Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Summary

Detta protokoll innebär en icke-radioaktiva

Abstract

Här beskriver vi en modifierad version av en dubbel fluorescens

Protocol

Detta protokoll har utvecklats och förfinats baserat på standard radioaktiva och icke radioaktiva in situ hybridisering metoderna, som tidigare utvecklats av oss och andra att upptäcka en eller två avskrift arter i hjärnvävnaden ^1-7. Protokollet som beskrivs nedan har en total längd av 2 eller 3 dagar, beroende på antal processuella avbrott valts av slutanvändaren. Alla steg som beskrivs nedan ska utföras vid rumstemperatur, med undantag av riboprobe hybridisering steg och efter hybridisering tvättar. De lösningar och buffertar som behövs för alla steg i denna metod återfinns i slutet av detta protokoll.

1. Tissue Förberedelser och Sektionering

1. Halshugga och extrahera ämnet hjärna snabbt, och placera den i en plastform av tillräcklig storlek.
2. Täck hjärna med Tissue-Tek inbäddning medium och snabbt placera plastform i en dry-ice/alcohol bad för snabbinfrysning. Fryst vävnad kan förvaras vid -80 ° C till dess användning.
3. Med hjälp av en kryostat, samla in 2 eller 3 hjärnan sektioner per skjut ut SuperFrost Plus diabilder. Tjocklek av avsnitten bör vara 10-12 ìm. Objektglas kan förvaras vid -80 ° C till dess användning.

2. Beredning av Sephadex G50 Kolumner för Probe Rening

"Sephadex kolumner kan köpas från kommersiella källor, men erbjuder vi under ett lågkostnadsalternativ för generering av kolumner, som kommer att krävas för givare rening.

1. Hydrate tillräcklig mängd Sephadex G50 pulver med RNase-fri, DEPC-behandlat vatten (t ex 2 g pulver i 100 ml DEPC-behandlat vatten), blanda lösningen kort och förvara i rumstemperatur för att framkalla överskott Sephadex G50.
2. Avlägsna supernatanten (övre skiktet av vatten) efter Sephadex G50 nederbörd.
3. Upprepa processen över 3 - 5 gånger.
4. Efter den sista tvätten, återsuspendera Sephadex G50 lösning i TE buffert (1:1), och förvara vid 4 ° C fram till användning.
5. Placera autoklaveras glasull i en steril 1 ml spruta och komprimera den med kolven för att göra ett kompakt lager i botten, och sedan placera sprutan i en 15 ml Falcon rör.
6. Blanda väl lösningen av Sephadex G50 i TE. Fyll sprutan / kolumn med denna lösning.
7. Centrifugera kolumnen i 30 sekunder vid 1000 rpm.
8. Upprepa proceduren tills kolumnen är nästan helt fylld med Sephadex G50 pärlor.
9. Applicera 200 l av kolumn tvätt buffert i kolonnen och centrifugera det för 2 min vid 1000 rpm. Kasta genomströmning.
10. Applicera 200 l av kolumn blockerande buffert i kolonnen och snurra det i 2 min vid 1000 rpm. Upprepa detta steg 4-5 gånger till jämvikt kolumn. Kolumner kan lagras vid 4 ° C tills den ska användas om det förseglade med Parafilm.

3. Märkning och rening av Riboprobes

Nedan detalj generering och rening av en enda riboprobe. För dFISH, kommer utarbetandet av varje prob innebär att samma metod, förutom att en av sonderna kommer att märkas med digoxigenin (DIG)-märkta UTP medan den andra med biotin taggade-UTP.

1. Förbered en koncentrerad (> 150 ng / l) och renat linjäriserade cDNA lösning av intresse att skapa någon känsla (kontroll) eller riboprobes antisens.
2. I ett 1,5 ml mikrofugrör, tillsätt 0,5-1 mikrogram av renat cDNA mall 2 ìl av 5X sond märkning buffert, 1 l 10X DIG (eller biotin)-märkning mix 0,5 ìl RNasin och 1 l av lämplig RNA-polymeras och föra den slutliga volymen av lösningen till 10 l med RNAse-fria (DEPC-behandlade) vatten.
3. Inkubera lösningen i ett vattenbad vid 37 ° C i 2 tim.
4. Tillsätt 1 l av tRNA (materiel, 20 mikrogram / l) och 39 l i kolumn blockerande buffert till lösningen.
5. Förbered Sephadex G50 kolumnen för sond rening. För detta ändamål lägga 50 l blockerande buffert i kolonnen och snurra den för 10 sek vid 1000 rpm.
   Upprepa detta steg 2-3 gånger att balansera kolumnen (dvs hela 50 l tillämpas på kolumnen återhämtade sig efter cykel av centrifugering).
6. Applicera sonden lösningen på Sephadex G50 kolumnen ståndpunkt en ny mikrofugrör längst ned i kolumnen, och snurra det i 3 min vid 1000 rpm för att få det renade 50 ìl av riboprobe lösning.
7. Bedöma kvalitet och utbyte av märkta riboprobe med antingen en standard formaldehyd-agaros RNA gel eller en spektrofotometer.

