Summary
Organoptypic гиппокампа модель культуры срез
Abstract
Органотипической гиппокампа культуры срез в пробирке метод для изучения механизмов нейронных травмы, в которой базовая архитектура и состав гиппокампа является относительно сохранившихся 1. Органотипической системе культуры позволяет изучение нейронов, астроцитов и микроглии эффекты, но, как бывший подготовки естественных условиях, не рассматриваются последствия кровоток, или вербовки периферических воспалительных клеток. С этой целью, эта культура метод часто используется для изучения excitotoxic и гипоксических повреждений пирамидных нейронов гиппокампа, а также используется для изучения воспалительной реакции. Здесь мы опишем методы генерации гиппокампа культур ломтик от послеродовой мозга грызуна, управления токсичными стимулы, чтобы побудить нейронов травмы, и опробование и количественной гибель нейронов гиппокампа.
Protocol
1. Подготовка
Прежде чем начать, собрать необходимые хирургические инструменты, рассечение и питательных сред, а также на 7 дней старая крыса или мышь щенков. Протокол является одинаковым для мышей и крыс препаратов.
(Я) Материалы и оборудование
- Операционная ножницы (прямая длина 6 ", кот # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro рассекает ножницы, (длина 4 '", кошка # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Углеродистая сталь Дюмон Пинцет (кошка # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Измененный стекло "передачи" пипетки (низ пипетки Пастера удалены и сглаженные края)
- Aclar пластиковой пленки сократить до 2 "в х 2" на площадях (Honeywell, # 812071, Потсвилл, PA)
- Обложка губки 4, по 3 в (Кендалл, кошка # 3157, Мэнсфилд, штат Массачусетс)
- 30 мм мембраны Millicell вставками (0,4 мкм, Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain тканей вертолет с обоюдоострым лезвием бритвы (McILwain ткани измельчитель, Vibratome компании, Сент-Луис, Миссури)
- Инвертированный микроскоп с ПЗС-камера и программное обеспечение для анализа изображений
(II) Препарирование Средний (DM, 1 л при рН 7,3)
| Сбалансированный Хэнка Соль | 1 флакон (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 мм) | 350 мг |
| HEPES (10 мМ) | 2,83 г |
| Глюкоза (33,3 мм) | 6,0 г |
| Пенициллин / стрептомицин (100x) | 10 мл |
| BSA (0,3%) | 300 мг |
| MgSO 4-7H 2 O | 1,44 г |
(III) Культура средой (400 мл)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 мл |
| *** Баланс Хэнка Соль (Invitrogen 24020-117) | 100 мл |
| Лошадиной сыворотки (Invitrogen 26050-070) | 100 мл |
| HEPES буфера (1 М; Invitrogen 15630-080) | 5 мл |
| Пенициллин / стрептомицин (100x) | 4 мл |
| *** Добавить 12,8 г глюкозы в солевой баланс 500 мл Хэнка до принятия культуральной среде | |
(IV) Животные
На 7 дней старая крыса или мышь послеродовой щенков, как правило, один помет в эксперименте.
2. В День культуры
- Все рассечение инструментов и Aclar пленка должна быть промыты в 70% этаноле в течение 30 минут до начала. Поверхности вскрытия капота, лезвия, и ткани вертолета должны быть продезинфицированы с этанолом.
- Подготовка нескольких (3-4) 6 луночных культуры ткани, добавить 1 мл культуральной среды на лунку, и вставьте Millipore мембрана в каждую лунку. Место 6-луночных планшетах в 37 ° инкубаторе до готовности передать ломтиками.
- Подготовка нескольких (4-6) 60 мм пластин с СД и место на льду.
- Быстро обезглавить с ножницами и падение в 70% этанола, и быстро выставить мозга с сагиттальной разрез черепа. Осторожно снимите мозга и сразу же в холодную DM. Отдельные его на два полушария и место каждого полушария медиальной стороной вниз на крышку губкой в течение 2-3 секунд.
- Аккуратно поднимите и место полушарии на Aclar квадратных фильма и место на ткани вертолет; вырезать мозг коронки в 350 мкм разделов. Когда закончите, осторожно извлечь квадратный Alcar с секционным полушарии и погрузить в холодную DM.
- Использование рассекает микроскоп, выделить гиппокампа разделов. Для крыс, не должно быть 5 разделов охватывающих ростральнее хвостового гиппокампа, а также для мыши не должно быть 3-4 секций.
- Выньте 6-луночных с мембраной вставками из 37 ° культуре ткани инкубатора. Передача срезах гиппокампа индивидуально на мембраны использованием пипетки стеклянные передачи. Если слишком много немецких марок выпускается на мембране, удалить излишки ДМ с пипетки Пастера. Место пять срезах гиппокампа на каждой мембраны. Позвольте по крайней мере 3 скважин в состояние, или 15 ломтиков.
- Инкубируйте культуру пластин при 37 ° в 5% CO увлажненный инкубаторе в течение 12-14 дней до начала токсичности эксперимента. Культуральной среде может быть изменен дважды в неделю.
3. Стимулирование и Количественная гиппокампа нейронов травмы в фрагмент культуры
- После 12-14 дней в области культуры, добавьте 5 мкг / мл пропидий йодида (PI) в культуральной среде. Этот шаг позволит визуализации и количественной оценки базальной клеточной смерти.
- На следующий день, количественно PIфлуоресценции в субрегионе СА1 (и / или СА3 или зубчатые по желанию) каждого среза гиппокампа и получить среднее PI флуоресцентных измерений представляют базальной клеточной смерти (именуемые время = 0 часов, или T 0). Для получения изображения и количественное, мы используем OpenLab программное обеспечение (Импровизация, Великобритания), но и другие приобретения и анализа изображений программное обеспечение может быть использовано для количественной интенсивности флуоресценции.
- Сразу же после захвата изображений из T 0 PI флуоресценции, вызвать повреждение нейронов вашим методом выбора (мы воспользовались 10 мкМ NMDA-, кислород-глюкозы лишения или LPS в течение одного часа, чтобы вызвать нейронов токсичности 2,5). После токсичных стимул, заменить средний свежей средой, содержащей 5 мкг / мл PI и поддерживать ломтиками ночь.
- На 3-й день, количественно означает П. И. флуоресценции экспериментальных условиях на 24 часа, или Т-24.
- После этого захвата изображений, немедленно изменить средних и добавить 10 мкМ NMDA и 5 мкг / мл PI и инкубировать ломтиками ночь, чтобы добиться максимальной гибели нейронов.
- На 4-й день, количественно означает П. И. флуоресценции максимальная гибель нейронов, определяемая как Т макс. Рассчитать смерти процентов ячейки следующим образом: (Т 24 - Т 0) / (Т макс-T 0).
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. () Время линия для производства гиппокампа и последующей экспериментальной травмы и получения изображений. (B), представитель образы срезах гиппокампа у основания (T 0), 24 часов после 1 часа воздействия 10 мкМ NMDA (Т 24), а еще через 24 часа или 10 мкМ NMDA для получения максимального нейронов травмы (Т макс).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть два важных момента, чтобы следовать, чтобы обеспечить воспроизводимость и устойчивые результаты при репликации экспериментов. Во-первых, важно, чтобы гиппокампа возрасте ломтиками по 12-14 дней до начала эксперимента. С ломтиком изоляции, существует значительная микроглии ответ, и микроглии оставаться включенным в течение некоторого времени, с возвращением к отдыхает разветвленной состояние, наступающее на 10-й день в пробирке 3,6. Во-вторых, средняя П. И. интенсивность флуоресценции пропорциональна числу пораженных клеток 4. Последовательная флуоресценции измеряется в трех временных точках: (я) при T 0, до NMDA или OGD стимуляции для измерения базальной уровней спонтанной гибели нейронов, (II) при Т 24, или 24 часов после стимуляции NMDA или OGD или других стимулов, и (III) при Т макс, после окончательной обработки срезов с 24 часов ночи летальный лечения с 10 мкМ NMDA который производит максимальное количество гибели нейронов. Смерть процентов ячейки рассчитывается по формуле (Т 24 - Т 0) / (Т макс-T 0). Очень важно, чтобы нормализовать каждый ломтик на себя, используя этот метод, потому что размер гиппокампа и экспрессии рецепторов глутамата и распределение существенно измениться при переходе от ростральнее хвостового мозга, и неспособность нормализовать каждый кусочек, чтобы само по себе может привести к искусственной данных .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансируемая NINDS, Американской ассоциации сердца, Американской федерации исследований старения, март Dimes
References
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
