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Abstract

Source : Garone, M. G. et al. Conversion de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) en motoneurones spinaux et crâniens fonctionnels à l’aide de vecteurs PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure de génération de motoneurones par transfection d’iPSC humaines avec le système de transposon PiggyBac par l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée.

Protocol

1. Génération de lignées iPSC inductibles NIL et NIP

1. Transfection cellulaire
   1. Rincez les cellules avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) (0,35 mL pour une boîte de 35 mm) et incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules individuelles soient
   3. séparé (5-10 min).
   4. Complétez en douceur la séparation des cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 3 à 4 fois.
   5. Prélever dans un tube de 15 mL et ajouter du PBS (Ca^2+/Mg²⁺ libre) à 10 mL. Comptez les cellules.
   6. Granulez 10⁶ cellules et mettez-les en suspension dans 100 μl de tampon R (inclus dans le kit d’électroporation de cellules, voir tableau des matériaux).
   7. Ajouter de l’ADN plasmidique pour la transfection : 4,5 μg de vecteur transposable (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) et 0,5 μg du plasmide transposase piggyBac.
   8. Transfecteur parfait avec le système d’électroporation de la cellule (voir tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant avec les paramètres suivants : tension de 1 200 V, largeur de 30 ms, 1 impulsion. Ensemencez les cellules dans un milieu iPSC humain complété par 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK, voir le tableau des matériaux) dans une boîte enrobée de matrice de 6 mm.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival