Summary
Utero electroporation vivo में neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं transfecting के लिए एक मूल्यवान तरीका है . इलेक्ट्रोड और electroporation की विकास timepoint के स्थान पर निर्भर करता है, cortical कोशिकाओं के कुछ सबसेट को लक्षित किया जा सकता है. लक्षित कोशिकाओं तो vivo में या आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव के लिए इन विट्रो में विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के इन विट्रो अध्ययन में neurite परिणाम की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है . आदेश में अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक परिवर्तन neuronal प्रक्रिया के परिणाम, shRNA या सीडीएनए constructs रासायनिक अभिकर्मक या वायरल पारगमन के माध्यम से प्राथमिक न्यूरॉन्स में पेश किया जा सकता है है प्रभावित है. हालांकि, प्राथमिक cortical कोशिकाओं के साथ, सेल प्रकार (विभिन्न परतों, निरोधात्मक न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं से glutamatergic न्यूरॉन्स) के एक विषम पूल इन तरीकों का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं. भ्रूण कृंतक प्रांतस्था में डीएनए constructs परिचय utero electroporation में के उपयोग के लिए लक्षित किया जा कोशिकाओं के कुछ सबसेट के लिए अनुमति देता है: जबकि जल्दी प्रांतस्था के भ्रूण प्रांतस्था लक्ष्य गहरी परतों के electroporation देर भ्रूण timepoints पर electroporation अधिक सतही परतों लक्ष्य. इसके अलावा, प्रांतस्था के पृष्ठीय औसत दर्जे बनाम उदर - पार्श्व क्षेत्रों का लक्ष्यीकरण में व्यक्तिगत भ्रूण परिणामों के सिर में इलेक्ट्रोड के अंतर स्थान. Electroporation के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बाहर dissected किया जा सकता है, अलग, और neurite परिणाम के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इन विट्रो में मढ़वाया. यहाँ, हम एक कदम दर कदम विधि करने के लिए मात्रात्मक cortical कोशिकाओं के सबसेट में neuronal प्रक्रिया परिणाम उपाय प्रदान करते हैं.
utero electroporation में के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल Kriegstein प्रयोगशाला 1, 2 से दो अन्य जौव लेख में विस्तार में वर्णित किया गया है. हम utero electroporation में के लिए हमारे प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन है, सबसे महत्वपूर्ण विवरण पर ध्यान केंद्रित, हमारे प्रोटोकॉल है कि utero electroporation में neuronal प्रक्रिया के परिणाम में जीन समारोह के अध्ययन के लिए लागू होता है की एक विवरण के द्वारा पीछा प्रदान करेगा.
Protocol
utero electroporation में के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल Kriegstein प्रयोगशाला 1, 2 से दूसरे जौव लेख में विस्तार में वर्णित किया गया है. इस तकनीक को मूल रूप से Osumi प्रयोगशाला 3 में वर्णित किया गया था और हमारे प्रोटोकॉल LoTurco 4 प्रयोगशाला में विकसित पर आधारित है. हम चूहा भ्रूण के utero electroporation में के लिए हमारे प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन है, सबसे महत्वपूर्ण विवरण पर ध्यान केंद्रित, हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है कि utero electroporation में neuronal प्रक्रिया के परिणाम में जीन समारोह के अध्ययन के लिए लागू होता है द्वारा पीछा प्रदान करेगा.
1. Utero electroporation में
- डीएनए और लोड हो रहा है सुइयों की तैयारी
utero electroporations में पहला कदम अपने प्रयोग डिजाइन डीएनए क्या constructs आप इंजेक्षन करना चाहते हैं निर्धारित करने के लिए है. इस विधि दोनों misexpressing या नीचे ब्याज की जीन दस्तक के लिए उपयोगी है. यदि आप misexpressing या overexpressing एक जीन पर योजना बना रहे हैं, के लिए एक प्रमोटर है कि neuronal अग्रदूत साबित कोशिकाओं में सक्रिय है का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो. हम CAGGS प्रमोटर, जो चिकन बीटा actin के प्रमोटर और सीएमवी 5 बढ़ाने के होते सलाह देते हैं. चूंकि केवल कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट उपयोग utero electroporation में ट्रांसफ़ेक्ट हैं, यह महत्वपूर्ण है एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP के रूप में एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग शामिल इतनी है कि आप का पालन कर सकते हैं उन कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक electroporated किया गया. प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP के लिए, हम microliter प्रति 0.5 μg की एकाग्रता में डीएनए की तैयारी की सलाह देते हैं. ShRNA constructs के लिए, हमने पाया है कि μL परिणाम में कुशल प्रति 0.5-1.0 μG ब्याज की अपने जीन के नीचे दस्तक. Overexpression या misexpression के लिए, हम 1.0 और 3.0 microliter प्रति μG के बीच का उपयोग करें, आकार और जीन की अभिव्यक्ति है कि प्रयोग के लिए कॉल के स्तर पर निर्भर करता है. DNAs Qiagen प्रस्तुत करने endotoxin मुक्त किट का उपयोग करने के लिए तैयार हैं, और 1 x पीबीएस में पतला. हम भ्रूण मस्तिष्क के प्रति लगभग 0.5-1.0 μL इंजेक्षन, तो हम इंजेक्शन के लिए डीएनए के मिश्रण के 10 μL तैयार पशुओं के एक कूड़े के लिए,. हम डीएनए के लिए फास्ट ग्रीन 1 की μL जोड़ सकते हैं ताकि हम इंजेक्शन डीएनए का पालन कर सकते हैं.
सही आकार करने के लिए सुई खींच एक महत्वपूर्ण कदम है. Walantus एट अल. डीएनए देने के लिए एक अलग प्रणाली का उपयोग करता है और इसलिए उनकी सुई प्रस्तुत करने का भी slighly अलग तो हमारा 1,2 है. कि आप अपने सुई पुल का उपयोग सेटिंग्स है कि आप सुई खींचने के ब्रांड पर निर्भर करेगा. हम दाऊद Kopf से 750 मॉडल का उपयोग करें. 1 हीट:: 9.0, 2 हीट: 0, Soleniod: 0, रेशा आकार 3.0 मिमी, हीटर निकटता: 3 मिमी, समय: 10 सेकंड का उपयोग हम सेटिंग्स हैं. एक बार खींच लिया, हम एक धार के साथ एक ~ 45 डिग्री जैसे कि टिप करने के लिए खोलने का सबसे बड़ा हिस्सा से दूरी 11 मिमी कोण पर हमारे सुइयों कटौती. हम तो सुई के पीछे के अंत से डीएनए लोड. हम तो मकई के तेल के साथ सुई में शेष स्थान को भरने के. डीएनए इंजेक्शन के लिए, हम एक Picospritzer क्ष्क्ष्क्ष् का उपयोग करें. सटीक बेवल है कि प्रत्येक सुई के लिए काट रहा है पर निर्भर करता है, हम Picospritzer 4.0 से 6.0 करने के लिए सेट. हम एक पैर पेडल करने के लिए दबाव हवा है कि सुई से डीएनए expels देने का उपयोग करें. - सर्जरी के लिए जानवरों की तैयारी
हम रोगज़नक़ मुक्त Sprague Dawley चूहों विशेष रूप से प्रयोग इन सर्जरी के लिए. कई अन्य प्रयोगशालाओं जीनोटाइप के रूप में अच्छी तरह से अलग करने के चूहों का उपयोग करें. यहाँ, हम E15 चूहा भ्रूण के electroporation के लिए हमारी प्रोटोकॉल दिखाने का वर्णन है, लेकिन utero में electroporation नियमित रूप से चूहों में E13 और E18 की उम्र के बीच किया जाता है. जबकि प्रारंभिक चरण electroporation प्रांतस्था की गहरी परतों लक्ष्य, बाद में मंच electroporations अधिक सतही परतों लक्ष्य.
