Summary
وorganoptypic ثقافة شريحة الحصين هو نموذج
Abstract
عضوي النمط ثقافة شريحة الحصين هو أسلوب في المختبر لدراسة آليات الإصابة العصبية التي يتم الاحتفاظ نسبيا بنية الأساسية وتكوين الحصين 1. منظومة الثقافة عضوي النمط يسمح لفحص الآثار العصبية ، ونجمي دبقية صغيرة ، ولكن كما استعدادا فيفو السابقين ، لا تعالج آثار تدفق الدم ، أو تجنيد خلايا التهابية الطرفية. تحقيقا لهذه الغاية ، وكثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب لدراسة الثقافة وإصابة excitotoxic نقص الأوكسجين إلى الخلايا العصبية في قرن آمون الهرمي ، ولكن قد استخدمت أيضا لدراسة الاستجابة الالتهابية. نحن هنا وصف الطرق لتوليد الثقافات شريحة من قرن آمون في الدماغ القوارض بعد الولادة ، وبالإدارة السامة المحفزات للحث على اصابة الخلايا العصبية ، ومعايرة وقياس موت الخلايا العصبية قرن آمون.
Protocol
1. إعداد
قبل البدء ، تجميع الصكوك اللازمة الجراحية ، والتشريح والإعلام والثقافة ، والفئران من العمر 7 أيام أو الجراء الماوس. البروتوكول هو نفسه لفأر والاستعدادات الفئران.
(ط) المواد والمعدات
- مقص التشغيل (طول مستقيم 6 "، القط # RS6818 ، Roboz ، غايثرسبيرغ ، MD)
- الجزئي تشريح مقص ، (4 طول "، القط # RS5910. Roboz ، غايثرسبيرغ ، MD)
- الكربون الصلب دومون الملقط (القط # RS - 5045.Roboz ، غايثرسبيرغ ، MD)
- تعديل الزجاج "نقل" ماصات (أسفل ماصة باستير وتلطيف إزالة الحافة)
- قطع من البلاستيك لفيلم Aclar 2 "في x 2" في المربعات (هانيويل ، # 812071 ، بوتسفيل ، والسلطة الفلسطينية)
- الإسفنج 4 في تغطية بنسبة 3 في (كندال ، القط # 3157 ، مانسفيلد ، MA)
- 30 غشاء Millicell إدراج ملم (0.4 ميكرومتر ؛ ميليبور ، بيدفورد ، ماجستير)
- Mcllwain المروحية الأنسجة مع شفرة ذو حدين (McILwain المروحية الأنسجة ، Vibratome الشركة ، وسانت لويس ، MO)
- المجهر المقلوب مع كاميرا CCD وصورة برامج التحليل
(ب) متوسطة تشريح (DM ، 1 لتر عند pH 7.3)
| هانك في سولت المتوازن | 1 فيال (95.2 g/1L) (سيغما : H2387) |
| NHCO 3 (4.2 ملم) | 350 ملغ |
| HEPES (10 ملم) | 2.83 ز |
| الجلوكوز (33.3 ملم) | 6.0 غرام |
| البنسلين / الستربتوميسين (100X) | 10 مل |
| BSA (0.3 ٪) | 300 ملغ |
| MgSO 4 - 7H 2 O | 1.44 ز |
(ج) الثقافة المتوسطة (400 مليلتر)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 مل |
| *** الملح في ميزان هانك (Invitrogen 24020-117) | 100 مل |
| حصان المصل (Invitrogen 26050-070) | 100 مل |
| HEPES العازلة (1 M ؛ Invitrogen 15630-080) | 5 مل |
| البنسلين / الستبرتوميسين (100X) | 4 مل |
| *** أضف إلى 12.8 الجلوكوز ز ملح 500 مل ميزان هانك قبل اتخاذ مستنبت | |
(رابعا) الحيوانات
العمر الفئران لمدة 7 أيام أو بعد الولادة الجراء الماوس ، وعموما لتر واحد لكل تجربة.
2. يوم الثقافة
- يجب أن تكون غارقة جميع الأدوات والأفلام تشريح Aclar في ETOH 70 ٪ لمدة 30 دقيقة قبل بداية. ويجب تطهيرها على سطح القلنسوة تشريح ، شفرة ، والمروحية الأنسجة مع الايثانول.
- إعداد عدة (3-4) 6 زراعة الأنسجة بشكل جيد لوحات ؛ إضافة 1 مل مستنبت لكل بئر ، وادخال ونفاذية الغشاء ميليبور في كل بئر. مكان جيد 6 لوحات في الحاضنة حتى 37 درجة على استعداد لنقل الشرائح.
- إعداد عدة (4-6) لوحات 60 ملم مع بلدية دبي ومكان على الجليد.
- قطع رأس بسرعة مع المقص وتراجع 70 ٪ في ETOH ، وفضح بسرعة الدماغ مع شق saggital من الجمجمة. إزالة بعناية الدماغ والمكان على الفور في بلدية دبي الباردة. فصلها إلى نصفين ووضع كل نصف الكرة الجانب الإنسي لأسفل على الإسفنج تغطية لمدة 2-3 ثواني.
- رفع بلطف ومكان في نصف الكرة على الساحة السينمائية Aclar ومكان المروحية على الأنسجة ؛ خفض الدماغ coronally في 350 ميكرون المقاطع. عند الانتهاء ، واتخاذ بلطف Alcar مربع مع نصف الكرة مقطوع ويغرق في بلدية دبي الباردة.
- باستخدام مجهر تشريح ، فصل المقاطع الحصين. عن الفئران ، ينبغي أن يكون هناك 5 أقسام تمتد إلى قرن آمون منقاري الذيلية ، والماوس ينبغي أن يكون هناك أقسام 3-4.
- تأخذ بها لوحات 6 بشكل جيد مع إدراج غشاء من 37 درجة نسيج الثقافة الحاضنة. نقل شرائح الحصين فردي على نفاذية الأغشية باستخدام ماصة نقل الزجاج. إذا كان الكثير من DM يتم تحريرها على الغشاء ، وإزالة الزائدة DM مع ماصة باستور. مكان five شرائح الحصين على كل الأغشية. تسمح على الاقل 3 آبار في الشرط ، أو شرائح 15.
- لوحات احتضان الثقافة في 37 درجة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ لترطيب 12-14 قبل أيام من بداية التجربة السمية. يمكن تغيير مستنبت مرتين في الأسبوع.
3. حمل وتحديد مقدار الضرر متعلق بالخلايا العصبية في قرن آمون الثقافة شريحة
- بعد 12-14 يوما في الثقافة ، وإضافة 5 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI) إلى وسائل الإعلام الثقافة. وسوف تسمح هذه الخطوة التصور النوعي والكمي لموت الخلايا القاعدية.
- في اليوم التالي ، كميا PIمضان في المنطقة دون الإقليمية CA1 (و / أو CA3 المسنن أو إذا رغبت في ذلك) من كل شريحة الحصين والحصول على قياسات يعني PI مضان يمثل موت الخلايا القاعدية (المشار إليها مع مرور الوقت = 0 ساعة ، أو تي 0). لاقتناء الصور والكمي ، ونحن نستخدم OpenLab البرمجيات (الارتجال ، المملكة المتحدة) ، ولكن من الحصول على الصور ويمكن استخدام برامج التحليل لتحديد كثافة مضان.
- مباشرة بعد الحصول على الصور من بي تي مضان 0 ، تحفز الخلايا العصبية التي اصابة طريقتك في الاختيار (ونحن قد استخدمت 10 ميكرومتر NMDA ، الأوكسجين الجلوكوز الحرمان ، أو LPS لمدة ساعة واحدة للحث على السمية العصبية 2،5). بعد التحفيز السامة ، مع استبدال المتوسطة المتوسطة الطازجة تحتوي على 5 ميكروغرام / مل PI والحفاظ على شرائح بين عشية وضحاها.
- في يوم 3 ، كميا يعني PI مضان للحالة تجريبية في 24H ، أو تي 24.
- بعد ذلك الحصول على الصور ، وتغير الحال والمتوسطة وإضافة 10 ميكرومتر NMDA وميكروغرام / 5 مل بي وشرائح احتضان الموت بين عشية وضحاها من أجل تحقيق أقصى قدر من الخلايا العصبية.
- في يوم 4 ، كميا يعني PI مضان وفاة الخلايا العصبية القصوى ، كما تم تعريفها ماكس تي. حساب موت الخلايا في المئة على النحو التالي : (T 24 -- T 0) / (T - T ماكس 0).
4. ممثل النتائج
الشكل 1 (أ) الإطار الزمني لتوليد الإصابة التجريبية الحصين واللاحقة ، والحصول على الصور. (ب) من شرائح الصور الممثل الحصين basally (T 0) ، 24 ساعة بعد التعرض 1 ساعة إلى 10 ميكرومتر NMDA (T 24) ، وبعد 24H ميكرومتر أو 10 للحصول على مزيد من NMDA الاصابة العصبية القصوى (T أقصى).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نقطتان هامتان لمتابعة لضمان تحقيق نتائج استنساخه ومتناسقة عند تكرار التجارب. أولا ، من المهم السماح للشرائح العمرية 12-14 الحصين لأيام قبل التجريب. مع شريحة العزلة ، وهناك استجابة كبيرة دبقية صغيرة ، وتبقى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لبعض الوقت ، مع العودة إلى دولة متشعبة الراحة التي تحدث من قبل 10 أيام في المختبر 3،6. ثانيا ، يعني كثافة PI الاستشعاع النسبي لعدد من الخلايا جرح 4. يقاس مضان متسلسلة في غضون ثلاث نقاط : (ط) في T 0 ، قبل NMDA أو التحفيز Ogd لقياس المستويات القاعدية للموت الخلايا العصبية عفوية ، (الثاني) في تي 24 أو 24 ساعة بعد التحفيز مع NMDA أو التحفيز OGD أو غيرها ، و (ج) في تي ماكس ، بعد المعالجة النهائية للشرائح مع العلاج 24 ساعة قاتلة بين عشية وضحاها مع 10 ميكرومتر النمداوية التي تنتج كمية قصوى للموت الخلايا العصبية. ويتم احتساب ثم موت الخلايا في المئة باستخدام الصيغة (T 24 -- T 0) / (T - T ماكس 0). فقد أمر بالغ الأهمية لتطبيع كل شريحة لنفسها باستخدام هذه الطريقة لأن حجم الحصين والتعبير مستقبلات الغلوتامات وتغير توزيع كبيرة باعتبارها واحدة من منقاري يذهب إلى الدماغ الذيلية ، والفشل في تطبيع كل شريحة على نفسها في البيانات نتيجة مصطنعة .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بتمويل من NINDS ، جمعية القلب الأميركية ، اتحاد أمريكا لبحوث الشيخوخة ، ومارس من الدايمات
References
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
