Summary
В электропорации внутриутробно является ценным методом трансфекции клеток-предшественников нейронов в живом организме. В зависимости от размещения электродов и развития timepoint электропорации, некоторые подмножества клеток коры могут быть направлены. Целевые клетки могут быть проанализированы в естественных условиях или в пробирке для воздействия генетических изменений.
Abstract
В пробирке изучение первичных нейронов культур позволяет количественного анализа аксонов. Для того, чтобы изучить, как генетические изменения влияют на нейронные результатом процесса, shRNA или кДНК конструкции могут быть введены в первичные нейроны с помощью трансфекции химического или вирусной трансдукции. Тем не менее, с первичным корковых клеток, гетерогенных бассейн типов клеток (нейронов глутаматергической из разных слоев, тормозящие нейроны, глиальные клетки) трансфекции с помощью этих методов. Использование внутриутробно электропорации ввести конструкций ДНК в эмбриональных коре грызунов допускает определенные подмножества ячеек, которые будут целевые: в то время электропорации ранней эмбриональной коры цели глубоких слоях коры, электропорации на поздних эмбриональных timepoints цели более поверхностные слои. Кроме того, дифференциальные размещения электродов через головы отдельных результатов эмбрионов в адресности спинно-медиальной по сравнению с вентральной-боковых отделах коры. После электропорации, трансфицированных клеток можно разрезать из, диссоциированных и покрытие в пробирке для количественного анализа аксонов. Здесь мы предоставляем шаг за шагом метод количественного измерения нейронов результатом процесса в подмножествах корковых клеток.
Базового протокола в электропорации внутриутробно была подробно описана в двух других статьях Юпитера от Kriegstein лаборатории 1, 2. Мы предоставим обзор наших протокол электропорации в матке, уделяя особое внимание наиболее важные детали, за которым следует описание нашего протокола, который применяется в электропорации внутриутробно для изучения функции генов в нейронных результатом процесса.
Protocol
Базового протокола в электропорации внутриутробно был подробно описан в другой статье от Юпитера Kriegstein лаборатории 1, 2. Эта методика была впервые описана в Osumi лаборатории 3 и наш протокол основан на одной из развитых в LoTurco лаборатории 4. Мы предоставим обзор протокола для наших внутриутробно электропорации крысиных эмбрионов, сосредоточив внимание на наиболее важных деталях, а затем описание нашего протокола, который применяется во внутриутробном электропорации для изучения функции генов в нейронных результатом процесса.
1. В Электропорация внутриутробно
- Подготовка ДНК и загрузку игл
Первый шаг для внутриутробно electroporations заключается в разработке эксперимента, чтобы определить, что ДНК-конструкции вы хотите внедрить. Этот метод полезен для обеих misexpressing или сбить генов, представляющих интерес. Если вы планируете misexpressing или гиперэкспрессией гена, не забудьте использовать промотор, который активно участвует в нейронных клеток-предшественников. Мы рекомендуем промоутер CAGGS, который состоит из куриных бета-актин промотора и ЦМВ усилитель 5. Так как только небольшая часть клетки трансфицированных использования в электропорации внутриутробно, крайне важно, чтобы включить плазмиды, кодирующей флуоресцентного белка GFP, такие как, так что вы можете следовать те клетки, которые были успешно электропорации. Для плазмиды GFP кодирования, мы рекомендуем подготовке ДНК в концентрации 0,5 мкг на микролитр. Для конструкций shRNA, мы обнаружили, что 0,5-1,0 мкг в мкл приводит к эффективному сбить вашего гена. Для гиперэкспрессия или misexpression, мы используем между 1,0 и 3,0 мкг на микролитр, в зависимости от размеров гена и уровень экспрессии, что эксперимент предусматривает. ДНК готовятся с использованием Qiagen эндотоксина без приготовительные комплект, и разводят в 1 х PBS. Мы вводят примерно 0,5-1,0 мкл на эмбриональном мозге, так, для подстилки животным мы готовим по 10 мкл ДНК смесь для инъекций. Мы добавляем 1 мкл Быстрый Зеленый ДНК, так что мы можем следовать вводили ДНК.
Тяговая иглы правильной формы является важным шагом. Walantus и соавт. Использует другую систему для доставки ДНК и таким образом их иглы приготовительные также slighly отличается, то наши 1,2. Настройки, которые вы использовать, чтобы ваши иглы, будет зависеть от марки иглы съемник, что у вас есть. Мы используем модель 750 от Дэвида Kopf. Настройки, используемые нами: Тепло 1: 9,0, отопление 2: 0, Soleniod: 0, накаливания размером 3,0 мм, Обогреватель Удаленность: 3 мм, Время: 10 сек. Как только вытащил, мы сокращаем наши иглы с лезвием на ~ 45 градусов так, что расстояние от большей части открытия до кончика составляет 11 мм. Мы затем загрузить ДНК из задней части иглы. Затем заполнить оставшееся место в иглу с кукурузным маслом. Для инъекции ДНК, мы используем Picospritzer III. В зависимости от точных конических, которые разрезают на каждую иглу, мы устанавливаем Picospritzer от 4,0 до 6,0. Мы используем педаль для доставки сжатого воздуха, что исключает ДНК от иглы. - Подготовка животных к операции
Мы используем возбудителя без Sprague Dawley крыс исключительно для этих операций. Несколько других лабораториях использовать мышей различных генотипов, а также. Здесь мы описываем показать наш протокол электропорации E15 крысиных эмбрионов, но внутриутробно электропорации регулярно проводится у крыс в возрасте от E13 и E18. Хотя ранние стадии электропорации цели глубоких слоев коры, позже electroporations запланированной стадии более поверхностные слои.
Животные даны дооперационном дозы бупренорфина (0,05-0,1 мг / кг) до операции начинается. Есть несколько вариантов для обезболивающим животного. Walantus и соавт. Использует isofuorane ингаляции, в то время как мы обычно используем внутрибрюшинного введения кетамина (40-80 мг / кг) и ксилазина (5-10 мг / кг) 1,2. Носок щепотку всегда должны быть выполнены, чтобы обеспечить, что животные полностью под наркозом и не отвечает. Животные находятся на обогреваемой площадки всей хирургической процедуры.
Мех животного бритой в области разреза, и трижды промывали этанолом следуют три раза йодом. Надрез в коже только сбоку от средней линии, после чего разрез в мышце. Рогах матки подвергаются очень тщательно. Они мягко дразнили из полости тела с помощью пальцев. Держите эмбрионов гидратированных стерильной PBS в то время как они находятся вне полости тела. - Потребители инъекционных ДНК и электропорация
При первом запуске выполнения этих операций, самая сложная часть становится все знакомы с тем, где нужно вводить ДНК так, что вы заполните боковых желудочков, и привыкание к как глубоко Вы вводите иглу для того, чтобы поразить правильный регион. Эмбрионы осторожно манипулировать кончиками пальцев, так что вы можете идентримента, где голова, и если вы посмотрите внимательно, вы сможете увидеть средней линии шва. Это служит общим ориентиром, который можно использовать, чтобы определить, где бокового желудочка находится. Мы вводят ДНК через стенку матки и в боковой желудочек. Мы используем педали для управления инъекции ДНК - несколько импульсов ДНК выполняются до боковой желудочек наполняется ДНК / красителя смеси. Мы затем поместить электроды веслом по обе стороны головы эмбриона и использовать другой педали для доставки импульса по голове эмбриона. Размещение электродов имеет решающее значение в определении того, какие области коры электропорации. Поскольку ДНК заряжена отрицательно, ДНК будет путешествовать к положительному электроду, когда заряд рассеивается по всему весла. В зависимости от точного размещения электродов, различные подмножества клеток будут направлены. Мы регулярно место положительного электрода около спинно-медиальной позиции через головной мозг. Тем не менее, LoTurco лаборатории прекрасно показал, что если вы размещаете электродов в более вентральной боковых областей головного мозга можно ориентировать клетки коры-полосатой границу и нажмите клетки коры боковой поток 6. Каждый эмбрион может быть электропорации, а также различные комбинации ДНК-конструкции могут быть использованы в каждом эмбриона. - Наложение швов и послеоперационный уход
После электропорации всех эмбрионов, рогов матки тщательно вернулся в полости тела, и оба слоя мышц и кожи зашивается. Техника для этого изложены в Walantus и др. 1,2. Животные отслеживаются непрерывно, пока они оправиться от наркоза, и анальгетик бупренорфин (0,05-0,1 мг / кг) вводится каждые 8-12 часов.
2. Культивирование электропорации корковых нейронов
- Сбор электропорации мозги и рассекает электропорации регионе
Для анализа в естественных условиях в следующем электропорации внутриутробно, животные могут быть собраны в любой момент времени с 24 часов после электропорации в ранние сроки после рождения до совершеннолетия. Однако, когда культивирования первичных нейронов жмем 24 часов после электропорации на E16. В это время, электропорации эмбрионов выражают определяемые уровни GFP.
Животных усыпляют с использованием углеродных вдыхания газа и быстрое обезглавливание. Эмбрионы расчлененное из матки и помещают в HBSS с двухвалентных катионов, отслеживание которых эмбрионы были электропорации с которой ДНК плазмиды. Очень важно использовать фильтрованную HBSS, стерильные пробирки, тарелки, и автоклавного инструменты для вскрытия. Коре расчлененный, и мозговые оболочки удалены с помощью микроскопа в капюшон. Эти коры, затем наблюдается при вскрытии микроскоп с возможностью визуализации GFP. GFP положительные областей коры определены, и мы у.е. пару Vanna ножницы, чтобы вырезать GFP положительные регионов из коры головного мозга. Эти кусочки помещают в HBSS без двухвалентных катионов в 15 мл коническую трубку. - Диссоциирующего и покрытие нейронов
После того как все GFP положительные регионов рассеченные, HBSS заменяется на 0,25% трипсина и инкубировали при температуре 37 градусов в течение 5 минут. Трипсин удалена, заменена обшивка СМИ (DMEM + 5% + FBS Пенн / стрептококк + глютамин) и растирают в 5-7 раз, чтобы отделить клетки. Объемы использован зависит от количества ткани присутствует. Расхождение между Затем клетки высевают на СС2 покрытием слайды камеры. В течение двух слайдов камеры, мы пластины 200,000-350,000 клеток в камере в объеме 1,5 мл Покрытие СМИ. После 4-х часов, покрытие СМИ всасывается и заменить 1,5 мл нейронов питательных сред (Neurobasal СМИ + + B27 дополнения glutamax + гентамицин) в камере.
3. Анализ нейронов результатом процесса
- Фиксация и иммунной культур
Для того чтобы измерить краткосрочных effecs генетических манипуляций этих клеток, жмем первичных нейронов после трех дней в лабораторных условиях. Если первичные нейроны, чтобы быть культурными больше времени для дополнительных анализов, половина из средств массовой информации следует менять каждые три дня. Для крепления культур, мы аспирата средств массовой информации из камеры, и исправить нейронов в 4% paraformaldhyde течение 15 минут. После фиксации, клетки промывают два раза в ФСБ, а затем положить в блокировании решения (2% осла сыворотки с 0,1% Тритон Х-100 в PBS) в течение одного часа. Затем клетки инкубировали в первичных антител в течение 1 часа. Для анализа нейронных результатом процесса, мы используем анти-бета tubululin антитела для выявления нейронов - бета-II тубулина иммуноокрашивания этикетки neruonal тела клетки, дендритов и аксонов. Затем клетки промывали три раза в PBS в течение пяти минут, а затем инкубировали в Cy3-анти мыши в течение 1 часа, после чего еще три моет PBS, counterstaining ядер с DAPI и монтаж. - Измерение пеurite длины
Изображения GFP положительные, бета-III тубулина положительные нейроны, приобретенных на Axioskop Zeiss с MC100 камеры. Некоторые переменные могут быть рассмотрены в этих GFP-положительных клеток в том числе длина всех невриты, длина самого длинного аксонов, ветвление невриты, размер ячейки сомы, и т.д. Мы использовали этот метод для анализа нейронных результатом процесса на сбить или гиперэкспрессия гена касающиеся развития нервной системы и нейродегенеративные, с акцентом на нейронную длина процесса. Для того чтобы измерить нейронов результатом процессов, мы используем AxioVision LE 4,4 программное обеспечение (от Zeiss). В рамках этой программы, появляется возможность выбрать "контур" инструмент. Используя этот инструмент, вы можете использовать мышь компьютера отслеживать длину каждого нейрона процесса. Очень важно определить цель, которую вы используете, чтобы получить точный показатель вашего невриты. Для этих анализов, мы обычно используем 20x цели.
4. Представитель Результаты
Мы обнаружили, что Sprague Dawley помет размер колеблется от 6 до 14 эмбрионов. Мы обычно electroporate всех эмбрионов. Каждый эмбрион может быть электропорации с другой комбинацией ДНК. Тем не менее, мы, как правило electroporate по крайней мере четыре мозги с тем же условием и объединять эти мозги перед диссоциирующего и обшивки.
Мы обнаружили, что с этой техникой примерно 75% электропорации мозги ориентированы на желаемую область коры, был ли это спинной медиальной боковой или вентральной коры (рис. 1). Кроме того, мы нашли рано electroporations на E13-14 целевых нейронов глубоких слоев, таких как Tbr1 положительный слой нейронов VI, а позже electroporations целевой Ctip2 положительным, TBR1 негативные клетки V слоя, а еще позже electroporations целевой Brn2 положительный слой II / III клеток. Замечательное описание различных маркеров и объяснение нейронов спецификации подтипа в коре найдены в статье Moleneaux и др. 7. На рисунке 2 показан корональные разделы мозги электропорации на обоих эмбриональных день 15,5 или 17,5 и собирают в послеродовой день 5. Показанный в красном иммуногистохимическое Oct6. Вы можете immunostain для маркеров в культуре, чтобы подтвердить то, что население слой клеток, на которые ориентированы. Мы обнаружили, что вы можете рассчитывать на целевую же населения клеточного слоя клеток в каждом зародыш одного помета (другими словами, зависит от ориентации эмбриональных timepoint а не на другие технические изменения).
В культуре, процент клеток, которые являются положительными GFP может широко варьируются в зависимости от того, насколько консервативной вы находитесь, когда рассекает из GFP положительной области (рис. 3). Тем не менее, даже тогда, когда мы очень консервативны и рассекают только положительные GFP участок клетки, самый высокий процент, который мы наблюдаем в 5-10% - хотя вы рассекает область коры, которая была электропорации, клетки только в одном слое быть направлены. Такой низкий effciency трансфекции может помочь в определении, какие процессы относятся к electoporated ячейку, вы анализируете. Покрытие клеток при этом более высокую плотность способствует имеющих heathier культур, однако, трудно определить, какой процесс к какому телу клетки в GFP негативные клетки (рис. 3).
Если у вас есть проблемы со зрением все мелким процессы электропорации клеток, можно увеличить концентрацию ДНК GFP, что вы electroporating увеличить экспрессию GFP, или вы можете immunostain диссоциированных клеток с использованием анти-GFP антител (от Invitrogen ) вместе с Су2 вторичными антителами.
Рисунок 1. E15.5 Sprague-Dawley крыс электропорации с GFP плазмида и собраны три дня спустя. Основываясь на размещение электродов, различных областей коры будут направлены. А. Ф. показать GFP флуоресценции в целом мозг.
Рисунок 2. E15.5 () или E17.5 (B) Sprague-Dawley крыс электропорации с GFP плазмиды и урожай в послеродовой день 5. Мозги были фиксированными, секционные коронки использованием vibratome (100 микрон секций), и immunostained для Oct6 (красный). А и В показывают конфокальной образы immunostained разделов.
Рисунок 3. E15.5 Sprague-Dawley крыс электропорации с GFP плазмиды. 24 часов после электропорации, мозги были собраны и GFP-положительных, электропорации регионах были вскрыты и диссоциированных, как описано в видео. Через 3 дня в пробирке, клетки фиксируют и immunostained для BIII-тубулина (красный) и окрашивание ядер с DAPI (синий) (A, C). Длина самого длинного нейритов измерялась с помощью программного обеспечения AxioVision(B, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В пробирке изучение первичных нейронов культур позволяют количественного анализа аксонов. Для того, чтобы изучить, как генетические изменения влияют на нейронные результатом процесса, shRNA или misexpression конструкции могут быть введены в первичные нейроны с помощью трансфекции химического или вирусной трансдукции. Тем не менее, с первичным корковых клеток, гетерогенных бассейн типов клеток (нейронов глутаматергической из разных слоев, тормозящие нейроны, глиальные клетки) трансфекции с помощью этих методов. Использование внутриутробно электропорации ввести конструкций ДНК в эмбриональных коре грызунов допускает определенные подмножества ячеек, которые будут целевые: в то время электропорации ранней эмбриональной коры цели глубоких слоях коры, электропорации на поздних эмбриональных timepoints цели более поверхностные слои. Кроме того, дифференциальные размещения электродов через головы отдельных результатов эмбрионов в адресности спинно-медиальной по сравнению с вентральной-боковых отделах коры.
Адресная работа с конкретными слоями:
Когда Вы вводите ДНК в боковой желудочек и electroporate, только клетки сразу подкладкой боковые venrtricle предназначены: эти клетки радиальной глии клеток-предшественников в коре головного мозга, а также клетки, которые только что прошли свой терминал митоза. Интересно, что при исследовании в первые дни после электропорации, клетки целевой соответствуют шаблону из birthdated клеток. Иными словами, клетки, которые рождаются, то есть тех, которые подвергаются их терминал митоза в день electropoartion, являются клетки, которые являются мишенью. Поскольку радиальная глиальные клетки также присутствуют в желудочковой поверхности, можно было бы предположить, что эти клетки будут направляться, и что все потомство от этих клеток также быть направлены. Однако, это не так, последующие поколения клеток не выражают GFP. Вполне возможно, что несколько раундов деления в радиальных глиальных клеток разбавляет из плазмиды.
Области применения:
Этот метод является прекрасным способом для изучения влияния генов сбить с помощью электропорации contructs shRNA, а также misexpression кДНК конструкций. Мы применяем эту techniqe к изучению генов, участвующих в нейродегенеративные и психиатрические заболевания. С помощью этой техники, мы вводим как дикого типа и мутантных форм генов критическим при этих заболеваниях, а также изучить влияние на нейронные морфологии. Кроме того, мы можем рассмотреть последствия мутации или альтернативное выражение вариант соединение в отсутствие эндогенного продукта гена совместно electroporating кДНК и contruct shRNA. Сотрудничество electorporation также могут быть использованы, чтобы смотреть на генетических взаимодействий между двумя генных продуктов: от сбивания нескольких генов и, пытаясь спасти эффекты сбить одного гена продукт с другими продуктами гена 8, 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Иосифа LoTurco и Деннис Selkoe за полезные дискуссии на эту технику. Авторы выражают благодарность донорам Американский фонд содействия здравоохранению, за поддержку этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | GIBCO, by Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7.4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Biosciences | 351007 | |
| 15 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| 50 mL conical vial | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Hand-Held Tally Counter | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| NEUROBASAL Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX -I Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Gentamicin Reagent Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| beta-III tubulin antibody | Chemicon International | MAB1637 | |
| MAP2 antibody | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | |
| Fluorescent Mounting Media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR international | 48393-106 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| BTX square wave electroporator | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