पशु पूर्व ऑपरेटिव buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) की एक खुराक दी जाती है पहले सर्जरी शुरू होता है. जानवर anesthetizing के लिए कई विकल्प हैं. Walantus एट अल. Isofuorane साँस लेना का इस्तेमाल करता है, जबकि हम नियमित ketamine (40-80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) 1,2 के intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग करें. एक पैर के अंगूठे चुटकी हमेशा सुनिश्चित करना है कि जानवरों को पूरी तरह से anesthetized और अनुत्तरदायी हैं किया जाना चाहिए. पशु शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया भर में एक गर्म पैड पर रखा जाता है.
पशु फर चीरा के क्षेत्र में मुंडा है, और आयोडीन के साथ तीन बार द्वारा पीछा इथेनॉल के साथ तीन बार धोया. एक चीरा त्वचा बस midline के लिए पार्श्व में किया जाता है, मांसपेशियों में एक चीरा द्वारा पीछा किया. गर्भाशय सींग बहुत सावधानी से उजागर कर रहे हैं. वे धीरे से अपनी उंगलियों का प्रयोग शरीर गुहा के बाहर छेड़ा. बाँझ पीबीएस के साथ भ्रूण हाइड्रेटेड रखें जबकि वे शरीर गुहा के बाहर हैं. - इंजेक्शन डीएनए और electroporation
जब आप पहली बार इन सर्जरी प्रदर्शन शुरू करने के लिए, सबसे कठिन हिस्सा तुम कहाँ डीएनए इंजेक्षन करने के लिए इतना है कि आप पार्श्व ventricles को भरने की जरूरत है के साथ परिचित होता जा रहा है, और हो रही करने के लिए आप कितना गहरा अपने सुई सुई क्रम में सही क्षेत्र मारा इस्तेमाल किया. भ्रूण धीरे से अपनी उंगलियों के साथ छेड़छाड़ कर रहे हैं, इतनी है कि आप अध्यक्ष कर सकते हैंify जहां सिर है, और अगर तुम करीब से देखो तुम midline सीवन देखने में सक्षम हो जाएगा. यह एक सामान्य मील का पत्थर है कि आप जहां पार्श्व वेंट्रिकल स्थित है यह निर्धारित करने के लिए उपयोग कर सकते हैं के रूप में कार्य करता है. हम गर्भाशय की दीवार के माध्यम से और पार्श्व वेंट्रिकल में डीएनए इंजेक्षन. हम एक footpedal उपयोग करने के लिए डीएनए के इंजेक्शन नियंत्रण - डीएनए के कई दालों जब तक पार्श्व वेंट्रिकल डीएनए / डाई मिश्रण से भरा है प्रदर्शन कर रहे हैं. हम तो भ्रूण के सिर के दोनों ओर चप्पू इलेक्ट्रोड जगह है और भ्रूण के सिर भर में पल्स देने के लिए एक और footpedal उपयोग. इलेक्ट्रोड के स्थान का निर्धारण जो प्रांतस्था के क्षेत्र electroporated है में महत्वपूर्ण है. चूंकि डीएनए नकारात्मक आरोप लगाया है, डीएनए जब paddles एक प्रभारी भर dispelled है सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर यात्रा करेंगे. इलेक्ट्रोड की सटीक स्थान पर निर्भर करता है, कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट लक्षित किया जाएगा. हम नियमित रूप से मस्तिष्क भर पृष्ठीय औसत दर्जे का स्थान के पास सकारात्मक इलेक्ट्रोड जगह है. हालांकि, LoTurco प्रयोगशाला खूबसूरती से पता चला है कि अगर आप अधिक मस्तिष्क के ventral पार्श्व क्षेत्रों में इलेक्ट्रोड जगह आप cortical-striatal पार्श्व cortical धारा 6 की सीमा और हिट कोशिकाओं की कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं. हर भ्रूण, electroporated जा सकता है और प्रत्येक भ्रूण में डीएनए constructs के विभिन्न संयोजनों का इस्तेमाल किया जा सकता है. - Suturing और पोस्ट ऑपरेटिव परवाह
सभी भ्रूण की electroporation के बाद, गर्भाशय सींग ध्यान से शरीर गुहा लौट रहे हैं, और दोनों की मांसपेशी परत और त्वचा sutured हैं. इस के लिए तकनीक Walantus एट अल 1,2 में उल्लिखित है. पशु लगातार निगरानी कर रहे हैं जब तक वे संज्ञाहरण से उबरने के लिए, और एनाल्जेसिक buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) हर 8-12 घंटे प्रशासित किया जाता है.
