Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Summary

Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een atmosferische druk ionenbron voor massaspectrometrie. In de beeldvorming modus, een mid-infrarood laser peilt naar de verdeling van moleculen over een tissue sectie of een biofilm. Deze techniek biedt een nieuwe aanpak voor de diverse bio-analytische studies onder autochtone experimentele omstandigheden uitgevoerd.

Abstract

Ambient ionisatie massa spectrometrie methoden in staat analytisch onderzoek direct worden uitgevoerd op een tissue of biofilm onder natieve-achtige experimentele omstandigheden. Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een dergelijke ontwikkeling en is bijzonder goed geschikt voor het onderzoek van water-bevattende monsters. LAESI maakt gebruik van een mid-infrarode laserstraal (2,94 micrometer golflengte) te prikkelen de watermoleculen van het monster. Wanneer de ablatie fluence drempel wordt overschreden, wordt het monstermateriaal verdreven in de vorm van fijn stof en deze projectielen reizen naar tientallen millimeters boven het monster oppervlak. In LAESI, wordt deze ablatie pluim onderschept door sterk geladen druppeltjes met een fractie van de uitgestoten monstermateriaal te vangen en de chemische bestanddelen te zetten in gas-fase ionen. Een massa-spectrometer uitgerust met een atmosferische druk ionenbron-interface wordt gebruikt om te analyseren en registreren van de samenstelling van de vrijgekomen ionen afkomstig uit de peilden gebied (pixel) van het monster. Een systematische ondervraging over een reeks van pixels opent een weg voor de moleculaire beeldvorming in de microprobe analyse-modus. Een uniek aspect van LAESI massaspectrometrische beeldvorming is diepte profilering dat, in combinatie met de laterale beeldvorming, maakt het mogelijk drie-dimensionale (3D) moleculaire beeldvorming. Met de huidige zijdelingse en diepte resoluties van ~ 100 micrometer en ~ 40 um, respectievelijk, LAESI massaspectrometrie imaging helpt bij het verkennen van de moleculaire structuur van biologische weefsels. Hierin bespreken we de belangrijkste elementen van een LAESI systeem en geven richtlijnen voor een succesvolle imaging experiment.

Protocol

Het volgende protocol beschrijft de belangrijkste stappen van de laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) experiment en geeft representatieve voorbeelden voor laterale en drie-dimensionale (3D) beeldvorming voor dieren en planten weefselmonsters. Extra experimentele en technische details kunnen worden verkregen van elders. ^1-6

1. Tissue Voorbereiding en montage

1. Als het snijden nodig is, een cryomicrotoom te gebruiken om de sectie weefsel in 10 tot 100 micrometer dikke plakken bij -10 tot -20 ° C, tenzij anders aanbevolen voor een bepaald weefsel type.
2. Monteren delen op een vlakke ondergrond (bijvoorbeeld chemisch gereinigd pre-glasplaatje) rechtstreeks, zonder chemische modifiers. Voor de coupes weefsels, dooi-mount de secties en zet de sample houder een Peltier-koeling fase onmiddellijk na dooi-montage aan het weefsel bevroren te allen tijde tijdens de analyse te houden. Deze stap is nodig om een ​​minimum te beperken / voorkomen moleculaire migratie in de sectie.
3. Indien nodig, gebruik dan een koellichaam is uitgerust met een low-power ventilator warmte-afvoer te vergemakkelijken van de Peltier-stadium te houden het weefsel bevroren.
4. In een vochtige omgeving over een langere periode van tijd (1-2 uur), te inspecteren voor de condensatie van water of ijs op het weefsel oppervlak. Condensatie van waterdamp op het weefsel beïnvloedt nadelig de imaging prestatie in LAESI experimenten. ¹
5. Indien nodig, gebruik dan een kamer ontvochtigingstoestel of plaats de gekoelde monster in een milieu-kamer gevuld met een inert gas (bijv. droge stikstof gas) om condensatie te voorkomen. ¹

2. Optimalisatie van de LAESI Ion Bron

De LAESI ion bron bestaat uit een mid-infrarood laser, een reeks van optische elementen voor lichte besturing en gericht alsmede aanvullende steekproef houders, koeling componenten, vertaling podia, en een oplosmiddel leveringssysteem. Figuur 1 toont de typische opbouw van deze elementen met betrekking tot de ingang van de atmosferische druk ionenbron van een massaspectrometer.

1. Zoals geïllustreerd in figuur 1, positie van het monster 15-20 mm onder de opening van de massa spectrometer sampling cone (d _OR-FP).
2. Werken een mid-IR laser op 2,94 micrometer golflengte en 10 Hz herhalingsfrequentie. Het verkleinen van de laser output naar ~ 100 μJ / puls energie.
3. Gebruik een combinatie van goud spiegels en een focus lens transparant op de laser golflengte (bijvoorbeeld een plano-convexe CaF ₂ of ZnSe lens) te koppelen van de laserpuls energie in het monster bij een normale frequentie (zie rechts invalshoek met betrekking tot monster oppervlak in Figuur 1).
4. Positie van het midden-infrarood straal as van 5-8 mm in de voorkant van de opening van de massa spectrometer sampling cone.
5. Pas de focus lens positie en de puls energie van de laserstraal om weefsel te verwijderen bereiken in het brandpunt. De afmetingen van de geablateerd volume bepalen de pixel (voxel of in drie-dimensionale beeldvorming) maat voor de beeldvorming toepassing.
6. Plaats een nanospray zender in lijn met de inlaat as van de massaspectrometer en een doorlaat-to-emitter tip afstand van ~ 10 mm (zie figuur 1).
7. Voor de elektrospray, bereiden 50% methanol-oplossing met 0,1% azijnzuur of 0,1% ammoniumacetaat additief voor positieve of negatieve ion-modus, respectievelijk. Afhankelijk van het monster, overige organische oplosmiddelen, zoals acetonitril, isopropanol, etc., kunnen in plaats van methanol bij concentraties die geschikt is voor de analytische taak. De stabiliteit van de electrospray is cruciaal voor een succesvolle beeldvorming. Afhankelijk van het oplosmiddel selectie, het debiet en de spuiten spanning moeten worden aangepast om stabiele spuiten te bereiken.
8. Voor reactieve LAESI ⁶ in imaging-toepassingen, kan de electrosprayed oplossing bevat reactanten.
9. Gebruik een spuit pomp naar de electrospray oplossing te leveren door middel van de electrospray zender met een debiet van ~ 300 nL / min.
10. Als de massa spectrometer opening wordt gehouden op een laag voltage (<500 V gemeten tegen de grond), het genereren van electrospray door het aanbrengen van hoge spanning direct op de electrospray emitter (bv, 3000 V) of door middel van een metalen verbinding bezitten. Anders, de grond direct de electrospray zender of door metalen vakbond electrospray vast te stellen.
11. Bedien de electrospray bron in kegel-jet spuiten mode voor de meest efficiënte ion generatie door LAESI. Voor het effect van die variabelen op het sproeien modes en hun effect op de massa spectra, elders zie de discussies. ^5,7,8
12. Voorzichtig aan te passen van de relatieve afstanden van de LAESI setup te optimaliseren voor LAESI ion opleveren terwijl de laserstraal, de emitter, en de opening assen in hetzelfde vlak. Gelieve elders vindt gedetailleerde instructies. ⁵
13. Met een optische microscoop, bepalen de laterale afmetingen van de ablatie krater op het monster.
14. Voor drie-dimensionale LAESI imaging experimenten uit te voeren ablatie met individuele pulsen en bepalen de diepte van een voxel gebruikt, bijvoorbeeld, de z-stack mode in optische microscopie. ³

3. Moleculaire Beeldvorming en data-analyse

In de beeldvorming experiment, is het weefselmonster verplaatst in het brandvlak van de laser in de X-en Y-richting met stap groter dan of gelijk aan de afmetingen van de ablatie plek. De ruimtelijke resolutie wordt beperkt door de concentratie van de invallende laserstraal.

1. Selecteer het gebied van de rente op het monster oppervlak en het verkrijgen van de (X, Y) coördinaten van de bijbehorende grenzen.
2. Kies een gridding algoritme (bijvoorbeeld adaptieve grid, geselecteerd gebied imaging, rechthoekig rooster, spiraal patroon, Z scanning, enz.), waarmee het monster oppervlak raster met geselecteerde dwell-tijd op elke pixel op het gebied dat moet worden afgebeeld.
3. Gebruik een drie-assige vertaling podium en software die in staat is rastering de steekproef op basis van de vooraf bepaalde grid.
4. Bereken de totale tijd die nodig is voor de beeldvorming.
5. Schakel de data-acquisitie termijn van de massaspectrometer. Indien dit niet mogelijk is, stelt u de data-acquisitie tijd te beperken tot de berekende beeldvorming tijdswaarde.
6. Start het mid-infrarood laser bron een herhalingssnelheid goed om voldoende signaal-ruisverhouding te produceren in de massa spectrum binnen de dwell time van elke pixel naar een LAESI laterale imaging experiment uit te voeren. Voor 3D moleculaire beeldvorming, gebruik maken van een spectrum overname die hoger is dan de laserbron herhalingsfrequentie met succes massa-analyse van de ionen gegenereerd binnen een enkele laserpuls. Wacht tot de START-signaal naar de ablatie volgorde te starten.
7. Zet de electrospray bron. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing voor de volle tijd die nodig is voor de beeldvorming.
8. Tegelijkertijd starten de overname van massaspectra, de mid-IR-laser ablatie, en het oppervlak scannen.
9. Wanneer de beeldvorming run is voltooid, STOP het oppervlak scannen, de mid-IR stralend, en de data-acquisitie.
10. Schakel de laserbron.
11. Zet de hoogspanning.
12. Schakel de injectiepomp.
13. Stel de massaspectrometer te STANDBY-modus.
14. Zet de Peltier-koeling elektronica.
15. Sluit inert gas stromen als het gebruikt wordt.
16. Gebruik een software om de absolute coördinaten van de pixels in de laterale imaging of de voxels in 3D analyse correleren met de bijbehorende spectra.
17. Plot de ion intensiteit signaal voor een geselecteerde m / z-waarde ten opzichte van de absolute coördinaten van analyse tot zijdelingse-en 3D-moleculaire beelden te verkrijgen.

4. Representatieve resultaten

Figuur 2 geeft representatieve resultaten voor een aantal belangrijke weefseltypen en imaging modaliteiten. Paneel A toont een geval voor een dierlijk weefsel sectie die bevroren is geweest tijdens het experiment om uitdroging te voorkomen. ¹ Daarnaast is de steekproef was gevestigd in een droge stikstof gas-omgeving aan het omgevingslicht water dampen vermijden van condensatie op het monster oppervlak. Een 100-um dikke coronale gedeelte van een rat hersenen (Rattus norvegicus) is zijdelings belicht met LAESI. De anatomische gebieden van de hersenen (zie de optische beeld in paneel A) tonen een goede correlatie met de moleculaire beeld verkregen voor de plasmalogens PC (O-33: 3) en / of PE (O-36: 3) met m / z 728.559.

Panel B geeft de 3D-LAESI beeldvorming van een Zebra plant (Aphelandra squarrosa) bladweefsel. Omdat de bladeren hebben een natuurlijk afweermechanisme tegen uitdroging, kan het monster worden ondervraagd in de omgeving. ³ De verkregen 3D moleculaire beelden bleek een groot aantal distributie patronen voor primaire en secundaire metabolieten. Onder andere werd acacetin met m / z 285.076 ontdekt bij hogere ion telt in de gele sectoren van de tweede en derde lagen van de top met een homogene verdeling in de andere. Deze verdeling is overeengekomen met het patroon van de afwisseling gezien in de optische beeld.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de LAESI systeem (ES, electrospray emitter tip, OF, opening van de massa-spectrometer sampling cone, FL, met de nadruk lens, FP, brandpunt, P, Peltier koeling fase, HS, koellichaam). Een deel van de fijn stof uitgestoten tijdens de mid-IR-ablatie (rode stippen) samensmelt met de elektrospray om geladen druppeltjes bezaaid met moleculen en ionen van het monster (groene stippen) opleveren. De ionen vrijkomen van deze druppeltjes worden geanalyseerd en opgenomen door de massa spectrometer.

Figuur 2. Representatieve resultaten voor laterale en 3D imagi. ng met LAESI massaspectrometrie (A) Het bovenste paneel toont de optische beeld van een rat hersenen (Rattus norvegicus) coronale gedeelte en de moleculaire beeld verkregen voor de plasmalogens PC (O-33: 3) en / of PE (O-36 : 3) met m / z 728.559. De witte schaal balk komt overeen met 1 mm. Aangepast met toestemming van (referentie ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Het onderste paneel toont de 3D-beeldvorming van een blad van een bonte Zebra plant (Aphelandra squarrosa). Acacetin met m / z 285.076 werd gedetecteerd bij hogere ion telt in de gele sectoren van de tweede en derde lagen van de top met een homogene verdeling in de andere. Herdrukt met toestemming van (referentie ^3). Copyright 2009 American Chemical Society.

Discussion

Verschillende weefseltypen vertonen variërende gehalte aan water en de treksterkte, die op hun beurt, kunnen invloed hebben op de ablatie eigenschappen van de monsters. ^Negen Om deze gevolgen te verzachten, is het gewenst dat de laser Fluence, omgang met monsters, en analyse protocollen worden herzien bij het ​​wisselen tussen grote weefseltypen.

Voor enkele cel of hogere resolutie onderzoeken, het midden-infrarood licht kan worden gekoppeld in een geslepen optische vezel in plaats van een focus lens. ¹⁰ Bij het ​​positioneren van de fiber tip in de nabijheid van de geselecteerde cellen in een weefsel, kan LAESI analyse worden uitgevoerd op een single-cell niveau.

Als een label-free ionenbron voor omgevingstemperaturen ionisatie massa spectrometrie, heeft ¹¹ LAESI zien een groot potentieel voor het onderzoek naar de biochemische processen in weefsels. Met de toegevoegde voordelen van een directe analyse, laterale en 3D beeldvorming, LAESI is een opkomende bio-analytische hulpmiddel voor het profileren en grafische toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer	Waters	Q-TOF Premier
Mid-IR laser	Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR