Summary
ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.
Abstract
במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרי מאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA cDNA יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכת הטרוגנית של סוגי תאים (נוירונים glutamatergic משכבות שונות, נוירונים מעכבים, ותאי גלייה) הם transfected שימוש בשיטות אלה. השימוש ב electroporation ברחם להציג בונה DNA בקליפת מכרסם עובריים מאפשרת תת מסוימים של תאים להיות ממוקד: בעוד electroporation של עוברי מטרות שכבות מוקדם קליפת עמוק של קליפת המוח, electroporation ב timepoints עובריים מאוחר מטרות שכבות שטחית יותר. יתר על כן, מיקום ההפרש של אלקטרודות על פני ראשיהם של עוברי תוצאות בודדים המיקוד של אזורים הגבי-המדיאלי לעומת הגחון-רוחבי של קליפת המוח. בעקבות electroporation, תאים transfected יכול להיות גזור החוצה, ניתק, והוא מצופה במבחנה על ניתוח כמותי של תולדה neurite. כאן, אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד כדי למדוד כמותית תולדה תהליך תת העצבית של תאים בקליפת המוח.
הפרוטוקול הבסיסי של electroporation ברחם תוארה בפירוט בשני מאמרים יופיטר אחרים מן המעבדה Kriegstein 1, 2. אנו נספק סקירה כללית של פרוטוקול שלנו ב electroporation ברחם, תוך התמקדות בפרטים החשובים ביותר, ואחריה תיאור של פרוטוקול שלנו, כי חל electroporation ברחם כדי לחקור את תפקוד הגן תולדה תהליך עצבי.
Protocol
הפרוטוקול הבסיסי של electroporation ברחם תוארה בפירוט במאמר אחר יופיטר ממעבדת Kriegstein 1, 2. טכניקה זו תוארה לראשונה במעבדה Osumi 3 ופרוטוקול שלנו מבוסס על אחד שפותח במעבדה LoTurco 4. אנו נספק סקירה כללית של פרוטוקול שלנו ב electroporation של עוברים ברחם חולדה, תוך התמקדות בפרטים החשובים ביותר, ואחריה תיאור של פרוטוקול שלנו, כי חל electroporation ברחם כדי לחקור את תפקוד הגן תולדה תהליך עצבי.
1. Electroporation ברחם
- הכנת מחטים DNA וטעינה
הצעד הראשון שכן electroporations ברחם היא לתכנן את הניסוי כדי לקבוע מה-DNA בונה אתה רוצה להזריק. שיטה זו שימושית עבור שניהם misexpressing או דריסה הגנים של עניין. אם אתם מתכננים על גן misexpressing או overexpressing, הקפד להשתמש האמרגן כי הוא פעיל בתאי מבשר עצביים. אנו ממליצים על האמרגן CAGGS, אשר מורכב של האמרגן עוף ביתא אקטין ואת משפר CMV 5. מאז רק תת קבוצה קטנה של תאים transfected משתמש electroporation ברחם, חשוב לכלול קידוד פלסמיד חלבון פלואורסצנטי כגון GFP, כך שתוכל לעקוב אחר תאים אלה שהיו electroporated בהצלחה. עבור ה-GFP הקידוד פלסמיד, אנו ממליצים להכין את ה-DNA בריכוז של 0.5 מיקרוגרם לכל microliter. עבור בונה shRNA, מצאנו כי 0.5-1.0 מיקרוגרם לכל התוצאות μL ב יעיל להפיל של הגן העניין שלך. עבור overexpression או misexpression, אנו משתמשים בין 1.0 ו - 3.0 מיקרוגרם לכל microliter, תלוי בגודל של הגן לבין רמת ביטוי בניסוי קורא. DNAs מוכנים באמצעות ערכת רעלן פנימי ללא Qiagen הכנה, ואת מדולל 1 x PBS. אנו להזריק כ 0.5-1.0 μL לכל המוח העוברי, ולכן, עבור פסולת של בעלי חיים אנו מכינים 10 μL של תערובת DNA להזרקה. אנו מוסיפים 1 μL של גרין מהיר ל-DNA, כך שנוכל לבצע את ה-DNA מוזרק.
משיכת מחטים הצורה הנכונה היא שלב קריטי. Walantus et al. משתמשת במערכת שונה לאספקת ה-DNA וכך מכין מחט שלהם הוא גם שלנו 1,2 אז שונה slighly. ההגדרות שבהן אתה משתמש כדי למשוך את המחטים שלך יהיה תלוי המותג של חולץ מחט שיש לך. אנו משתמשים במודל 750 מ דוד Kopf. ההגדרות אנו משתמשים הם: מחממים 1: 9.0, מחממים 2: 0, Soleniod: 0, גודל חוט 3.0 מ"מ, הסמיכות מחמם: 3 מ"מ, זמן: 10 שניות. משך פעם, חתכנו מחטים שלנו עם סכין גילוח בזווית של 45 מעלות ~ כך המרחק בין החלק הגדול ביותר של פתיחת לקצה הוא 11 מ"מ. לאחר מכן אנו לטעון את ה-DNA מהקצה האחורי של המחט. לאחר מכן למלא את החלל שנותר המחט עם שמן תירס. עבור זריקה DNA, אנו משתמשים III Picospritzer. בהתאם שפוע המדויק כי הוא חתך את כל מחט, אנו קובעים את Picospritzer 4.0-6.0. אנו משתמשים דוושת הרגל כדי לספק את האוויר הדחוס כי גירשה את ה-DNA מן המחט. - הכנת בעלי חיים לניתוח
אנו משתמשים הפתוגן ללא חולדות Sprague Dawley בלעדית עבור ניתוחים אלה. מעבדות אחרות כמה להשתמש בעכברים של גנוטיפים שונים גם כן. כאן אנו מתארים להראות פרוטוקול שלנו electroporation של E15 עוברי חולדה, אבל ברחם electroporation מבוצע באופן שגרתי אצל חולדות בגילאים E13 ו E18. בעוד electroporation בשלב מוקדם מטרות רבדים עמוקים של קליפת המוח, בשלב מאוחר יותר electroporations היעד שכבות שטחית יותר.
בעלי חיים מקבלים מנה טרום ניתוחית של עצירות (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) לפני הניתוח מתחיל. ישנן אפשרויות רבות עבור הרדמה החי. Walantus et al. מנצל משאיפת isofuorane, בעוד אנו משתמשים באופן שגרתי בזריקה intraperitoneal של קטאמין (4-80 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (50-10 מ"ג / ק"ג) 1,2. קמצוץ הבוהן תמיד צריך להתבצע על מנת להבטיח כי בעלי החיים מורדמים מלא להגיב. בעלי חיים מוחזקים על משטח מחומם לאורך ההליך הכירורגי.
הפרווה של בעל החיים הוא מגולח באזור החתך, ורחץ שלוש פעמים עם אתנול ואחריו שלוש פעמים עם יוד. מבצעים חתך בעור לרוחב רק קו האמצע, ואחריו חתך השריר. קרניים הרחם נחשפים בזהירות רבה. הם התגרו בעדינות מתוך חלל הגוף באמצעות קצות האצבעות. שמור עוברים hydrated עם PBS סטרילית בזמן שהם מחוץ לחלל הגוף. - הזרקת DNA ו electroporation
בעת ההפעלה הראשונה של ביצוע ניתוחים אלה, החלק הקשה ביותר הוא היכרות עם שבו אתה צריך להזריק את ה-DNA, כך שתוכל למלא את החדרים לרוחב, ו להתרגל כמה עמוק אתה להזריק המחט שלך כדי להכות את האזור הנכון. עוברים הם מניפולציה בעדינות עם קצות האצבעות שלך, כך שאתה יכול הזיהויify איפה הראש, ואם תסתכלו היטב תוכלו לראות את תפר קו האמצע. זה משמש כנקודת ציון כללי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע היכן ממוקם לרוחב החדר. אנו מזריקים את הדנ"א דרך דופן הרחם לתוך החדר לרוחב. אנו משתמשים footpedal לשלוט על זריקה של ה-DNA - פולסים מרובים של ה-DNA מבוצעות עד לרוחב החדר מתמלא הדנ"א / תערובת צבע. לאחר מכן, אנו מקום ההנעה אלקטרודות משני צידי ראשו של העובר ושימוש אחר footpedal כדי לספק את הדופק על הראש של העובר. מיקום האלקטרודות הוא קריטי בקביעת באזור של קליפת המוח היא electroporated. מאז ה-DNA הוא מטען שלילי, ה-DNA ינועו לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר הממונה הוא פיזר ברחבי המשוטים. בהתאם למיקום המדויק של האלקטרודות, תת שונים של תאים יהיו ממוקדות. אנו שגרתי במקום אלקטרודה חיובית ליד הגבי-המדיאלי עמדות ברחבי המוח הגדול. עם זאת, במעבדה הראו כי LoTurco יפה אם אתה במקום אלקטרודות יותר באזורים לרוחב הגחון של המוח הגדול ניתן למקד את התאים של קליפת המוח, striatal תאים הגבול ולהכות של הנחל קליפת המוח לרוחב 6. כל העובר יכול להיות electroporated, ושילובים שונים של מבנים DNA יכול לשמש כל העובר. - תפירת ו שלאחר הניתוח טיפול
בעקבות electroporation של כל העוברים, קרניים הרחם מוחזרים בזהירות לחלל הגוף, הן את שכבת השריר ואת העור הם sutured. הטכניקה לכך היא המתוארים Walantus ואח' 1,2. בעלי חיים מנוטרים באופן רציף עד שהם להתאושש מן ההרדמה, ואת עצירות כאבים (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) מנוהל כל 8-12 שעות.