2. संवर्धन cortical न्यूरॉन्स Electroporated
- Electroporated दिमाग फसल काटने वाले और electroporated क्षेत्र विदारक
Vivo में utero electroporation में निम्नलिखित विश्लेषण में के लिए, जानवरों के 24 घंटे से किसी भी समय के बिंदु पर जा सकता है वयस्कता को जन्म के बाद जल्दी electroporation निम्नलिखित काटा. हालांकि, जब संवर्धन प्राथमिक न्यूरॉन्स हम E16 में electroporation के बाद 24 घंटे फसल. इस समय, electroporated भ्रूण GFP के detectable स्तर व्यक्त कर रहे हैं.
पशु कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना और तेजी से कत्ल का उपयोग कर euthanized हैं. भ्रूण गर्भाशय के बाहर विच्छेदित कर रहे हैं और द्विसंयोजक फैटायनों साथ HBSS में रखा ट्रैक जो की भ्रूण जो डीएनए plasmids के साथ electroporated थे रखने के. यह फ़िल्टर HBSS, बाँझ ट्यूब और प्लेटें, और विच्छेदन के लिए autoclaved उपकरण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. cortices बाहर विच्छेदित कर रहे हैं और meninges हुड में एक खुर्दबीन का उपयोग कर हटाया. इन cortices तो GFP कल्पना करने के लिए क्षमता के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है. प्रांतस्था का GFP सकारात्मक क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं, और हम Vanna कैंची की एक जोड़ी बाहर प्रांतस्था से GFP सकारात्मक क्षेत्रों में कटौती ue. इन टुकड़ों HBSS में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में द्विसंयोजक फैटायनों के बिना रखा जाता है. - अलग और न्यूरॉन्स चढ़ाना
एक बार सभी GFP सकारात्मक क्षेत्रों dissected हैं, HBSS 0.25% trypsin के साथ प्रतिस्थापित किया गया है, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री पर incubated. Trypsin हटाया, चढ़ाना (DMEM + 5% FBS + / पेन strep + glutamine), मीडिया, और कोशिकाओं को अलग कर देना है triturated 5-7 बार के साथ प्रतिस्थापित. खंड ऊतक वर्तमान की राशि पर निर्भर करते थे. Dissociated कोशिकाओं तो CC2 लेपित चैम्बर स्लाइड्स पर चढ़ाया जाता है. दो कक्ष स्लाइड्स के लिए, चढ़ाना मीडिया की 1.5 एमएल मात्रा में हम चैम्बर प्रति 200,000-350,000 कोशिकाओं प्लेट. 4 घंटे के बाद, चढ़ाना मीडिया से aspirated और चैम्बर प्रति 1.5 एमएल Neuronal संस्कृति मीडिया (Neurobasal मीडिया + B27 पूरक glutamax + gentamycin +) के साथ बदल दिया.
3. Neuronal प्रक्रिया परिणाम का विश्लेषण
- फिक्सिंग और संस्कृतियों immunostaining
आदेश में इन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर के अल्पकालिक effecs उपाय करने के लिए, हम इन विट्रो में तीन दिन के बाद प्राथमिक न्यूरॉन्स फसल. यदि प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए अब अतिरिक्त विश्लेषण के लिए संवर्धित किया जा रहे हैं, मीडिया के आधे से हर तीन दिन बदल दिया जाना चाहिए. फिक्सिंग संस्कृतियों के लिए, हम कक्षों से मीडिया aspirate, और 15 मिनट के लिए 4% paraformaldhyde में न्यूरॉन्स ठीक. निम्नलिखित निर्धारण, कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धो रहे हैं और फिर अवरुद्ध समाधान (2% गधा के साथ 0.1% सीरम ट्राइटन पीबीएस में एक्स-100) एक घंटे के लिए. में डाल कोशिकाओं तो 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में incubated. Neuronal प्रक्रिया के परिणाम के विश्लेषण के लिए, हम विरोधी बीटा tubululin एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन्स की पहचान - बीटा द्वितीय ट्यूबिलिन immunostaining neruonal सेल शरीर, dendrites और axons लेबल. कोशिकाओं तो पांच मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धोया, और फिर एक घंटे के लिए Cy3 विरोधी माउस में incubated, तीन और पीबीएस washes, DAPI साथ नाभिक counterstaining और बढ़ते द्वारा पीछा किया. - मापने पूर्वोत्तरurite लंबाई
GFP सकारात्मक, बीटा III ट्यूबिलिन सकारात्मक न्यूरॉन्स की छवियाँ Zeiss Axioskop पर एक MC100 कैमरा सिस्टम के साथ प्राप्त कर रहे हैं. कई चर इन GFP सभी neurites, सबसे लंबे समय तक neurite की लंबाई की लंबाई सहित सकारात्मक कोशिकाओं में जांच की जा सकती है, neurites की शाखाओं में बंटी, सेल सोम के आकार, आदि हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया है नीचे दस्तक या जीन की overexpression पर neuronal प्रक्रिया के परिणाम का विश्लेषण सक्षम के चिकित्सकों और neurodegeneration neuronal प्रक्रिया लंबाई पर एक ध्यान के साथ, संबंधित है. आदेश में neuronal प्रक्रियाओं के परिणाम को मापने के लिए, हम AxioVision ले 4.4 सॉफ्टवेयर (Zeiss से) का उपयोग करें. इस सॉफ्टवेयर के भीतर, वहाँ "रूपरेखा" उपकरण का चयन करने के लिए एक विकल्प है. इस उपकरण का उपयोग, आप अपने कंप्यूटर माउस का उपयोग करने के लिए प्रत्येक neuronal प्रक्रिया की लंबाई ट्रेस कर सकते हैं. यह उद्देश्य है कि आप में आदेश का उपयोग कर रहे हैं करने के लिए अपने neurites की एक सटीक उपाय मिल परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इन विश्लेषण के लिए, हम आम तौर पर एक 20x उद्देश्य का उपयोग करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
हमने पाया है कि 6 और 14 भ्रूण के बीच Sprague Dawley कूड़े आकार पर्वतमाला. आमतौर पर हम भ्रूण की सभी electroporate. प्रत्येक भ्रूण DNAs की एक अलग संयोजन के साथ electroporated जा सकता है. हालांकि, हम आम तौर पर एक ही है और अलग और चढ़ाना पहले इन दिमाग पूल शर्त के साथ कम से कम चार दिमाग electroporate.
हमने पाया है कि इस तकनीक के साथ electroporated दिमाग का लगभग 75% प्रांतस्था के वांछित क्षेत्र के लिए लक्षित कर रहे हैं, चाहे वह पृष्ठीय औसत दर्जे का या ventral पार्श्व प्रांतस्था (चित्रा 1). इसके अलावा, हम Tbr1 सकारात्मक परत छठी न्यूरॉन्स के रूप में E13-14 लक्ष्य गहरी परत न्यूरॉन्स पर जल्दी electroporations पाया है, जबकि बाद में electroporations लक्ष्य सकारात्मक CTIP2 TBR1 नकारात्मक परत वी कोशिकाओं, और अभी भी बाद में electroporations लक्ष्य Brn2 सकारात्मक परत कोशिकाओं द्वितीय / तृतीय. में प्रांतस्था में neuronal subtype विनिर्देशन का विभिन्न मार्करों और विवरण के एक उत्कृष्ट विवरण Moleneaux एट अल 7 द्वारा एक लेख मिला है . चित्रा 2 से पता चलता है या तो भ्रूण 15.5 या 17.5 दिन में electroporated और प्रसव के बाद 5 दिन में काटा दिमाग के राज्याभिषेक वर्गों. लाल रंग में दिखाया Oct6 लिए immunostaining है. आप संस्कृति में मार्करों के लिए immunostain आप सेल परत आबादी को लक्षित किया है की पुष्टि कर सकते हैं. हमने पाया है कि आप एक ही कूड़े के हर भ्रूण में कोशिकाओं का एक ही सेल परत जनसंख्या लक्ष्य की उम्मीद कर सकते हैं (दूसरे शब्दों में, लक्ष्यीकरण अन्य तकनीकी रूपांतरों पर बल्कि तो भ्रूण timepoint पर निर्भर करता है).
