LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

Summary

レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）は質量分析用大気圧イオン源です。イメージングモードでは、中赤外レーザーのプローブは組織切片またはバイオフィルム全体の分子の分布。この手法は、ネイティブの実験条件の下で実施、多様な生物分析研究のための新しいアプローチを提示。

Abstract

質量分析法で、周囲のイオン化法は、分析調査がネイティブのような実験条件下では組織やバイオフィルム上で直接実行することができます。レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESIは）そのような開発であり、特に水を含む試料の調査に適しています。 LAESIはサンプルの水分子を励起する中赤外レーザービーム（2.94μmの波長）を利用しています。アブレーションのフルエンスのしきい​​値を超過した場合、サンプルの材料は、粒子状物質の形で追放し、これらの発射は、試料表面上のミリメートルの数十に移動される。 LAESIでは、このアブレーションプルームが放出された試料の一部をキャプチャし、気相イオンにその化学成分を変換するために高度に帯電した水滴により代行受信されます。大気圧イオン源のインタフェースを装備した質量分析計は、試料のプローブ領域（ピクセル）に由来する放出イオンの組成を分析し、記録するために採用されている。画素の配列に対する体系的な尋問は微小分析モードでの分子イメージングへの道を開きます。 LAESIの質量分析イメージングのユニークな点は、横方向のイメージングとの組み合わせで、3次元（3D）分子イメージングを可能にする、深さプロファイリングです。 〜100μmであり、それぞれ〜40μmの、の現在の横方向と深さの解像度で、LAESI質量分析イメージングは​​、生体組織の分子構造を探索するのに役立ちます。ここで、我々はLAESIシステムの主要な要素を確認し、成功するイメージングの実験のためのガイドラインを提供しています。

Protocol

次のプロトコルは、レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）実験の主なステップを説明し、動物や植物の組織サンプルの横方向と3次元（3D）イメージングのための代表的な例を示します。追加の実験的および技術的な詳細は他の場所から入手することができます^。1-6

1。組織の準備と取り付け

1. 切片が必要な場合、組織は-20に-10℃10〜100μmの厚さのスライスにセクションにcryomicrotomeを使用° C以外の場合、特定の組織タイプに対して推奨されない限り。
2. 直接化学修飾のない平らな面（例えば、化学的に事前に洗浄したガラススライド）上のセクションをマウントします。分析中にすべての回で凍結組織を維持するために融解マウント時に区分された組織の場合は、セクションを融解マウントし、直ちにペルチェ冷却ステージに試料ホルダーを固定します。このステップは、セクション内の分子移動を最小限に抑える/防止するために必要とされる。
3. 必要に応じて、凍結した組織を維持するためにペルチェステージからの熱除去を容易にする低消費電力ファンを搭載したヒートシンクを使用してください。
4. 長時間（1-2時間）にわたって湿度の高い環境では、組織の表面に水または氷の凝縮のために検査する。組織上の水の結露が不利益LAESI実験の結像性能に影響を与えます^。1
5. 必要に応じて、部屋の除湿機を使用したり、結露を防ぐために不活性ガス（例えば、乾燥窒素ガス）で満たされた環境チャンバー内に冷却サンプルを配置^1。

2。 LAESIイオン源の最適化

LAESIのイオン源は、中赤外レーザー、光ステアリング用光学素子のシリーズと焦点だけでなく、追加のサンプルホルダー、冷却コンポーネント、翻訳の段階、および溶媒送液システムで構成されています。図1は、質量分析計の大気圧イオン源の入り口に関してこれらの要素の典型的な配置を示しています。

1. 図1は、位置、質量分析計のサンプリングコーン（d _{または- FP）}のオリフィス以下のサンプル15〜20ミリメートルに示すように。
2. 2.94μmの波長と10Hzの繰り返し率で中赤外レーザーを操作してください。 〜100μJ/パルスエネルギーのレーザーの出力を減衰させる。
3. レーザーのパルスエネルギーは、試料表面に対して右の入射角を参照してください（垂直入射で試料にカップルに金色の鏡とレーザーの波長（例えば、平凸レンズCaF _2をまたはZnSeのレンズ）で透明な集光レンズの組み合わせを使用して、図1の）。
4. 質量分析計のサンプリングコーンのオリフィスの前で中間赤外線ビーム軸5〜8ミリメートルを置きます。
5. フォーカスレンズの位置と焦点スポットに組織の除去を達成するためにレーザービームのパルスエネルギーを調整します。アブレーションボリュームの大きさは、画像処理アプリケーションのためにピクセル（または三次元画像のボクセル）のサイズを決定します。
6. 質量分析計の入口軸に沿って、と〜10 mmのオリフィスからエミッタ先端の距離（図1を参照）で、ナノスプレーエミッタを配置します。
7. エレクトロスプレーの場合は、それぞれ、0.1％酢酸または正または負イオンモードのための0.1％酢酸アンモニウムの添加で50％メタノール溶液を調製。他の有機溶媒はアセトニトリル、イソプロパノール、などとして、、サンプルに応じて、分析タスクのための適切な濃度でメタノールを置き換えることができます。エレクトロスプレーの安定性は、成功するイメージングのための非常に重要です。溶媒の選択に応じて、流量、スプレー電圧は安定した噴霧を実現するために調整する必要があります。
8. 画像処理アプリケーションの反応性LAESI ⁶の場合は、electrosprayedソリューションは、反応物質が含まれている場合があります。
9. 〜300 NL / minの流量でエレクトロスプレーエミッタを介してエレクトロソリューションを提供するためにシリンジポンプを使用してください。
10. 質量分析計のオリフィスが低電圧（<500 Vグラウンドに対して測定）で保管されている場合は、エレクトロスプレーエミッタ（例えば、3,000 V）に直接高電圧を印加することにより、または金属労働組合を通じて、エレクトロスプレーを生成する。そうでない場合は、エレクトロスプレーを確立するために直接エレクトロスプレーエミッタまたは金属の組合を介してグランド。
11. LAESIで最も効率的イオン生成のためにモードを噴霧円錐ジェットでエレクトロスプレーソースを操作する。噴霧モードとマススペクトルへの影響に関する操作変数の影響については、他の議論を参照してください^。5,7,8
12. 慎重に同一平面上にレーザービーム、エミッタ、及びオリフィスの軸を保ちながらLAESIイオンの収量を最適化するLAESIのセットアップの相対距離を調整する。他の詳細な手順を見つけてください^5。
13. 光学顕微鏡で、試料上のアブレーションのクレーターの横方向の寸法を決定する。
14. 三次元LAESIイメージング実験のために、個々のパルスでアブレーションを行い、例えば、使用してボクセルの深さを決定し、光学顕微鏡のZスタックモード^3。

3。分子イメージングとデータ解析

イメージング実験では、組織試料は、より大きいまたはアブレーションのスポットの大きさに等しいステップサイズのXとY方向のレーザーの焦点面に移動されます。空間分解能は、入射レーザビームの集束によって制限されます。

1. 試料表面上に関心領域を選択して、（X、Y）は、対応する境界の座標を取得します。
2. グリッド化アルゴリズム（例えば、アダプティブグリッド、選択した領域のイメージング、長方形のグリッド、スパイラルパターン、Zスキャン、など）を選択撮像すべき領域の上に、各ピクセルでの滞留時間で試料表面をラスタになると選びました。
3. 三軸移動ステージ、所定のグリッドに従ってサンプルをラスタが可能なソフトウェアを使用してください。
4. イメージングに必要な総時間を計算します。
5. 質量分析計のデータ取得の時間制限を無効にします。これが不可能な場合、計算された撮影時間の値にデータ収集の時間制限を設定します。
6. LAESI横方向のイメージング実験を行うために、各ピクセルでの滞留時間内にマススペクトルで十分な信号対雑音比を生成するために適切な繰返しレートでの中赤外レーザ光源を開始します。 3D分子イメージングのために、成功し、単一のレーザーパルス内で生成されたイオンを大量に分析するためにレーザー光源の繰り返しレートより高いスペクトルの取得率を使用してください。アブレーションのシーケンスを開始するSTART信号を待ちます。
7. エレクトロスプレー源をオンにします。イメージングに必要なフルタイムのための十分な解決策があることを確認してください。
8. 同時にマススペクトルの取得、中赤外レーザーアブレーション、および表面のスキャンを開始します。
9. イメージングの実行が終了すると、表面のスキャン、中赤外レーザー発振、及びデータ収集を停止します。
10. レーザ光源を無効にします。
11. 高電圧の電源を切ります。
12. シリンジポンプの電源を切ります。
13. STANDBYモードに質量分析計を設定します。
14. ペルチェ冷却用電子機器の電源を切ります。
15. 使用する場合は不活性ガスの流れを閉じます。
16. 横方向のイメージングまたは対応するスペクトルを持つ3次元解析におけるボクセル内のピクセルの絶対座標を相関させるソフトウェアを使用してください。
17. 横方向と3D分子画像を得るために分析の絶対座標に対して選択されたm / z値のためのイオン強度の信号をプロットします。

