쥐에 이식 중 가장보고 사이트이지만 다른 이식 사이트는 효율적으로 발견하고 그들은 간장 포털 정맥, subretinal 공간, testis, epididymal 지방 패드, 비장, 심지어 췌장 11-14를 포함하고 있습니다. 이러한 각각의 위치는 자신의 장점과 도전을하고 있습니다. 따라서, 아일릿 이식에 대한 사이트의 선택은 해결 질문 및 실험 특정 상황에 의해 결정되어야합니다.
그것은 아일릿 이식의 한계를 극복 할 수 전략은 크게 그 치료 가능성을 향상시킬 것으로 생각됩니다. 따라서,이 프로토콜에 의해 세부로 murine 모델의 사용은 이러한 전략을 확인을위한 매력적인 접근법을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 RO1 DK064938 (TH)를 지원합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Liberase TL | Reagent | Roche Group | 05401020001 | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Histopaque1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Penicillin Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Sodium Citrate | Reagent | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Streptozotocin | Reagent | Sigma-Aldrich | S-0130 | |
| HCl | Reagent | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Isoflurane | Reagent | Vedco, Inc. | ISOSOL | |
| Glass Capillary Tubes | Equipment | Fisher Scientific | 22362574 | |
| Insulin Syringe | Equipment | BD Biosciences | 329461 | |
| 27 Gauge Syringe Needle | Equipment | BD Biosciences | 305109 | |
| Hamilton Syringe #1702 | Equipment | Fisher Scientific | 14813133 | |
| 10cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 6cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 07770212 | |
| 6-0 Suture | Equipment | Ethicon Inc. | 8726H | |
| PE 50 Flexible Tubing | Equipment | Fisher Scientific | NC9083963 | |
| 5ml Disposable Syringe | Equipment | BD Biosciences | 309603 | |
| 50ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352098 | |
| 15ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352097 | |
| 0.1mm Nylon Mesh | Equipment | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.419mm Wire Mesh | Equipment | Newark Wire Cloth Company | 0300241 | |
| Water Bath Incubator | Equipment | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| Dissecting Microscope | Equipment | Carl Zeiss, Inc. | Stemi SV6 | |
| Inverted Microscope | Equipment | Nikon Instruments | TMS | |
| Tissue Culture Incubator | Equipment | Napco | 6300 | |
| Dissecting Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS14393 | |
| McPherson-Vannas Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS500260 | |
| Curved Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS15915 | |
| Hemostatic Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS 500451 | |
| Isoflurane Nebulizer | Equipment | Smiths Medical | ISOTech 4 OHMEDA | |
| Swing Bucket Centrifuge | Equipment | Dupont – Sorvall | RT6000D | |
| Swing Bucket Rotor | Equipment | Dupont – Sorvall | H1000B | |
| pH Meter | Equipment | Mettler Toledo | 09313509 | |
| Gel Loading Tips | Equipment | Fisher Scientific | 05408151 | |
| p200 Tips | Equipment | USA Scientific, Inc. | 111-0730 |
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