2. Culturing Electroporated נוירונים קליפתיים
- מסיק המוח electroporated ו לנתח באזור electroporated
עבור vivo בניתוחים הבאים electroporation ברחם, בעלי חיים ניתן לקצור בכל נקודת זמן של 24 שעות בעקבות electroporation מוקדם לאחר הלידה ועד לבגרות. עם זאת, כאשר נוירונים culturing העיקרי שאנחנו קוצרים 24 שעות לאחר electroporation ב E16. בשלב זה, את העוברים electroporated מביעים רמות לגילוי של ה-GFP.
בעלי חיים מורדמים באמצעות פחמן דו חמצני שאיפה עריפת ראש מהירה. עוברים הם גזור מתוך הרחם והושמו HBSS עם קטיונים divalent, שמירה על מסלול של אשר היו עוברים electroporated שבה פלסמידים DNA. זה קריטי להשתמש HBSS מסונן, צינורות סטרילית צלחות וכלי autoclaved לנתיחה. בקליפת המוח הם גזור החוצה קרומי המוח הסיר באמצעות מיקרוסקופ במנדף. הקורטקס אלה נצפו אז תחת מיקרוסקופ לנתח עם היכולת לחזות GFP. אזורים GFP החיובי של קליפת המוח מזוהים, ואנחנו ue זוג vanna מספריים לחתוך את האזורים GFP חיובית בקליפת המוח. יצירות אלה ממוקמים HBSS ללא קטיונים divalent בצינור חרוטי 15 מ"ל. - Dissociating ו ציפוי נוירונים
לאחר כל האזורים GFP חיוביים גזור, HBSS מוחלף טריפסין 0.25%, ו מודגרות ב 37 מעלות במשך 5 דקות. טריפסין מוסר, החליף עם התקשורת ציפוי (DMEM + 5% FBS + פן / סטרפטוקוקוס גלוטמין +), ו 5-7 פעמים triturated לנתק את התאים. כרכים להשתמש תלויה בכמות רקמת הנוכחי. תאים ניתק הם מצופה מכן על CC2 שקופיות קאמרית מצופה. עבור שתי שקופיות קאמרית, אנו צלחת 200,000-350,000 תאים לכל תא בנפח של 1.5 מ"ל של התקשורת ציפוי. לאחר 4 שעות, התקשורת היא ציפוי aspirated והחליפו עם 1.5 מ"ל התקשורת העצבית תרבות (Neurobasal מדיה + B27 + תוספת + glutamax gentamycin) לכל תא.
3. ניתוח תולדה תהליך עצבי
- תיקון ו immunostaining תרבויות
כדי למדוד effecs לטווח קצר של מניפולציה גנטית של תאים אלה, שאנחנו קוצרים את הנוירונים העיקריים לאחר שלושה ימים במבחנה. אם הנוירונים העיקריים הם להיות מתורבת יותר עבור ניתוח נוסף, חצי התקשורת יש להחליף כל שלושה ימים. לתיקון תרבויות, אנו לשאוב את התקשורת בין התאים, ולתקן את הנוירונים paraformaldhyde 4% במשך 15 דקות. בעקבות קיבעון, תאים נשטפים פעמיים ב PBS ולשים אז הפתרון חוסם (נסיוב החמור 2% עם 0.1% Triton X-100 ב PBS) במשך שעה אחת. תאים מודגרת מכן במשך שעה 1 של נוגדן ראשוני. עבור ניתוחים תולדה של תהליך עצבי, אנו משתמשים אנטי בטא נוגדן tubululin לזהות נוירונים - בטא טובולין immunostaining II תוויות הגוף neruonal התא, דנדריטים ואקסונים. תאים נשטפים אז שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות, ולאחר מכן במשך שעה מודגרות 1 בעכבר Cy3 אנטי, ואחריו עוד שלושה שוטף PBS, counterstaining גרעינים עם DAPI ועל הרכבה. - מדידת neאורך urite
תמונות של ה-GFP חיובית, בטא III נוירונים טובולין חיוביים נרכשים על Axioskop Zeiss עם מערכת MC100 מצלמה. מספר משתנים ניתן לבדוק תאים אלה GFP חיובי כולל אורך neurites כל, אורך neurite הארוך, הסתעפות של neurites, בגודל של תא סומה, וכו 'יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תולדה תהליך עצבי על להפיל או ביטוי יתר של הגנים הנוגעים neurodevelopment ו ניוון מוחיים, עם דגש על אורך תהליך עצבי. כדי למדוד תוצאה תהליכים עצביים, אנו משתמשים AxioVision LE 4.4 תוכנה (מ Zeiss). בתוך תוכנה זו, קיימת אפשרות לבחור את הכלי "מתאר". באמצעות כלי זה, אתה יכול להשתמש בעכבר המחשב כדי לעקוב אחר משך כל תהליך עצבי. זה קריטי כדי להגדיר את המטרה שבה אתה משתמש על מנת לקבל מדד מדויק של neurites שלך. עבור ניתוחים אלו, אנחנו בדרך כלל להשתמש מטרה 20x.
4. נציג תוצאות
מצאנו כי ספראג גודל Dawley פסולת נע בין 6 ל 14 עוברים. בדרך כלל אנחנו electroporate כל העוברים. כל העובר יכול להיות electroporated עם שילוב שונה של DNAs. עם זאת, אנו בדרך כלל electroporate לפחות ארבעה מוחות עם מצב דומה ובריכת אלה מוחות לפני dissociating ו ציפוי.
מצאנו כי בשיטה זו כ -75% מוחות electroporated ממוקדות לאזור הרצוי של קליפת המוח, בין אם זה להיות הגבי הקורטקס המדיאלי או לרוחב הגחון (איור 1). בנוסף, מצאנו electroporations מוקדמת E13-14 עמוק היעד הנוירונים בשכבה כגון Tbr1 נוירונים שכבה VI חיובי, בעוד electroporations מאוחר היעד CTIP2 חיובי, שלילי TBR1 V שכבת תאים, ועדיין מאוחר יותר electroporations היעד Brn2 חיובי II / III שכבת התאים. תיאור מצוין של סמנים שונים ההסבר מפרט תת נוירונים בקליפת המוח נמצא בתוך מאמר של Moleneaux ואח' 7. תרשים 2 מציג קטעים העטרה של המוח electroporated ביום או עובריים 15.5 או 17.5 וקצרו ביום הלידה 5. באדום הוא immunostaining עבור Oct6. אתה יכול immunostain עבור סמנים בתרבות כדי לאשר את מה שכבת אוכלוסיות תאים התמקדת. מצאנו כי אתה יכול לצפות היעד התא אותו שכבת אוכלוסיה של התאים בעובר בכל המלטה אותו (במילים אחרות, את המיקוד תלויה timepoint העוברי ולא לאחר מכן על וריאציות טכניים אחרים).
בתרבות, אחוז התאים ה-GFP חיובית יכולה מגוון נרחב תלוי איך אתה שמרני כאשר מנתחים את אזור ה-GFP חיוביים (איור 3). עם זאת, גם כאשר אנחנו שמרנים מאוד לנתח רק את תיקון ה-GFP חיובית של תאים, האחוז הגבוה ביותר שאנו רואים הוא 5-10% - למרות שאתה לנתח את האזור של קליפת המוח אשר electroporated, התאים בשכבה אחת בלבד יהיה להיות ממוקד. זה effciency transfection נמוך מסייעת לזהות אילו תהליכים שייכים לתא electoporated שאתה ניתוח. תאים ציפוי בצפיפות גבוהה זה תורם שיש תרבויות heathier, לעומת זאת, קשה להבחין מה שייך תהליך שבו הגוף התא בתאי ה-GFP שלילי (איור 3).
אם אתם מתקשים לראות את כל התהליכים קנס של תאים electroporated, אתה יכול גם להעלות את ריכוז ה-DNA-GFP שאתה electroporating להגדיל את הביטוי של ה-GFP, או שאתה יכול immunostain ניתק את התאים באמצעות נוגדן אנטי-GFP (מ Invitrogen ) יחד עם הנוגדן Cy2 משנית.
באיור 1. E15.5 Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד וקצרו כעבור שלושה ימים. בהתבסס על המיקום של האלקטרודות, באזורים שונים של קליפת המוח יהיו ממוקדות. AF להראות GFP הקרינה במוח כולו.
איור 2. E15.5 (א) או E17.5 (ב) Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד וקציר ביום הלידה 5. המוח תוקנו, מחולק coronally באמצעות vibratome (100 סעיפים מיקרון), ו immunostained עבור Oct6 (אדום). A ו-B להראות תמונות confocal סעיפים immunostained.
איור 3. E15.5 Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד. 24 שעות לאחר electroporation, המוח נקצרו GFP חיובי, אזורים electroporated נותחו ו ניתק, כפי שמתואר בסרט. אחרי 3 ימים במבחנה, התאים היו קבועים immunostained עבור טובולין-bIII (אדום) מכתים גרעינים עם DAPI (כחול) (A, C). אורכו של neurite הארוכה ביותר נמדדה בעזרת תוכנה AxioVision(ב, ד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרית לאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA misexpression יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכת הטרוגנית של סוגי תאים (נוירונים glutamatergic משכבות שונות, נוירונים מעכבים, ותאי גלייה) הם transfected שימוש בשיטות אלה. השימוש ב electroporation ברחם להציג בונה DNA בקליפת מכרסם עובריים מאפשרת תת מסוימים של תאים להיות ממוקד: בעוד electroporation של עוברי מטרות שכבות מוקדם קליפת עמוק של קליפת המוח, electroporation ב timepoints עובריים מאוחר מטרות שכבות שטחית יותר. יתר על כן, מיקום ההפרש של אלקטרודות על פני ראשיהם של עוברי תוצאות בודדים המיקוד של אזורים הגבי-המדיאלי לעומת הגחון-רוחבי של קליפת המוח.
מיקוד של שכבות מסוימות:
כאשר אתה להזריק דנ"א לתוך החדר לרוחב electroporate, רק התאים מיד רירית venrtricle לרוחב ממוקדות: תאים אלו הם תאים ובתאים גליה רדיאלי של הניאוקורטקס, כמו גם תאים שעברו מיטוזה רק מסוף שלהם. מעניין לציין, כי כאשר נבחנת בימים שלאחר electroporation, התאים הממוקדים להתאים את התבנית של תאים birthdated. במילים אחרות, התאים נולדים, כלומר אלה עוברים מיטוזה מסוף שלהם ביום electropoartion, הם תאים אשר ממוקדות. מאחר ותאי גלייה רדיאלי גם נמצאים על פני החדר, אפשר לשער כי התאים האלה יהיו ממוקדות, וכי כל הצאצאים מן התאים האלה גם יהיה ממוקד. עם זאת, זה אינו המקרה, לאחר דורות של תאים אינם מבטאים GFP. ייתכן כי מספר סיבובים של חלוקת בתאי גליה רדיאלי מדלל את הפלסמיד.
יישומים:
שיטה זו היא דרך מצוינת לבחון את ההשפעות של הגן להפיל באמצעות electroporation של contructs shRNA, כמו גם על ידי misexpression של מבנים cDNA. אנחנו החלת techniqe לחקור את הגנים מעורבים בתהליכי ניוון מוחיים ומחלות פסיכיאטריות. באמצעות טכניקה זו, אנו מציגים הן סוג בר וצורות מוטציה של גנים קריטי המחלות הללו, ולבחון את ההשפעות על מורפולוגיה עצביים. בנוסף, אנו יכולים לבחון את ההשפעות של מוטציה או ביטוי חלופה חלופה אחוי בהעדר המוצר גן אנדוגני על ידי שיתוף electroporating cDNA לבין contruct shRNA. Co-electorporation גם יכול להיות מנוצל להסתכל אינטראקציות גנטיות בין שני מוצרים גן: על ידי דריסה גנים מרובים תוך ניסיון להציל השפעות להפיל המוצר גן אחד עם מוצרים אחרים גן 8, 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות יוסף LoTurco ודניס Selkoe לדיונים מועיל על הטכניקה הזו. המחברים מודים לתורמים של קרן הבריאות האמריקאית לסיוע, לתמיכה של מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
| 15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| 50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
