Summary
I livmodern elektroporation är en värdefull metod för transfecting neuronala stamceller in vivo. Beroende på placering av elektroderna och utvecklingsmässiga tidpunkterna för elektroporation kan vissa delmängder av kortikala celler riktas. Riktade celler kan sedan analyseras in vivo eller in vitro för effekterna av genetiska förändringar.
Abstract
In vitro-studier av primära neuronala kulturer möjliggör kvantitativa analyser av neurite utväxt. För att studera hur genetiska förändringar påverkar neuronala processen utväxt, shRNA eller cDNA konstruktioner kan införas i primär nervceller via kemiska transfektion eller viral transduktion. Men med primär kortikala celler, är en heterogen grupp av celltyper (glutamaterg nervceller från olika lager, hämmande nervceller, gliaceller) transfekterade med dessa metoder. Användningen av i livmodern elektroporering att införa DNA-konstruktioner i den embryonala gnagare cortex tillåter vissa grupper av celler som utgör målgrupp: medan elektroporering av tidiga embryonala cortex mål djupa lagren av hjärnbarken, mål elektroporation på sena embryonala tidpunkter mer ytliga lager. Vidare differential placering av elektroder över huvudet på enskilda embryon resulterar i att rikta dorsal-mediala kontra ventral-laterala områden av hjärnbarken. Efter elektroporation kan transfekterade celler dissekeras ut, dissocierade, och pläterade in vitro för kvantitativ analys av neurite utväxt. Här ger vi en steg-för-steg metod för att kvantitativt mäta neuronala processen utväxt i delmängder av kortikala celler.
Den grundläggande protokoll för i livmodern elektroporering har beskrivits i detalj i två andra JUPITER artiklar från Kriegstein lab 1, 2. Vi kommer att ge en översikt över våra protokoll för i livmodern elektroporering, med fokus på de viktigaste detaljerna, följt av en beskrivning av våra protokoll som gäller i livmodern elektroporering till att studera geners funktion i neuronala processen utväxt.
Protocol
Den grundläggande protokoll för i livmodern elektroporering har beskrivits i detalj i en annan JUPITER artikeln från Kriegstein lab 1, 2. Denna teknik var ursprungligen beskrivits i Osumi labb 3 och vårt protokoll bygger på en utvecklad i LoTurco lab 4. Vi kommer att tillhandahålla en översikt över våra protokoll för i livmodern elektroporering av råtta embryon, med fokus på de viktigaste detaljerna, följt av en beskrivning av våra protokoll som gäller i livmodern elektroporering till att studera geners funktion i neuronala processen utväxt.
1. I livmodern elektroporation
- Förbereda DNA och lastning nålar
Det första steget i livmodern electroporations är att designa ett experiment för att avgöra vad DNA-konstruktioner som du vill injicera. Denna metod är användbar för både misexpressing eller knacka ner gener av intresse. Om du planerar att misexpressing eller överuttryck en gen, måste du använda en promotor som är aktiv i neuronala föregångare celler. Vi rekommenderar CAGGS promotor, som består av kyckling beta-aktin promotor och CMV förstärkare 5. Eftersom endast en liten delmängd av celler transfekterade använder i livmodern elektroporering, är det viktigt att inkludera en plasmid som kodar för ett fluorescerande proteinet, såsom GFP så att du kan följa de celler som framgångsrikt electroporated. För plasmiden kodning GFP, rekommenderar vi att förbereda DNA vid en koncentration av 0,5 mikrogram per mikroliter. För shRNA konstruktioner, har vi funnit att 0,5-1,0 mikrogram per mikroliter ger en effektiv slå ner på din genen av intresse. För överuttryck eller misexpression använder vi mellan 1,0 och 3,0 mikrogram per mikroliter, beroende på storleken av genen och nivån på uttryck som försöket kräver. DNA är beredda att använda en Qiagen endotoxin-fri prep kit, och späds ut med 1 x PBS. Vi injicerar ca 0,5-1,0 mikroliter per embryonala hjärnan, så för en kull av djur vi förbereder 10 mikroliter av DNA-blandning för injektion. Vi lägger till en mikroliter av Fast grönt i DNA, så att vi kan följa injiceras DNA.
Dra nålar till rätt form är ett kritiskt steg. Walantus et al. Använder olika system för leverans av DNA och så deras nål prep är också slighly annorlunda än vår 1,2. De inställningar som du använder för att dra dina nålar beror på märket på nålen avdragare som du har. Vi använder oss av modellen 750 från David Kopf. Inställningarna vi använder är: Heat 1: 9,0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, Filament storlek 3,0 mm, Värmare Närhet: 3 mm, Tid: 10 sek. En gång drog, skär vi våra nålar med ett rakblad i en ~ 45 graders vinkel så att avståndet från den största delen av öppningen till spets är 11 mm. Vi lastar sedan DNA från den bakre delen av nålen. Vi fyller det kvarvarande utrymmet i nålen med majsolja. För DNA-injektion, använder vi en Picospritzer III. Beroende på exakt avfasning som är skuren för varje nål, sätter vi Picospritzer 4,0 till 6,0. Vi använder en fotpedal för att leverera tryckluft som avfyrar DNA från nålen. - Förbereda djur för kirurgi
Vi använder patogenfria Sprague Dawley exklusivt för dessa operationer. Flera andra labb använder möss med olika genotyper också. Här beskriver vi visa våra protokoll för elektroporering av E15 råtta embryon, men i livmodern elektroporering rutinmässigt utfördes på råttor i åldrarna E13 och E18. Medan tidigt elektroporation mål djupa skikt av hjärnbarken, senare electroporations rikta mer ytliga lager.
Djur får en preoperativ dos av buprenorfin (0,05 till 0,1 mg / kg) innan operationen startar. Det finns flera alternativ för anesthetizing djuret. Walantus et al. Utnyttjar isofuorane inandning, samtidigt som vi rutinmässigt använder intraperitoneal injektion av ketamin (40-80 mg / kg) och xylazin (5-10 mg / kg) 1,2. En tå nypa ska alltid utföras för att säkerställa att djuren är helt bedövad och okänslig. Djuren hålls på en uppvärmd platta under hela det kirurgiska ingreppet.
Djurets päls är rakat i regionen snitt, och tvättas tre gånger med etanol följt av tre gånger med jod. Ett snitt görs i huden precis sidled med mittlinjen, följt av ett snitt i muskeln. Den livmoder hornen är utsatta mycket noggrant. De är försiktigt benas ut ur kroppen hålrum med hjälp av fingertopparna. Håll embryon hydratiserad med steril PBS medan de är utanför kroppen hålighet. - Injicering DNA och elektroporation
När du börjar att utföra dessa operationer, är den svåraste delen att bli bekant med där du ska injicera DNA så att du fyller i sidled ventriklar och vänja sig vid hur djupt du injicerar nålen för att träffa den rätta regionen. Embryon är lätt manipulerade med fingertopparna så att du kan identcera där huvudet, och om du tittar noga kommer du att kunna se mittlinjen sutur. Detta fungerar som en allmän landmärke som du kan använda för att avgöra var den laterala ventrikeln finns. Vi injicera DNA genom livmoderväggen och in i laterala ventrikeln. Vi använder en fotpedal för att kontrollera injektion av DNA - flera pulser av DNA utförs tills den laterala ventrikeln är fyllt med DNA / dye blandning. Vi lägger sedan paddlar elektroder på vardera sidan av huvudet av embryot och använda en annan fotpedal för att leverera pulsen över huvudet av embryot. Placeringen av elektroderna är avgörande för att bestämma vilken region av hjärnbarken är electroporated. Eftersom DNA är negativt laddat, kommer DNA-resa mot den positiva elektroden när en avgift skingras över paddlar. Beroende på exakt placering av elektroder, kommer olika undergrupper av celler riktas. Vi lägger rutinmässigt den positiva elektroden nära rygg-mediala positioner över hela hjärnan. Visade emellertid LoTurco labbet vackert att om du placerar elektroderna i mer ventrala laterala delar av storhjärnan du kan rikta cellerna i kortikala-striatala gränsen och slog cellerna i laterala kortikala strömmen 6. Varje embryo kan electroporated, och olika kombinationer av DNA-konstruktioner kan användas i varje embryo. - Suturering och postoperativ vård
Efter elektroporation av alla embryon, är livmodern hornen försiktigt tillbaka till kroppen hålighet, och både muskel lagret och huden är sys. Tekniken för detta beskrivs i Walantus et al 1,2. Djur är övervakas kontinuerligt tills de återhämta sig från anestesi och analgetika buprenorfin (0,05 till 0,1 mg / kg) ges var 8-12 timmar.
2. Odling Electroporated kortikala Neuroner
- Skörd electroporated hjärnor och dissekera electroporated regionen
För in vivo-analyser efter i livmodern elektroporering kan djuren skördas vid någon tidpunkt från 24 timmar efter elektroporation för tidigt efter födseln till vuxen ålder. Men när odling primära nervceller vi avverkar 24 timmar efter elektroporation på E16. Vid denna tid, är electroporated embryon uttrycka detekterbara halter av GFP.
Djur avlivas med hjälp av inhalation av koldioxid och snabb halshuggning. Embryon är dissekerade ut ur livmodern och placeras i HBSS med divalenta katjoner, hålla reda på vilka embryon har electroporated som DNA plasmider. Det är viktigt att använda filtrerad HBSS, sterila rör och plattor, och autoklaveras verktyg för dissekering. Den cortex är dissekeras ut och hjärnhinnorna bort med ett mikroskop i en huva. Dessa cortex därefter observeras under ett dissekera mikroskop med förmåga att visualisera GFP. GFP positiva regioner i hjärnbarken är identifierade och vi ue ett par Vanna sax för att klippa ut GFP-positiva regioner i hjärnbarken. Dessa bitar är placerade i HBSS utan divalenta katjoner i ett 15 ml koniskt rör. - Ta avstånd och plätering nervceller
När alla GFP positiva regioner dissekeras, är HBSS ersätts med 0,25% trypsin, och inkuberas vid 37 grader i 5 minuter. Trypsin tas bort, ersätts med plätering media (DMEM + 5% FBS + Penn / Strep + glutamin) och grov-5-7 gånger för att skilja cellerna. Mängder som används beror på hur mycket vävnad närvarande. Dissocierade celler är sedan pläterade på CC2 belagda kammare diabilder. För två kammare diabilder, plattan vi 200,000-350,000 celler per kammare i en volym av 1,5 mL plätering medier. Efter 4 timmar är plätering media sugs och ersätts med 1,5 ml Neuronal odlingsmedia (Neurobasal media + B27 tillskott + glutamax + gentamicin) per kammare.
3. Analysera Neuronal Process utväxt
- Fastställande och immunfärgning kulturer
För att mäta kortsiktiga effecs av genetisk manipulation av dessa celler, skördar vi i första hand nervceller efter tre dagar in vitro. Om primära nervceller som odlas längre för ytterligare analyser, bör hälften av de medier bytas var tredje dag. För fastställande kulturer, aspirera vi media från kamrarna och fixa nervceller i 4% paraformaldhyde i 15 minuter. Efter fixering, celler tvättas två gånger i PBS och ställs sedan i blockerande lösningen (2% åsna serum med 0,1% Triton X-100 i PBS) i en timme. Cellerna inkuberas därefter i primära antikroppen i 1 timme. För analyser av neuronala processen utväxt använder vi anti-beta tubululin antikroppar för att identifiera neuroner - beta II tubulin immunfärgning etiketter på neruonal cellkroppen, dendriter och axoner. Cellerna tvättas tre gånger i PBS i fem minuter, och sedan inkuberas i Cy3-anti mus under 1 timme, följt av ytterligare tre PBS tvättar, motfärgning kärnor med DAPI och montering. - Mätning neurite längd
Bilder av GFP positiva, beta-III-tubulin positiva nervceller förvärvas ett Zeiss Axioskop med en MC100 kamerasystem. Flera variabler kan undersökas i dessa GFP positiva celler inklusive längden på alla neurites, den längsta neurite, förgrening av neurites,, storleken på cellen Soma etc. Vi har använt denna metod för att analysera neuronala processen utväxt på riva eller överuttryck av gener om nervsystemets utveckling och neurodegeneration, med fokus på neuronal process längd. För att mäta neuronala processer utväxt använder vi AxioVision LE 4,4 programvara (från Zeiss). Inom detta program finns det ett alternativ att välja "utkast" verktyg. Med det här verktyget kan du använda din datormus att spåra längden på varje neuronal process. Det är viktigt att definiera de mål som du använder för att få ett exakt mått på din neurites. För dessa analyser använder vi oftast en 20x mål.
4. Representativa resultat
Vi har funnit att Sprague Dawley kullstorleken varierar mellan 6 och 14 embryon. Vi electroporate brukar alla embryon. Varje embryo kan electroporated med olika kombinationer av DNA. Men electroporate vi brukar åtminstone fyra hjärnor med samma villkor och pool dessa hjärnor innan isär och plätering.
Vi har funnit att med denna teknik ca 75% av electroporated hjärnor är riktade till önskad region i hjärnbarken, vare sig det dorsala medial eller ventrala laterala cortex (Figur 1). Dessutom har vi funnit tidigt electroporations på E13-14 mål djupa skikt neuroner som Tbr1 positiva lager VI neuron men senare electroporations mål CTIP2 positiv, TBR1 negativa lagret V celler, och ännu senare electroporations mål Brn2 positiva layer II / III-celler. En utmärkt beskrivning av olika markörer och förklaring av neuronala subtyp specifikation i cortex i hittade en artikel av Moleneaux et al 7. Figur 2 visar koronalt delar av hjärnan electroporated antingen embryonala dag 15,5 eller 17,5 och skördas vid födseln dag 5. Visas i rött är immunfärgning för Oct6. Du kan immunostain för markörer i kulturen att bekräfta vad cellager populationer du har riktat. Vi har funnit att du kan förvänta dig att rikta samma population cell lager av celler i varje embryo till samma kull (med andra ord beror inriktningen på embryonala tidpunkterna istället på andra tekniska varianter).
I kulturen kan procent av celler som är GFP positiva varierar mycket beroende på hur konservativ du är när dissekera ut GFP positiva regionen (Figur 3). Men även när vi är mycket konservativ och dissekera endast GFP-positiva plåster av celler, den högsta andelen som vi observerar är 5-10% - även om du är dissekera den region i hjärnbarken som var electroporated, celler i endast ett skikt kommer att riktas. Den låga transfektion effciency är till hjälp för att identifiera vilka processer som hör till electoporated cell som du analyserar. Plätering celler vid denna högre densitet bidrar till att ha heathier kulturer, är det dock svårt att urskilja vilken process som tillhör vilken cellkroppen i GFP negativa celler (Figur 3).
Om du har svårt att se alla fina processer electroporated celler kan du antingen öka koncentrationen av GFP DNA som du är electroporating att öka uttrycket av GFP, eller så kan du immunostain de dissocierade celler genom att använda ett anti-GFP antikropp (från Invitrogen ) tillsammans med en Cy2 sekundär antikropp.