4。代表的な結果

図2は、いくつかの主要な組織型と画像診断法の代表的な結果が得られます。パネルには、脱水症状を防ぐために、実験中に凍結されている動物の組織切片のためのケースを示しています^。1さらに^は 、サンプルを試料表面に結露から周囲の水の蒸気を避けるために乾燥窒素ガスの環境に位置していた。ラットの脳の100μm厚の冠状セクション（ ドブネズミ ） が横方向にLAESIで撮像した。および/ ​​またはPE（O - 36：3） のm / z 728.559と：脳の解剖学的領域は、（パネルの光学画像を参照）plasmalogensのPC（3 O - 33）について得られた分子像と良い相関を示しています。

パネルBは、Zebra工場（ アフェランドラsquarrosa）葉組織の3次元LAESIイメージングを示しています。葉が脱水症状に対する自然の防御機構を持っているため、サンプルは、周囲の環境で調べることができる^3。得られた3次元分子画像は、プライマリおよび二次代謝産物の配布さまざまなパターンを明らかにした。他の人の中で、 はm / z 285.076とacacetinは、他の均一な分布と上から2番目と3番目の層の黄色の分野で高いイオンカウントで検出された。この分布は、光学像に見られる斑入りのパターンと一致した。

図1。 LAESIシステムの概略図 （ES、エレクトロスプレーエミッタ先端、または、質量分析計のサンプリングコーンのオリフィス、FL、レンズを中心に、FP、フォーカルポイント、P、ペルチェ冷却ステージ、HS、ヒートシンク）。分子と試料のイオン（緑色のドット）を接種した帯電液滴を生成するためにエレクトロと中赤外アブレーション（赤い点）合体中に排出される粒子状物質の部分。これらの液滴から放出イオンが質量分析計で分析して記録されます。

図2。横方向と3D想像力のための代表的な結果LAESI質量分析とNG（A）上部パネルは、ラットの脳の光学像（ ドブネズミ ） を描く冠状セクションとplasmalogens PC（O - 33：3）で得られた分子のイメージ。および/ ​​またはPE（O - 36 ：3） のm / z 728.559。白いスケールバーは1mmに相当します。からの許可（参考^1）に適応。著作権2010 American Chemical Societyの。 （B）下のパネルには、多彩なゼブラプラント（ アフェランドラsquarrosa）から葉の3次元画像を示しています。 のm / z 285.076とAcacetinは、他の均一な分布と上から2番目と3番目の層の黄色の分野で高いイオンカウントで検出された。からの許可（参考文献^3）を得て転載。著作権2009 American Chemical Societyの。

Discussion

異なる組織型はこれらの影響を緩和するために順番に、試料のアブレーション特性に影響を与えることができる、含水率と引張強度^、9はさまざまです、それは間を変更するときにレーザーのフルエンス、サンプルの処理、および分析のプロトコルが改訂されることが望まれている主要な組織の種類。

単一のセルまたはより高い解像度の調査のため、中赤外光の代わりに、フォーカスレンズのシャープ、光ファイバに結合することができます^。10は組織内の選択したセルのすぐ近くに光ファイバの先端を配置することにより、LAESI分析はで行うことができます。単一細胞レベル。

ラベルフリー周囲イオン化質量分析用イオン源として^、11 LAESIは組織中の生化学的プロセスの研究に大きな可能性を示している。直接解析、横方向と3次元イメージングの利点を得ることも、LAESIは、プロファイリングと同様に画像処理アプリケーションのための新興バイオ分析ツールです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer	Waters	Q-TOF Premier
Mid-IR laser	Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR