Summary
在子宫内电转染神经祖细胞在体内的一个有价值的方法。根据电极和电发育时间点的位置,才能有的放矢。皮层细胞的某些子集靶细胞,然后可以在体内或体外基因改变的影响进行分析。
Abstract
在初级神经元文化的体外研究允许突起生长的定量分析。为了研究遗传变异如何影响神经过程的产物,或shRNA的基因结构,可以通过化学转染或病毒转导的主要神经元介绍。然而,初级皮层细胞的细胞类型(从不同层次,抑制性神经元,神经胶质细胞的谷氨酸能神经元)的异构池是转使用这些方法。引进胚胎鼠皮质DNA的结构,允许使用在子宫内电靶细胞的某些子集,而早期胚胎皮层目标的皮质深层电,在后期的胚胎时间点电的目标更多的表面层。此外,差分跨越个别胚胎在背内侧与腹外侧皮层区域的定位结果头上的电极位置。电,转染的细胞可以被解剖,分离,镀在突起生长的体外定量分析。在这里,我们提供了一步一步的方法,定量测量皮层细胞亚群的神经过程的产物。
电在子宫内的基本协议已经Kriegstein 实验室1,2两个其他的Jove文章中详细介绍了。我们将提供我们的协议概述在子宫内电,专注于最重要的细节,说明我们的协议,适用于研究基因功能的神经过程的产物,在子宫内电。
Protocol
在子宫内电的基本协议已经详细描述了在另一个1,2 Kriegstein实验室的朱庇特的文章。这种技术最初是在大隅实验室3和描述我们的协议是基于后在LoTurco 实验室 4发达的地区之一。我们将为您提供概述大鼠胚胎在子宫内电“我们的协议,专注于最重要的细节,说明了我们的协议, 在子宫内电适用于研究基因功能的神经过程的产物。
在子宫内电穿孔1。
- 准备DNA和装载针
在子宫内 electroporations的第一步是设计实验,以确定要注入的DNA的结构。这种方法是有用的misexpressing或撞倒基因。如果您在规划misexpressing或过度表达的基因,一定要使用的发起人,是活跃在神经前体细胞。我们建议CAGGS发起人,其中包括鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强5。由于只有一个细胞的一小部分是在子宫内电转,关键是要包括如GFP荧光蛋白的质粒编码,因此,您可以按照那些成功的电穿孔细胞。对于质粒GFP,我们建议准备DNA的浓度在0.5微克每微升。对于shRNA的结构,我们发现,你感兴趣的基因敲0.5-1.0微克每μL,结果在有效。对于过度表达或错误表达,我们用每微升1.0和3.0微克之间,取决于大小的基因表达水平的实验要求。国家主管部门编制使用Qiagen公司的内毒素的制备试剂盒,并在1 × PBS稀释。我们注入胚胎脑约0.5-1.0%微升,因此,对于我们准备注射液10μLDNA混合物的动物垃圾。我们添加1μL快绿的DNA,所以,我们可以按照注入的DNA。
拉针正确的形状是关键的一步。 Walantus 等人使用不同的系统提供的DNA,所以他们的针准备性能稍微不同的,那么我们的1,2。的设置,你来拉你的针,将取决于针车夫,你的品牌。我们从大卫Kopf使用型号750。我们使用的设置是:烧热1:9.0,2:0热,Soleniod:0,灯丝尺寸3.0毫米,感应加热器:3毫米,时间:10秒。一旦拔出,我们将用刀片在一个45度角,从开放给小费的最大距离是11毫米的针头。然后,我们从针后端负载的DNA。然后填写在玉米油针的剩余空间。 DNA注射,我们使用了Picospritzer三。根据确切的斜面,每针切不同,我们设置Picospritzer从4.0至6.0。我们用一个脚踏板提供增压空气,排出针的DNA。 - 准备手术的动物
我们使用无病原体的SD大鼠,专门为这些手术。其他几个实验室的使用以及不同基因型的小鼠。在这里,我们描述了我们的协议显示E15大鼠胚胎电,但在子宫内的电是经常的E13和E18之间的年龄大鼠进行。虽然初期电目标的皮质深层,后一阶段electroporations的目标更多的表面层。
动物都获得了手术前剂量丁丙诺啡(0.05-0.1毫克/公斤),手术开始前。对麻醉动物有多个选项。 Walantus 等。利用isofuorane吸入,而我们经常使用腹腔注射氯胺酮(40-80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5-10毫克/公斤)1,2。一个脚趾头掐应始终执行,以确保动物完全麻醉,反应迟钝。动物保持在整个手术过程中的加热垫。
动物的毛皮剃光在切口的地区,并与乙醇用碘酒三次洗三次。皮肤外侧向中线切口,切口在肌肉。子宫角接触非常谨慎。他们轻轻地梳理出人体腔,用你的指尖。请用无菌PBS胚胎水合,而他们之外的体腔。 - 注射的DNA和电
当你第一次开始执行这些手术时,最难的是熟悉,你需要注入的DNA,让你填写的侧脑室,并有多深,你注入你的针,为了达到正确的区域。胚胎轻轻用指尖操纵,让你可以IDENTIFY的头部在哪里,如果你仔细观察,你将能够看到中线缝合。这作为一个一般的具有里程碑意义的,你可以用它来确定是位于侧脑室。我们通过子宫壁,进入侧脑室注入的DNA。我们用一个脚踏板来控制注射的DNA - DNA的多个脉冲进行,直到侧脑室与DNA /染料混合物填充。我们然后将胚胎的头两侧桨电极和使用另一脚踏板,提供脉冲,整个胚胎的头部。电极的位置是在确定皮层区域是电穿孔的关键。由于DNA是带负电荷的DNA将旅行时负责整个桨消除朝正电极。根据电极的确切位置,将针对不同的细胞亚群。我们经常把整个大脑的背内侧位置附近的正极。然而,LoTurco实验室精美表明,如果你把更多的大脑腹外侧地区的电极,可以针对 6外侧骨皮质流的皮质纹状体边界和命中细胞的细胞。每个胚胎可以被电,并可以在每个胚胎的DNA结构的不同组合。 - 缝合和术后护理
电所有胚胎,子宫角仔细返回到体腔,肌肉层和皮肤缝合。这种技术是在Walantus 等 1,2概述。动物连续监测,直到他们从麻醉中恢复,管理和镇痛丁丙诺啡(0.05-0.1毫克/公斤),每8-12小时。
2。培养电穿孔皮层神经元
- 收获电穿孔的大脑解剖电穿孔地区
在子宫内电以下的体内分析,动物可以被收获从出生到成年后早期电后24小时在任何时间点。然而,当培养初级神经元,我们收获了24小时后在E16电。此时,电穿孔胚胎表达GFP的检测水平。
动物安乐死使用吸入二氧化碳和快速断头。胚胎的子宫解剖和二价阳离子的HBSS,保持跟踪胚胎的DNA质粒电穿孔。使用过滤的HBSS,无菌管和板,蒸压清扫工具,这一点至关重要。皮层是解剖和脑膜中删除使用显微镜在引擎盖。这些皮层,然后与绿色荧光蛋白的能力,可视化的解剖显微镜下观察。 GFP阳性的皮层区域确定,我们UE一双一万纳剪刀剪出从皮质的GFP阳性的地区。这些作品被放置在一个15毫升的锥形管中的二价阳离子的HBSS没有。 - 游离和电镀神经元
HBSS中,一旦所有的GFP阳性地区都解剖,是用0.25%胰酶替代,孵育5分钟,在37度。胰蛋白酶被删除,取而代之的是与电镀媒体(DMEM培养基+ 5%胎牛血清+佩恩/链球菌+谷氨酰胺),和磨碎的5-7倍,游离细胞。卷使用后,取决于组织目前的金额。游离细胞,然后镀上CC2涂层玻片。对于两个玻片,我们板体积1.5毫升电镀媒体200,000-350,000细胞每室。 4小时后,电镀媒体吸气和1.5毫升每室(神经元培养基Neurobasal媒体+ B27的补充+ glutamax +庆大霉素)所取代。
3。神经过程的产物分析
- 固定和免疫文化
为了测量这些细胞的遗传操作的短期内effecs,我们收获后三天在体外的主要神经元。如果是要培养更多的分析不再的初级神经元,一半的媒体应更换一次3天。固定的文化,我们从分庭吸媒体,并在15分钟的4%paraformaldhyde的神经元修复。录制后,细胞用PBS洗涤两次,然后在封闭液(2%驴血清,用0.1%Triton X - 100的PBS)一小时的。细胞,然后在第一抗体孵育1小时。分析神经过程的产物,我们使用抗βtubululin抗体,以确定神经元 - 测试版II微管蛋白的免疫标签neruonal细胞体,树突和轴突。细胞,然后洗五分钟,在PBS的3倍,然后孵育1小时,由三个PBS洗涤counterstaining细胞核用DAPI和安装,Cy3标记的抗小鼠。 - 测量NEurite长度
蔡司Axioskop GFP阳性,β-Ⅲ微管蛋白阳性神经元的图像采集与MC100摄像机系统。这些包括所有突起的长度,最长突起长度的GFP阳性细胞,可以检查几个变量,分支的突起,细胞胞体的大小等,我们已经使用这种方法来分析后神经元过程中击倒或基因的表达产物有关的神经发育和神经退行性疾病,神经过程的长短上的焦点。为了测量神经元突起的生长,我们使用Axiovision LE 4.4软件(蔡司)。在这个软件中,有一个选项,选择“纲要”的工具。使用此工具,您可以使用您的计算机的鼠标跟踪的每个神经元的过程的长度。确定的目标,您使用的是为了得到准确测量您的突起,这是关键。对于这些分析,我们通常使用20倍的目标。
4。代表性的成果
我们发现,只Dawley产仔数范围在6日和14胚胎。我们通常electroporate所有的胚胎。每个胚胎可以被电具有不同的DNA结合。然而,我们通常electroporate至少有四个相同的条件下,游离和电镀前池这些大脑大脑。
我们发现,使用这种技术,大约75%的电穿孔的大脑有针对性地所需的皮质区域,不管是背内侧或腹外侧皮层(图1)。此外,我们已经发现E13 - 14的目标,如Tbr1积极第六层神经元的深层神经元的早期electroporations,同时目标CTIP2积极,TBR1负V层细胞,再后来electroporations目标Brn2积极的II / III层细胞以后electroporations。一个优秀的描述不同的标记和皮层神经元亚型规范的解释的发现 Moleneaux等7条。图2显示了在任胚胎每天15.5或17.5电穿孔和大脑在出生后第5天收获的冠状切片。图中红色是免疫的Oct6。您可以免疫染色标记在文化,以确认有针对性的细胞层的人群。我们发现,你可以期望目标在同一窝的每一个胚胎细胞相同的细胞层人口(换言之,目标取决于胚胎的时间点而不是在其他技术变化)。
%GFP阳性细胞,可以在文化上,范围广泛,取决于你如何保守解剖GFP阳性区域(图3)时,。然而,即使我们是非常保守的,并剖析GFP阳性细胞修补,我们观察到的是5-10%的比例最高 - 虽然你解剖电穿孔皮质区域,在只有一层的细胞会做到有的放矢。这种低转effciency有助于确定哪些进程属于你分析electoporated细胞。然而,在这个高密度电镀细胞有助于heathier文化,它是很难辨别哪些进程属于细胞体中GFP阴性细胞(图3)。
如果你看到的所有的电穿孔细胞的精细的工序有麻烦,你可以增加你是电穿孔增加GFP表达GFP的DNA浓度,你可以使用抗GFP抗体免疫染色游离细胞(自Invitrogen )沿与CY2二级抗体。
GFP质粒电穿孔与图1。E15.5 Sprague - Dawley大鼠,3天后收获。根据电极的位置,皮层的不同区域将有针对性。在整个大脑的自动对焦显示绿色荧光。
图2。E15.5(A)或E17.5(二)Sprague - Dawley大鼠电穿孔与GFP质粒,并在出生后第5天收获。大脑进行固定,切片冠使用vibratome(100微米节),并Oct6(红色)的免疫染色。 A和B的免疫染色部分的共聚焦图像。
图3。E15.5 Sprague - Dawley大鼠与GFP质粒电穿孔。 24小时电后,大脑收获GFP阳性,电穿孔地区进行解剖和分离,如在视频中所述。经过3天的体外,细胞固定和免疫染色BIII -微管蛋白(红色)和染色用DAPI(蓝色)(A,C)的原子核。最长突起长度测量AxioVision软件(B,D)。
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Discussion
允许初级神经元文化的体外研究的突起生长的定量分析。为了研究遗传变异如何影响神经过程的产物,通过化学转染或病毒转导的主要神经元的shRNA或错误表达结构可以引入。然而,初级皮层细胞的细胞类型(从不同层次,抑制性神经元,神经胶质细胞的谷氨酸能神经元)的异构池是转使用这些方法。引进胚胎鼠皮质DNA的结构,允许使用在子宫内电靶细胞的某些子集,而早期胚胎皮层目标的皮质深层电,在后期的胚胎时间点电的目标更多的表面层。此外,差分跨越个别胚胎在背内侧与腹外侧皮层区域的定位结果头上的电极位置。
特定层的目标:
当你注入侧脑室DNA和electroporate,只有细胞立即衬砌外侧venrtricle针对性:这些细胞是新大脑皮层的桡神经胶质祖细胞,以及刚刚经历了其终端的有丝分裂的细胞。有趣的是,在以下电天检查时,针对细胞相匹配的birthdated细胞格局。换句话说,细胞是天生的,是说那些接受他们对终端的有丝分裂electropoartion一天的,是有针对性的细胞。 ,由于桡神经胶质细胞也在心室表面,人们可能会猜测,这些细胞将有针对性的,并且,所有这些细胞的后代也将有针对性的。然而,这并非如此,以后几代细胞不表达绿色荧光蛋白。这可能是桡神经胶质细胞的多轮部门出质粒稀释。
应用范围:
这种方法是一个很好的方式,以审查通过的shRNA contructs电击倒,以及错误表达的cDNA结构基因的影响。我们应用此techniqe在神经退行性疾病和精神疾病有关的基因的研究。通过这种技术,我们将介绍这些疾病的关键基因的野生型和突变形式,并研究对神经元的形态的影响。此外,我们可以检查的内源性基因产物的情况下,通过电穿孔合作的cDNA的shRNA contruct突变或替代拼接变异体表达的影响。合作electorporation也可以利用两个基因产物之间的遗传相互作用:撞倒多个基因,并试图救援,敲除一个基因的产物,与其他基因产品,8,9的效果。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢约瑟夫LoTurco和丹尼斯Selkoe这种技术的有益的讨论。作者感谢美国健康援助基金会的捐助者,为支持这项研究。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
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- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
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