Summary
organoptypic海马脑片培养模型是一个
Abstract
器官型海马脑片文化是在体外培养方法，研究神经元损伤的机制，其中的基本结构和组成的海马 ，相对保留了1。器官型培养系统可以为研究神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞的影响，但作为体内的编制，不处理的血 液流动，或招聘周围炎性细胞的影响。为此，这种文化的方法是经常使用的研究海马锥体神经元的兴奋性毒性和缺氧性损伤，但也被用于检查的炎症反应。在此我们描述了从产后啮齿类动物的大脑产生的海马脑片培养，管理毒性刺激，诱导神经元损伤和化验，并量化海马神经元死亡的方法。
Protocol
1。制备
在开始之前，组装所需的手术器械，剥离和文化传媒，7日龄大鼠或小鼠幼仔。该协议是相同的小鼠和大鼠的准备。
（一）材料和设备
- 操作剪刀（直线长度6“，猫＃RS6818，Roboz，盖士堡，MD）
- 微解剖剪刀，（长度为4的“猫＃RS5910。Roboz，马里兰州盖瑟斯堡）
- 碳钢杜蒙镊子（猫＃RS - 5045.Roboz，盖士堡，MD）
- 改性玻璃“转让”的移液器（巴斯德吸管的底部和边缘平滑）
- ACLAR塑料薄膜切成2“× 2”（＃812071，霍尼韦尔，波茨维尔，PA在广场）
- 盖海绵3 4（肯德尔，猫＃3157，曼斯菲尔德，马）
- 30毫米Millicell小膜的插入（0.4微米; Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞）
- Mcllwain组织菜刀双刃刀片（McILwain组织菜刀，Vibratome公司，圣路易斯，密苏里州）
- 倒置显微镜与CCD相机和图像分析软件
（二）解剖中等（DM; 1升pH值7.3）
| 汉克的平衡盐 | 1瓶（95.2 g/1L）（Sigma公司：H2387） |
| NHCO 3（4.2毫米） | 350毫克 |
| HEPES（10毫米） | 2.83摹 |
| 葡萄糖（33.3毫米） | 6.0摹 |
| 青霉素/链霉素（100倍） | 10毫升 |
| BSA（0.3％） | 300毫克 |
| 硫酸镁4 7H 2 O | 1.44摹 |
（三）培养液（400毫升）
| MEM（Invitrogen公司11575-032） | 200毫升 |
| ***汉克的平衡盐（Invitrogen公司24020-117） | 100毫升 |
| 马血清（Invitrogen公司26050-070） | 100毫升 |
| HEPES缓冲液（1米; Invitrogen公司15630-080） | 5毫升 |
| 青霉素/链霉素（100倍） | 4毫升 |
| ***添加12.8克葡萄糖500毫升汉克的平衡盐，然后才作出培养基 | |
（四）动物
7日龄大鼠或小鼠产后幼仔，一般每一个实验的枯枝落叶。
2。在文化节
- 所有清扫工具和ACLAR电影必须在70％乙醇浸泡30分钟才开始。夹层罩，刀片，并组织菜刀表面必须用乙醇消毒。
- 准备几个（3-4）6孔组织培养板，每孔加入1 mL培养基，并插入一个Millipore公司在每口井的半透膜。广场6孔板，在37 °孵化器，直到准备转让片。
- 准备几个（4-6）60毫米板与DM，并置于冰上。
- 用剪刀快速斩首，浸在70％乙醇，并迅速暴露的大脑与颅骨矢状切口。小心地取出大脑和地点，立即在寒冷的DM。分成两个半球，每个半球的内侧，并放置在2-3秒的封面海绵。
- 轻轻抬起并放置到ACLAR电影广场和地方组织菜刀半球;冠削减350微米的部分大脑。完成后，轻轻切片半球和淹没在寒冷的DM Alcar平方米。
- 使用解剖显微镜，分离出海马的部分。老鼠，应该有5个部分，涵盖到尾鳍海马延髓，鼠标应该有3-4节。
- 从37 °组织培养孵化器的膜插入，取出6孔板。海马单独转移到使用玻璃移液管的渗透膜。如果太多DM是释放到膜，除去多余的巴斯德吸管DM。每个膜放在五个海马。允许每个条件至少有3口井，或15片。
- 孵育12-14天的培养板中毒性实验开始前，在5％二氧化碳培养箱，在37 °。培养基可以每周更换两次。
3。引导和量化切片培养的海马神经元损伤
- 经过12-14天中文化，添加5μg/ mL的碘化丙啶（PI）的文化传媒。这一步将让基底细胞死亡的可视化和量化。
- 翌日，量化的PI荧光每个海马脑片CA1区（和/或CA3区或齿状如果需要的话），并获得平均PI的荧光测量基底细胞死亡（称为时间= 0小时，或T 0）。图像采集和定量分析，我们使用的OpenLAB软件（即兴创作，英国），但其他图像采集和分析软件，可用于定量荧光强度。
- 紧随图像采集T +0 PI荧光后，由您所选择的方法（我们已经用了一小时10微米NMDA受体，氧糖剥夺，或LPS诱导神经元的毒性2,5）诱导神经元损伤。有毒的刺激后，更换新鲜培养基培养基中含有5微克/毫升PI和维护切片过夜。
- 在第3天，量化平均值PI荧光的实验条件下，24小时，或T 24 。
- 这个图像采集后，立即改变培养基，并添加10μmolNMDA和5微克/毫升的PI和孵化片过夜，以达到最大的神经元死亡。
- 第4天，量化平均PI荧光最大的神经元死亡，定义为T MAX。 ％的细胞死亡计算如下：24（T - T 0）/（T MAX - T 0） 。
4。代表性的成果
图1（A）代海马和随后的实验损伤和图像采集的时间线。 （二）代表图像基部海马（T 0），24小时暴露1小时后，10微米NMDA受体（T 24），并经过进一步的24小时或10微米的NMDA获得最大的神经元损伤 （T MAX ）。
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Discussion
要遵循确保重复性和一致的结果，复制实验时，有两个重要的点。首先，重要的是让海马年龄为12-14天前实验。片隔离，是一个重大的小胶质细胞的反应，和小胶质细胞在一段时间内保持激活状态，回到休息分枝国家发生的第10 天， 在体外3,6 ，。其次，意味着PI荧光强度成正比受伤的细胞数量4。顺序荧光是在三个时间点：（一）在T 0之前，NMDA或OGD刺激措施，自发的神经元死亡的基础水平，测量;（ii）在T 24或24小时后，NMDA或缺氧缺糖或其他刺激刺激，及（iii）在T MAX，切片后24小时10μMNMDA受体过夜致命的治疗产生的神经细胞死亡的最大金额的最终处理。然后计算公式（T 24 - T 0）/（T MAX - T 0）％的细胞死亡。正常化每个切片本身，使用这种方法的关键，因为这是海马和谷氨酸受体的表达和分布的变化，作为一个显着的大小从延髓脑尾鳍，并未能正常化每个切片本身可能会导致artifactual数据。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由美国心脏协会，美国衰老研究联合会，March of Dimes的NINDS，
References
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