Figur 1. E15.5 Sprague-Dawley råttor electroporated med GFP plasmiden och skördade tre dagar senare. Baserat på placeringen av elektroder, kommer olika regioner i hjärnbarken riktas. AF visa GFP fluorescens i hela hjärnan.
Figur 2. E15.5 (A) eller E17.5 (B) Sprague-Dawley råttor electroporated med GFP plasmiden och skörden postnatal dag 5. Hjärnor var fast, uppställd koronalt med en vibratome (100 micron avsnitt), och immunostained för Oct6 (röd). A och B visar konfokala bilder av immunostained sektioner.
Figur 3. E15.5 Sprague-Dawley råttor electroporated med GFP plasmid. 24 timmar efter elektroporation var hjärnor skördas och GFP-positiva, var electroporated regioner dissekeras och dissocierade, som beskrivs i videon. Efter 3 dagar in vitro, var cellerna fasta och immunostained för bIII-tubulin (röd) och färgning kärnor med DAPI (blå) (A, C). Längden på den längsta neurite mättes med AxioVision programvara(B, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-studier av primära neuronala kulturer möjliggör kvantitativa analyser av neurite utväxt. För att studera hur genetiska förändringar påverkar neuronala processen utväxt kan shRNA eller misexpression konstruktioner skall införas i primära neuroner via kemiska transfektion eller viral transduktion. Men med primär kortikala celler, är en heterogen grupp av celltyper (glutamaterg nervceller från olika lager, hämmande nervceller, gliaceller) transfekterade med dessa metoder. Användningen av i livmodern elektroporering att införa DNA-konstruktioner i den embryonala gnagare cortex tillåter vissa grupper av celler som utgör målgrupp: medan elektroporering av tidiga embryonala cortex mål djupa lagren av hjärnbarken, mål elektroporation på sena embryonala tidpunkter mer ytliga lager. Vidare differential placering av elektroder över huvudet på enskilda embryon resulterar i att rikta dorsal-mediala kontra ventral-laterala områden av hjärnbarken.
Inriktning på specifika skikt:
När du injicerar DNA i den laterala ventrikeln och electroporate är bara de celler omedelbart kantar laterala venrtricle riktade: dessa celler är de radiella gliaceller progenitorceller i hjärnbarken samt celler som just har genomgått sin terminal mitos. Intressant, när de undersöks under dagarna efter elektroporation, riktade cellerna matchar mönstret av birthdated celler. Med andra ord, celler som är födda, det vill säga de som genomgår sin terminal mitos på dagen för electropoartion, är de celler som är riktade. Sedan radiella gliaceller också närvarande vid ventrikulära ytan, kan en hypotes är att dessa celler skulle vara målinriktad, och att alla avkommor från dessa celler skulle också vara målinriktad. Detta är dock inte fallet, senare generationer av celler uttrycker inte GFP. Det kan vara att flera omgångar av division i radiella gliaceller späder ut plasmiden.
Användningsområden:
Denna metod är ett utmärkt sätt att undersöka effekterna av genen slå ner via elektroporering av shRNA contructs, liksom av misexpression av cDNA konstruktioner. Vi tillämpar denna techniqe till studiet av gener involverade i neurodegeneration och psykiatrisk sjukdom. Genom denna teknik presenterar vi både vildtyp och muterade former av gener avgörande i dessa sjukdomar, och undersöka effekterna på neuronal morfologi. Dessutom kan vi undersöka effekterna av mutationen eller alternativa skarva variant uttryck i avsaknad av den endogena genprodukten genom samarbete electroporating det cDNA och shRNA contruct. Co-electorporation även kan utnyttjas för att titta på genetisk interaktion mellan två genprodukter: genom att knacka ner flera gener och genom att försöka rädda effekter riva av en gen med andra genprodukter 8, 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Josef LoTurco och Dennis Selkoe för bra diskussioner om denna teknik. Författarna tackar givarna av den amerikanska hälso-och sjukvård stiftelse för att stödja denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
| 15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| 50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