संस्कृति में, कोशिकाओं के प्रतिशत रहे हैं कि सकारात्मक GFP व्यापक रूप से रूढ़िवादी कैसे आप कर रहे हैं जब बाहर GFP सकारात्मक क्षेत्र (चित्रा 3) विदारक पर निर्भर करता है रेंज कर सकते हैं. हालांकि, यहां तक कि जब हम बहुत ही रूढ़िवादी हैं और केवल कक्षों की GFP सकारात्मक पैच, सर्वोच्च प्रतिशत है कि हम निरीक्षण 5-10% है काटना - यद्यपि आप electroporated था कि प्रांतस्था के क्षेत्र विदारक हैं, केवल एक परत में कोशिकाओं लक्षित किया जा. यह कम अभिकर्मक effciency की पहचान है जो प्रक्रियाओं electoporated सेल है कि आप का विश्लेषण कर रहे हैं करने के लिए संबंधित में उपयोगी है. इस उच्च घनत्व पर चढ़ाना कोशिकाओं heathier संस्कृतियों होने के लिए योगदान देता है, तथापि, यह मुश्किल है के लिए विचार जो प्रक्रिया अंतर्गत आता है जो सेल शरीर GFP नकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 3) में.
यदि आप electroporated कोशिकाओं के ठीक प्रक्रियाओं के सभी देखने में परेशानी है, तो आप या तो GFP डीएनए की एकाग्रता है कि आप के लिए GFP की अभिव्यक्ति में वृद्धि electroporating रहे हैं वृद्धि कर सकते हैं, या आप अलग कोशिकाओं immunostain विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं (Invitrogen से ) के साथ एक Cy2 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ.
चित्रा 1 E15.5 चूहों Sprague-Dawley. प्लाज्मिड GFP के साथ electroporated थे और तीन दिन बाद काटा . इलेक्ट्रोड के स्थान के आधार पर, प्रांतस्था के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित किया जाएगा. पूरे दिमाग में वायुसेना शो GFP प्रतिदीप्ति.
चित्रा 2. E15.5 (ए) या E17.5 (बी) Sprague-Dawley चूहों GFP प्लाज्मिड और प्रसव के बाद 5 दिन में फसल के साथ electroporated थे . दिमाग तय sectioned coronally एक vibratome (100 माइक्रोन वर्गों) का उपयोग कर, और Oct6 (लाल) के लिए immunostained. A और B immunostained वर्गों के confocal छवियों दिखा.
चित्रा 3. E15.5 Sprague-Dawley चूहों प्लाज्मिड GFP के साथ electroporated थे . Electroporation निम्नलिखित 24 घंटे, दिमाग काटा गया और GFP - सकारात्मक, electroporated क्षेत्रों dissected और थे dissociated है, के रूप में वीडियो में वर्णित है. इन विट्रो में 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं तय थे और immunostained bIII - ट्यूबिलिन (लाल) के लिए और DAPI (नीला) (ए, सी) के साथ धुंधला हो जाना नाभिक. सबसे लंबे समय तक neurite की लंबाई AxioVision सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था(बी, डी).
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Discussion
प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के इन विट्रो अध्ययन में neurite परिणाम की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं . आदेश में अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक परिवर्तन neuronal प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित करने के लिए, shRNA या misexpression constructs रासायनिक अभिकर्मक या वायरल पारगमन के माध्यम से प्राथमिक न्यूरॉन्स में पेश किया जा सकता है. हालांकि, प्राथमिक cortical कोशिकाओं के साथ, सेल प्रकार (विभिन्न परतों, निरोधात्मक न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं से glutamatergic न्यूरॉन्स) के एक विषम पूल इन तरीकों का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं. भ्रूण कृंतक प्रांतस्था में डीएनए constructs परिचय utero electroporation में के उपयोग के लिए लक्षित किया जा कोशिकाओं के कुछ सबसेट के लिए अनुमति देता है: जबकि जल्दी प्रांतस्था के भ्रूण प्रांतस्था लक्ष्य गहरी परतों के electroporation देर भ्रूण timepoints पर electroporation अधिक सतही परतों लक्ष्य. इसके अलावा, प्रांतस्था के पृष्ठीय औसत दर्जे बनाम उदर - पार्श्व क्षेत्रों का लक्ष्यीकरण में व्यक्तिगत भ्रूण परिणामों के सिर में इलेक्ट्रोड के अंतर स्थान.
विशिष्ट परतों के लक्ष्य:
जब आप पार्श्व वेंट्रिकल में डीएनए इंजेक्षन और electroporate, केवल तुरंत पार्श्व venrtricle अस्तर कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं: इन कोशिकाओं रहे हैं neocortex के रेडियल glial पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं है कि सिर्फ अपने टर्मिनल पिंजरे का बँटवारा आया है. दिलचस्प है, जब electroporation निम्नलिखित दिनों में जांच, लक्षित कोशिकाओं birthdated कोशिकाओं के पैटर्न मैच. दूसरे शब्दों में, कोशिकाओं है कि पैदा कर रहे हैं, कि उन है कि electropoartion के दिन पर उनके टर्मिनल समसूत्री विभाजन से गुजरना कहना है, कोशिकाओं है कि लक्षित कर रहे हैं हैं. के बाद से रेडियल glial कोशिकाओं को भी निलय सतह पर मौजूद हैं, एक है कि इन कोशिकाओं को लक्षित किया जाएगा परिकल्पना है, और हो सकता है कि इन कोशिकाओं से संतान के सभी भी लक्षित किया जाएगा. हालांकि, यह मामला नहीं है, बाद में कक्षों की पीढ़ियों GFP व्यक्त नहीं करते. यह हो सकता है कि रेडियल glial कोशिकाओं में विभाजन के कई दौर प्लाज्मिड बाहर dilutes.
अनुप्रयोग:
इस विधि के लिए जीन के प्रभाव shRNA contructs की electroporation के माध्यम से नीचे दस्तक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीडीएनए constructs के misexpression द्वारा की जांच के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है. हम neurodegeneration और मनोरोग बीमारी में शामिल जीनों का अध्ययन करने के लिए इस techniqe के आवेदन कर रहे हैं. इस तकनीक के माध्यम से, हम दोनों जंगली प्रकार और इन बीमारियों में महत्वपूर्ण जीन उत्परिवर्ती रूपों परिचय, और neuronal आकारिकी पर प्रभाव की जांच. इसके अलावा, हम सीडीएनए और shRNA contruct सह electroporating अंतर्जात जीन उत्पाद के अभाव में उत्परिवर्तन या वैकल्पिक ब्याह संस्करण अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच कर सकते हैं. नीचे एकाधिक जीन दस्तक और अन्य जीन 8 उत्पादों, 9 के साथ एक जीन उत्पाद के नीचे दस्तक के प्रभाव बचाव के प्रयास: सह electorporation दो जीन उत्पादों के बीच आनुवंशिक बातचीत को देखने का उपयोग किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस तकनीक पर उपयोगी विचार - विमर्श के लिए यूसुफ LoTurco और डेनिस Selkoe धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों अमेरिकी स्वास्थ्य सहायता फाउंडेशन के दानदाताओं इस शोध के समर्थन के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
| 15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| 50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