4. Post-fixering, acetylering och hybridisering

1. Ta bort delar från -80 ° C frys och möjliggöra en rumstemperatur att uppnå jämvikt. Därefter inkubera avsnitt i en kall, nygjord 3% paraformaldehyd lösning för 5 min.
2. Kortfattat skölj avsnitt i Phosphate saltlösning (PBS) två gånger.
3. Torka delarna genom en vanlig alkohol-serien (70, 95 och 100%, 2 min vardera), och låt dem lufttorka.
4. Inkubera avsnitt i en acetylering lösning i 10 min.
5. Skölj avsnitt 3 gånger i 2X SSPE.
6. Torka delarna återigen genom de vanliga alkohol-serien beskrivs ovan, och låt dem lufttorka.
7. Bered en tillräcklig volym av hybridisering lösning och tillsätt både riboprobes till lösningen (givare koncentration: 1 ng / l för varje givare). Total volym av hybridisering lösningen bestäms utifrån antalet sektioner som ska hybridiseras (16 ìl av hybridisering lösning per avsnitt).
8. Applicera tillräcklig volym av hybridisering lösningen på vävnad och täckglas diabilder se till att inga luftbubblor överlägg vävnaden.
9. Placera objektglasen i en metall hållare. Doppa hållare i en mineralolja bad vid 65 ° C över natten. Se till att täckglas är vänd uppåt (dvs den laterala delen av diapositivhållaren bör vara i kontakt med botten av mineralolja behållare).

5. Post-Hybridisering Tvättar

1. Följande dag tar du försiktigt bort bilden innehavaren från mineralolja badet och kortfattat skölj den i kloroform för att avlägsna överflödig olja från bilderna.
2. Placera objektglasen i ett 2X SSPE lösning för 5-10 min. Täckglas ska bort från bilder, medan i lösning.
3. Överför bilderna till en ny 2X SSPE lösning, och hålla dem i 1 timme i rumstemperatur.
4. Överför sektioner i en lösning innehållande 2X SSPE plus 50% formamid. Temperaturen av denna lösning skall matcha temperaturen används i natten hybridisering förfarande. Förvara bilderna i denna lösning för 1,5 timme.
5. Överför avsnitt för att en 0,1 x SSPE lösning förvärmas till samma temperatur hybridisering steg. Inkubera avsnitt i denna lösning i 30 min. Upprepa detta steg för ytterligare 30 min.

6. Detektering och visualisering av Riboprobes

1. Överför bilderna till TNT buffert som 0,3% väteperoxid har lagts till, i 10 min.
2. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger (10 min vardera).
3. Med hjälp av en DAKO penna, rita en väl runt det område som innehåller hjärnan sektioner. Viktigt bör försiktighet iakttas för att säkerställa att delar inte torkar.
4. Applicera 150 ìl TNB buffert till varje bild, och inkubera avsnitt i denna lösning under 30 minuter i ett fuktigt utrymme.
5. Ta bort överflödig TNB lösning genom att luta diabilder.
6. Applicera 150 ìl av TNB lösning innehållande peroxidaskonjugerade anti-DIG antikropp, och diabilder förvaras i fuktig kammare för 2 tim. Antikroppskoncentration bör bestämmas individuellt för varje utskrift av intresse inför att genomföra dFISH.
7. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger 10 minuter vardera.
8. Applicera 150 ìl av Alexa 594-konjugerad tyramide fungerande lösning till varje bild, och lagra dem i en fuktig kammare för 1 tim. Denna lösning bör vara beredd enligt tillverkarens anvisningar.
9. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger 10 minuter vardera.
10. Inkubera avsnitt i TNT buffert som 0,3% väteperoxid har lagts till för 10 - 30 min.
11. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger 10 minuter vardera.
12. Applicera 150 ìl TNB buffert per bild, och förvara dem i en fuktkammare i 30 min.
13. Ta bort överflödig TNB lösning genom att luta diabilder.
14. Tillsätt 150 ìl av TNB lösning innehållande peroxidaskonjugerade anti-biotin antikropp, och diabilder förvaras i fuktig kammare för 2 tim.
15. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger 10 minuter vardera.
16. Applicera 150 l av en Alexa 488-konjugerade tyramide arbetar lösning på bilderna och inkubera sektioner för 1 tim. Denna lösning bör vara beredd enligt tillverkarens rekommendationer.
17. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger 10 minuter vardera.
18. Tillsätt 150 ìl Hoechst lösning (1:1000 i TNT buffert) till avdelningarna och förvara dem i fuktig kammare i 2 min.
19. Tvätta avsnitt i TNT buffert, 3 gånger, 5 min vardera.
20. Täckglas sektioner med en fluorescens-kompatibel monteringsmedium (t.ex. Vectashield eller förlänga antifade).

7. Representativa resultat

Figur 1. Vi visar här representativa dFISH resultat som erhållits vid zebra fink hjärnan. Här visas mikrofotografier erhålls från caudomedial nidopallium (NCM), Songbird analog till däggdjur auditiva cortex. Brain sektioner hybridiseras med biotinylerad riboprobe riktad mot parvalbumin (A), en markör för en undergrupp av hämmande nervceller, och en DIG-märkt Riboprob riktad mot den verksamhet som är beroende av genen zenk (B), en tillförlitlig markör för sång-driven nervceller. C) överlagring av (A) och (B) visar en befolkning på hämmande nervceller som aktiveras av auditiv upplevelse. Pilar och pilspetsar visar celler märkta endast med de två riboprobes, och asterisker visa representativa nervceller samtidigt uttrycka både avskrifter av intresse. Skala bar = 25 ìm.

Discussion

Vi har använt detta protokoll för att studera hur ryggradsdjur hjärnan neurochemically och funktionellt organiserad, och att avgöra hur beteendemässigt relevant för sensoriska stimuli påverkar arvsmassans maskineri av nervceller i den vuxna hjärnan ^8-10. Vi har framgångsrikt använt denna metod i hjärnvävnad från möss, råttor och sångfåglar, men räknar med att detta protokoll kommer att vara lätt att anpassa till hjärnan delar från en mängd ryggradsdjur och, kanske, icke-neuronala vävnader. Viktiga kontroller som krävs för att erhålla tillförlitliga resultat och optimal signal har detaljerade stor utsträckning av vår grupp någon annanstans ^{11, 12.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC	VWR international	IC15090225	toxic substance
PCR purification kit	Qiagen	28104
Formaldehyde	VWR international	BDH0506-4LP	toxic substance
T3 RNA polymerase	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)	VWR international	IC816124
MgCl2 (1 M)	Sigma-Aldrich	449172
Spermidine (1 M)	Sigma-Aldrich	S0266
DIG RNA labeling mix	Roche Group	NC9380805
Biotin RNA labeling mix	Roche Group	NC9440104
RNasin	Promega Corp.	N2111
BSA	Sigma-Aldrich	05491
DTT	Sigma-Aldrich	D5545
Sephadex G50	VWR international	95016-772
EDTA	VWR international	101384-758
SDS	Sigma-Aldrich	L4390
Transfer (t)RNA	Invitrogen	15401011
10X MOPS	VWR international	14221-398	toxic substance
Paraformaldehyde	VWR international	AAAL04737-36	toxic substance
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
NaOH	VWR international	SX0600-1
Triethanolamine	VWR international	IC15216391
Acetic anhydride	VWR international	MK242002	toxic substance
SSPE	VWR international	82021-488
Formamide	VWR international	JT4028-1	toxic substance
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
Mineral oil	VWR international	IC15169491
Chloroform	VWR international	BDH1109	organic solvent
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037	toxic substance
Hydrogen peroxide	VWR international	VW36901	toxic substance
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	JT Baker	X198-05
Anti-DIG HRP	Roche Group	11093274910
Anti-biotin peroxidase	Vector Laboratories	SP3010
TSA Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20935
TSA Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20932
H–chst	VWR international	200025-538
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
embedding mold	VWR international	15160-157
cryostat	Leica Microsystems	CM 1850
Superfrost plus slide	VWR international	89033-052
Solutions Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.