Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Summary

Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eines Atmosphärendruck-Ionenquelle für die Massenspektrometrie. Im Imaging-Modus, ein mittleres Infrarot-Laser-Sonden die Verteilung der Moleküle über einen Gewebeschnitt oder einen Biofilm. Diese Technik stellt einen neuen Ansatz für die unterschiedlichsten bioanalytische Untersuchungen unter nativen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Abstract

Ambient-Ionisation-Methoden in der Massenspektrometrie können analytische Untersuchungen direkt auf ein Gewebe oder Biofilm unter nativ-ähnlichen experimentellen Bedingungen durchgeführt werden. Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eine solche Entwicklung und ist besonders für die Untersuchung von Wasser enthaltenden Proben gut geeignet. LAESI nutzt eine Mitte-Infrarot-Laserstrahl (2,94 um Wellenlänge), um die Wassermoleküle der Probe anzuregen. Wenn die Ablation Einfluss Schwellenwert überschritten wird, wird das Probenmaterial in Form von Feinstaub ausgestoßen und diese Geschosse reisen, um zehn Millimeter über der Probenoberfläche. In LAESI, ist dies Ablation plume von hoch geladenen Tröpfchen abgefangen zu einem Bruchteil der ausgestoßenen Probenmaterial zu erfassen und konvertieren seine chemischen Bestandteile in Ionen in der Gasphase. Ein Massenspektrometer mit einer Atmosphärendruck-Ionenquelle Schnittstelle ausgestattet wird eingesetzt, um zu analysieren und erfassen die Zusammensetzung der freigesetzten Ionen, die aus dem Bereich untersucht (Pixel) der Probe. Eine systematische Befragung über ein Array von Pixeln, öffnet sich ein Weg für die molekulare Bildgebung in der Mikrosondenanalyse Modus. Ein einzigartiger Aspekt LAESI bildgebenden Massenspektrometrie ist Tiefenprofilierung, die in Kombination mit seitlichen Bildgebung ermöglicht dreidimensionale (3D) die molekulare Bildgebung. Mit aktuellen Quer-und Tiefenauflösung von ca. 100 mu m und ~ 40 um, bzw. hilft LAESI bildgebenden Massenspektrometrie, die molekulare Struktur von biologischen Geweben zu erkunden. In diesem Aufsatz haben wir die wichtigsten Elemente einer LAESI und Leitlinien für eine erfolgreiche Imaging Experiment.

Protocol

Das folgende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte der Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Experiment und liefert repräsentative Beispiele für Seiten-und dreidimensionale (3D) Bildgebung für Tier-und Pflanzenarten Gewebeproben. Weitere experimentelle und technische Details können auch anderweitig beschaffen. ^1-6

1. Tissue Vorbereitung und Montage

1. Wenn Schneiden erforderlich ist, verwenden Sie einen cryomicrotome Abschnitt des Gewebes in 10-100 um dicke Scheiben bei -10 bis -20 ° C, sofern nicht anders für einen bestimmten Gewebetyp empfohlen.
2. Berg Schnitte auf einer ebenen Fläche (zB chemisch vorgereinigt Glasträger) direkt und ohne chemische Modifikatoren. Für geschnittene Gewebe, Tauwetter-mount Sektionen und sichern Sie den Probenhalter ein Peltier-Kühlung der Bühne sofort nach Tauwetter-Montage, um das Gewebe zu jeder Zeit während der Analyse eingefroren halten. Dieser Schritt ist notwendig zur Minimierung / Vermeidung molekularen Migration im Abschnitt.
3. Wenn nötig, verwenden Sie einen Kühlkörper mit einem Low-Power-Ventilator, um die Wärmeabfuhr aus dem Peltier-Bühne zu erleichtern, halten das Gewebe eingefroren ausgestattet.
4. In einer feuchten Umgebung über einen längeren Zeitraum (1-2 Stunden), für die Kondensation von Wasser oder Eis auf der Gewebeoberfläche zu inspizieren. Kondensation von Wasser auf das Gewebe nachteilig wirkt sich auf die Abbildungsleistung in LAESI Experimente. ¹
5. Wenn nötig, verwenden Sie ein Zimmer Entfeuchter oder setzen Sie die abgekühlte Probe in einer Klimakammer mit einem inerten Gas (zB trockenem Stickstoff) gefüllt, um Kondenswasserbildung zu vermeiden. ¹

2. Optimierung der LAESI Ion Source

Die LAESI Ionenquelle besteht aus einer mittleren Infrarot-Laser, eine Reihe von optischen Elementen für die leichtgängige Lenkung und Fokussierung sowie zusätzliche Probenhalter, Kühlkomponenten, Übersetzung Stufen und ein Lösungsmittel Delivery-System. Abbildung 1 zeigt die typische Anordnung dieser Elemente in Bezug auf den Eingang des atmosphärischen Ionenquelle eines Massenspektrometers.

1. Wie in Abbildung 1, Position der Probe 15-20 mm unterhalb der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel (d _OR-FP) dargestellt.
2. Betrieb eines mid-IR-Laser bei 2,94 um Wellenlänge und 10 Hz Wiederholrate. Dämpfen die Laserleistung bis ~ 100 uJ / Pulsenergie.
3. Verwenden Sie eine Kombination von Gold Spiegel und eine fokussierende Linse transparent bei der Laserwellenlänge (zB eine plankonvexe CaF ₂ oder ZnSe-Linse) zu koppeln des Laserpulses Energie in der Probe bei senkrechtem Einfall (siehe rechts Einfallswinkel in Bezug auf Probenoberfläche in Abbildung 1).
4. Positionieren Sie den mittleren Infrarotbereich Strahlachse 5-8 mm vor der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel.
5. Passen Sie die Fokussierlinse Position und die Pulsenergie des Laserstrahls auf Gewebeentnahme im Brennfleck zu erreichen. Die Abmessungen des abgetragenen Volumen bestimmt die Pixelgröße (oder Voxel in dreidimensionale Bildgebung) Größe für die Imaging-Anwendung.
6. Position einer Nanospray Emitter im Einklang mit dem Einlass Achse des Massenspektrometers und eine Öffnung-Emitter-Spitze Abstand von ca. 10 mm (siehe Abbildung 1).
7. Für die Elektrospray, bereiten 50% Methanol-Lösung mit 0,1% Essigsäure oder 0,1% Ammoniumacetat Additiv für positive oder negative Ionen-Modus bzw.. Abhängig von der Probe, andere organische Lösungsmittel, wie Acetonitril, Isopropanol, etc., kann Methanol in Konzentrationen geeignet für die analytische Aufgabe zu ersetzen. Die Stabilität der Elektrospray ist Voraussetzung für erfolgreiche Bildgebung. Je nach Lösungsmittel Auswahl, benötigen Sie den Durchfluss und die Spritzen Spannung angepasst werden, um stabile Spray zu erreichen.
8. Für reaktive LAESI ⁶ in Imaging-Anwendungen kann der Elektrospray-Lösung enthalten Reaktanten.
9. Verwenden Sie eine Spritzenpumpe, die Elektrospray-Lösung durch die Elektrospray Emitter liefern bei einer Flussrate von ~ 300 Nl / min.
10. Wenn das Massenspektrometer Öffnung bei einer niedrigen Spannung (<500 V gegen Erde gemessen) gehalten wird, erzeugen Elektrospray durch Anlegen einer Hochspannung direkt an die Elektrospray-Strahler (zB 3000 V) oder durch eine metallene Verbindung. Andernfalls Boden direkt die Elektrospray Emitter oder durch Metall-Gewerkschaft, die Elektrospray etablieren.
11. Betreiben Sie die Elektrospray-Quelle in Kegel-jet Spritzen-Modus für die effizienteste Ionenerzeugung durch LAESI. Für die Wirkung der Betriebsgrößen auf den Spritzen-Modi und ihre Wirkung auf die Massenspektren, siehe Diskussionen anderswo. ^5,7,8
12. Vorsichtig die relativen Abstände der LAESI Setup für LAESI Ionen-Ausbeute zu optimieren und dabei den Laserstrahl, der Emitter und die Öffnung Achsen in der gleichen Ebene. Hier finden Sie detaillierte Anweisungen an anderer Stelle. ⁵
13. Mit einem optischen Mikroskop, bestimmen die lateralen Abmessungen der Ablation Krater auf der Probe.
14. Für die dreidimensionale Bildgebung LAESI Experimente durchführen Ablation mit einzelnen Impulsen und bestimmen die Tiefe eines Voxels mit, zum Beispiel die Z-Stapel-Modus in der optischen Mikroskopie. ³

3. Molecular Imaging and Data Analysis

In der Imaging-Experiment wird die Gewebeprobe in der Brennebene des Lasers in X-und Y-Richtung mit Schritt Größen größer als oder gleich die Abmessungen der Ablation Stelle bewegt. Die räumliche Auflösung ist durch die Fokussierung des einfallenden Laserstrahls begrenzt.

1. Wählen Sie den Bereich von Interesse auf der Probenoberfläche und erhalten die (X, Y) Koordinaten des entsprechenden Grenzen.
2. Wählen Sie einen gridding Algorithmus (zB adaptive Gitter, ausgewählte Region Bildgebung, rechteckigen Raster, spiralförmig, Z Scannen, etc.), mit der die Probenoberfläche mit ausgewählten Zeitpunkt an jedem Pixelverweilzeiten über den Bereich abgebildet werden, um Raster.
3. Verwenden Sie ein Drei-Achsen-Übersetzung Bühne und Software, die in der Lage Rasterung der Probe entsprechend dem vorgegebenen Raster.
4. Berechnen Sie die gesamte Zeit für die Bildgebung erforderlich.
5. Deaktivieren Sie die Datenerfassung Frist des Massenspektrometers. Wenn dies nicht möglich ist, setzen Sie die Datenerfassung Frist auf den berechneten Belichtungszeit Wert.
6. Starten Sie den mittleren Infrarot-Laserquelle mit einer Wiederholrate richtige, um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis im Massenspektrum erzeugen innerhalb der Verweilzeit an jedem Pixel eine LAESI seitlichen Imaging Experiment durchzuführen. Für 3D-molekulare Bildgebung, verwenden Sie ein Spektrum Akquisition höher als die Laserquelle Repetitionsrate erfolgreich Masse-Analyse der Ionen innerhalb eines einzelnen Laserpulses erzeugt. Warten Sie auf die START-Signal an die Ablation Sequenz einzuleiten.
7. Schalten Sie den Elektrospray-Quelle. Stellen Sie sicher, dass es genug für die volle Zeit für die Bildgebung erforderlich.
8. Gleichzeitig START den Erwerb von Massenspektren, die mid-IR Laserablation, und die Abtastung der Oberfläche.
9. Wenn die Bildgebung laufen beendet hat, stoppen Sie die Abtastung der Oberfläche, die mid-IR Lasern, und die Datenerfassung.
10. Deaktivieren Sie die Laserquelle.
11. Schalten Sie die Hochspannung.
12. Schalten Sie die Spritzenpumpe.
13. Set dem Massenspektrometer zu STANDBY-Modus.
14. Schalten Sie das Peltier-Kühlung Elektronik.
15. Close Inertgasstrom, wenn verwendet.
16. Verwenden Sie eine Software, um die absoluten Koordinaten der Pixel in lateraler Bildgebung oder die Voxel in 3D-Analyse mit den entsprechenden Spektren korrelieren.
17. Zeichnen Sie die Ionenintensität Signal für einen ausgewählten m / z-Wert gegen den absoluten Koordinaten der Analyse auf Seiten-und 3D-molekularen Bilder zu erhalten.

4. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für einige wichtige Gewebetypen und bildgebenden Verfahren. Panel A zeigt ein Fall für ein tierisches Gewebe Abschnitt, der während des Experiments, um eine Dehydratation zu verhindern eingefroren wurde. ^{1 Darüber} hinaus wird die Probe in einem trockenen Stickstoff-Umgebung befand auf Umgebungstemperatur Wasserdampf kondensiert auf der Probenoberfläche zu vermeiden. Eine 100-Mikrometer dicke Frontalschnitt vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) wurde seitlich mit LAESI abgebildet. Die anatomischen Regionen des Gehirns (siehe optische Bild in Panel A) zeigen eine gute Korrelation mit der molekularen Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36: 3) mit m / z 728,559.

Panel B zeigt die 3D-Bildgebung LAESI einer Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa) Blattgewebe. Da hinterlässt einen natürlichen Abwehrmechanismus gegen Austrocknung besitzen, könnte die Probe in die Umgebung abgefragt werden. ³ Die erhaltenen molekularen 3D-Bilder zeigten eine Vielzahl von Verteilungsmuster für primäre und sekundäre Pflanzenstoffe. Unter anderem wurde acacetin mit m / z 285,076 bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Diese Verteilung stimmte mit dem Muster der Buntheit in das optische Bild zu sehen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des LAESI System (ES, Elektrospray Emitterspitze, oder Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel; FL, fokussierende Linse; FP, Brennpunkt, P, Peltier-Kühlung Bühne, HS, Kühlkörper). Ein Teil der Partikel während der mid-IR-Ablation (rote Punkte) verschmilzt mit der Elektrospray zu geladenen Tröpfchen mit Molekülen und Ionen der Probe (grüne Punkte) ausgesät Ertrag ausgewiesen. Die Ionen von diesen Tröpfchen freigesetzt werden analysiert und aufgenommen von dem Massenspektrometer.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Quer-und 3D-IMAGI. ng mit LAESI Massenspektrometrie (A) Das obere Feld zeigt das optische Bild vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) Frontalschnitt und die molekulare Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36 : 3) mit m / z 728,559. Der weiße Maßstab entspricht 1 mm. Adaptiert mit Erlaubnis von (Referenz ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Die untere Abbildung zeigt die 3D-Bildgebung eines Blattes aus einem bunten Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa). Acacetin mit m / z 285,076 wurde bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von (Referenz ^3). Copyright 2009 American Chemical Society.

Discussion

Unterschiedliche Gewebetypen weisen unterschiedliche Wassergehalt und Zugfestigkeit, die wiederum die Ablation Eigenschaften der Proben beeinflussen können. ⁹ Um diese Effekte abzumildern, ist es erwünscht, dass die Laserfluenz, Probenhandling und Analyse-Protokolle überarbeitet beim Wechsel zwischen sein wichtigen Gewebetypen.

Für einzelne Zelle oder eine höhere Auflösung Untersuchungen, die Mitte der Infrarot-Licht lässt sich in einem geschärften Glasfaser statt einer fokussierenden Linse gekoppelt werden. ¹⁰ Mit der Positionierung der Faserspitze in der Nähe der ausgewählten Zellen in einem Gewebe, kann LAESI Analyse durchgeführt werden Ein-Zell-Ebene.

Als Label-free-Ionenquelle für Ambient-Massenspektrometrie, hat ¹¹ LAESI großes Potenzial für die Untersuchung der biochemischen Prozesse im Gewebe gezeigt. Mit dem zusätzlichen Nutzen einer direkten Analyse, Quer-und 3D-Bildgebung ist LAESI ein aufstrebendes bioanalytische Werkzeug für die Profilierung als auch Imaging-Anwendungen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer	Waters	Q-TOF Premier
Mid-IR laser	Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR