Summary
organoptypic hippocampal टुकड़ा संस्कृति मॉडल है
Abstract
Organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृति में इन विट्रो के लिए neuronal चोट के तंत्र में जो बुनियादी वास्तुकला और हिप्पोकैम्पस की संरचना अपेक्षाकृत संरक्षित है 1 की जांच की विधि है. organotypic संस्कृति प्रणाली neuronal, astrocytic और microglial प्रभाव की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, लेकिन एक पूर्व vivo तैयारी के रूप में, रक्त के प्रवाह, या परिधीय भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती के प्रभाव का पता नहीं है. कि अंत करने के लिए, इस संस्कृति विधि अक्सर excitotoxic और hypoxic हिप्पोकैम्पस के पिरामिड न्यूरॉन्स को चोट की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन यह भी भड़काऊ प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस के साथ साथ हम प्रसवोत्तर कृंतक मस्तिष्क से पैदा hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों, विषाक्त उत्तेजनाओं प्रशासन neuronal चोट प्रेरित, और परख करने की क्रिया और hippocampal neuronal मौत बढ़ाता के लिए विधियों का वर्णन.
Protocol
1. तैयार
शुरू करने से पहले आवश्यक सर्जिकल उपकरणों, विच्छेदन और संस्कृति मीडिया, और 7 दिन पुराने चूहे या माउस पिल्ले को इकट्ठा. प्रोटोकॉल माउस और चूहा तैयारी के लिए ही है.
(I) माल और उपकरणों
- आपरेटिंग कैंची (सीधे लंबाई 6 ", बिल्ली RS6818 # Roboz, Gaithersburg, एमडी)
- माइक्रो कैंची, विदारक (4 लंबाई ', # बिल्ली RS5910 Roboz, Gaithersburg, एमडी.)
- कार्बन स्टील Dumont चिमटी (एमडी बिल्ली रुपये 5045.Roboz, गैथर्सबर्ग #)
- संशोधित कांच pipettes "अंतरण" (पाश्चर विंदुक के नीचे हटा दिया और किनारे smoothed)
- Aclar प्लास्टिक की फिल्म वर्गों में (हनीवेल, # 812071, Pottsville, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) "x 2" कट 2 करने के लिए
- कवर 3 से 4 में स्पंज (केंडल, बिल्ली 3157 # Mansfield, एमए)
- 30 मिमी Millicell झिल्ली आवेषण (0.4 सुक्ष्ममापी, Millipore, Bedford, एमए)
- Mcllwain दोधारी धार (McILwain ऊतक चोपर, Vibratome कंपनी, सेंट लुइस, MO) के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर
- सीसीडी कैमरे और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उल्टे खुर्दबीन
(Ii) मध्यम विच्छेदन (डीएम, पीएच 7.3 से कम 1 लीटर)
| हांक बैलेंस्ड नमक | शीशी 1 (95.2 g/1L) (सिग्मा: H2387) |
| NHCO 3 (4.2 मिमी) | 350 मिलीग्राम |
| HEPES (10 मिमी) | 2.83 छ |
| ग्लूकोज (33.3 मिमी) | 6.0 छ |
| पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x) | 10 एमएल |
| BSA (0.3%) | 300 मिलीग्राम |
| MgSO 4-7 2 हे | 1.44 छ |
(Iii) संस्कृति मध्यम (400 एमएल)
| सदस्य (Invitrogen 11,575-032) | 200 एमएल |
| *** हांक बैलेंस नमक (24,020-117 Invitrogen) | 100 एमएल |
| हार्स सीरम (26050-070 Invitrogen) | 100 एमएल |
| HEPES बफर (एम 1, 15630-080 Invitrogen) | 5 एमएल |
| पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x) | 4 एमएल |
| *** संस्कृति के माध्यम करने से पहले 500 एमएल हांक बैलेंस नमक 12.8 ग्राम ग्लूकोज जोड़ें | |
जानवरों (iv)
7 दिन पुराने चूहे या माउस प्रसवोत्तर पिल्ले, आम तौर पर प्रयोग के प्रति एक कूड़े.
2. संस्कृति दिवस पर
- सभी विच्छेदन उपकरण और Aclar फिल्म की शुरुआत से पहले 30 मिनट के लिए 70% ETOH में भिगो जाना चाहिए. विच्छेदन डाकू, ब्लेड, और ऊतक हेलिकॉप्टर की सतह इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए.
- कई (3-4) 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों की तैयारी, अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल मध्यम संस्कृति को जोड़ने के लिए, और प्रत्येक कुएं में Millipore पारगम्य झिल्ली सम्मिलित. प्लेस 37 में 6 अच्छी तरह प्लेटें ° स्लाइस हस्तांतरण के लिए तैयार जब तक इनक्यूबेटर.
- डीएम और बर्फ पर जगह के साथ कई (4-6) 60 मिमी प्लेटों की तैयारी.
- कैंची के साथ तेजी से सिर काटना और 70% ETOH में डुबकी, और जल्दी से खोपड़ी के saggital चीरा के साथ मस्तिष्क बेनकाब. ध्यान से मस्तिष्क और जगह तुरंत हटाने ठंड डीएम में. यह दोनों गोलार्द्धों में अलग और प्रत्येक गोलार्द्ध औसत दर्जे की ओर 2-3 सेकंड के लिए एक कवर स्पंज पर नीचे जगह है.
- Aclar फिल्म और हेलिकॉप्टर ऊतक पर वर्ग जगह पर धीरे से उठा और गोलार्द्ध जगह, coronally मस्तिष्क 350 सुक्ष्ममापी वर्गों में कटौती. जब समाप्त हो, धीरे से और ठंड डीएम में sectioned गोलार्द्ध डूब साथ Alcar वर्ग ले.
- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, hippocampal वर्गों को अलग. चूहे के लिए, वहाँ 5 दुम हिप्पोकैम्पस के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला फैले वर्गों, और माउस के लिए वहाँ 3-4 वर्गों होना चाहिए चाहिए.
- 6 37 ° ऊतक संस्कृति इन्क्यूबेटर से झिल्ली आवेषण के साथ अच्छी तरह से प्लेटें ले लो. पारगम्य झिल्ली पर कांच हस्तांतरण विंदुक का उपयोग hippocampal स्लाइस व्यक्तिगत स्थानांतरण. अगर बहुत ज्यादा डीएम झिल्ली पर जारी है, पाश्चर विंदुक के साथ डीएम अधिक हटा दें. प्रत्येक झिल्ली पर पांच hippocampal स्लाइस रखें. शर्त के अनुसार कम से कम 3 कुओं, या 15 स्लाइस की अनुमति दें.
- एक 5% सीओ humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर संस्कृति प्लेटों विषाक्तता प्रयोग शुरू होने से पहले 12-14 दिनों के लिए सेते हैं. संस्कृति के माध्यम एक सप्ताह में दो बार बदला जा सकता है.
3. उत्प्रेरण और बढ़ाता स्लाइस संस्कृति में hippocampal Neuronal चोट
- इस संस्कृति में 12-14 दिनों के बाद, संस्कृति मीडिया के लिए 5 μg / एमएल propidium आयोडाइड (PI) जोड़ें. यह कदम दृश्य और बेसल सेल मृत्यु की मात्रा का ठहराव की अनुमति देगा.
- अगले दिन, PI योंप्रत्येक hippocampal टुकड़ा के CA1 subregion (और / या CA3 या दांतेदार अगर वांछित) में प्रतिदीप्ति और प्राप्त पीआई प्रतिदीप्ति बेसल सेल मौत (समय के रूप में संदर्भित = 0 घंटे, या टी 0) का प्रतिनिधित्व माप मतलब . छवि अधिग्रहण और मात्रा का ठहराव के लिए, हम OpenLab सॉफ्टवेयर (कामचलाऊ व्यवस्था, ब्रिटेन), लेकिन अन्य छवि अधिग्रहण का उपयोग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति तीव्रता यों इस्तेमाल किया जा सकता है.
- टी 0 PI प्रतिदीप्ति की छवि अधिग्रहण के तुरंत बाद, अपनी पसंद के विधि (हम एक घंटे के लिए 10 NMDA, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव, सुक्ष्ममापी या LPS का इस्तेमाल किया है neuronal 2,5 विषाक्तता प्रेरित) द्वारा neuronal चोट प्रेरित . विषाक्त उत्तेजना के बाद, ताजा माध्यम के साथ मध्यम जगह 5 μg / एमएल PI युक्त और स्लाइस रातोंरात बनाए रखने.
- 3 दिन, यों मतलब PI 24 घंटों में प्रयोगात्मक हालत के प्रतिदीप्ति, या टी 24.
- इस छवि अधिग्रहण के बाद, तुरंत मध्यम बदलने के लिए और 10 सुक्ष्ममापी NMDA और 5 μg / एमएल पीआई और सेते के लिए अधिक से अधिक neuronal मौत को प्राप्त करने के लिए रातोंरात स्लाइस जोड़.
- 4 दिन में अधिक से अधिक neuronal मौत की PI प्रतिदीप्ति, अधिकतम टी के रूप में परिभाषित मतलब यों. प्रतिशत के रूप में कोशिका मृत्यु की गणना: (24 टी 0 टी) / (अधिकतम टी 0) .
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 (ए) hippocampal और बाद में प्रयोगात्मक चोट और छवि के अधिग्रहण की पीढ़ी के लिए समय रेखा. (बी) के प्रतिनिधि छवियाँ hippocampal basally (0 टी) स्लाइस, 1 घंटे 10 सुक्ष्ममापी NMDA (24 टी) के लिए जोखिम के बाद 24 घंटे, और एक और आगे 24 घंटों या 10 के लिए अधिकतम neuronal चोट (टी अधिकतम) प्राप्त NMDA सुक्ष्ममापी के बाद.
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Discussion
वहाँ दो महत्वपूर्ण बिंदुओं का पालन करने के लिए जब प्रयोगों नकल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लगातार परिणाम सुनिश्चित कर रहे हैं. सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है प्रयोग से पहले 12-14 दिनों के लिए hippocampal स्लाइस उम्र चलो. टुकड़ा अलगाव के साथ, वहाँ एक महत्वपूर्ण microglial प्रतिक्रिया है, और microglia कुछ समय के लिए सक्रिय रहते हैं एक आराम डालियां फैला हुआ 3,6 इन विट्रो में 10 दिन से होने वाली राज्य के लिए एक वापसी के साथ. दूसरे, इसका मतलब PI प्रतिदीप्ति तीव्रता घायल कोशिकाओं की संख्या 4 के लिए आनुपातिक है . अनुक्रमिक प्रतिदीप्ति तीन बार बिंदुओं पर मापा जाता है: टी 0 (i) के NMDA या OGD सहज neuronal मौत का बेसल स्तर को मापने की उत्तेजना से पहले, (ii) 24 टी, या 24 घंटे में NMDA या OGD या अन्य प्रोत्साहन के साथ उत्तेजना के बाद, और (iii) टी अधिकतम पर, एक 24 घंटे 10 सुक्ष्ममापी NMDA के साथ रात में घातक उपचार जो neuronal मौत का अधिक से अधिक मात्रा में उत्पादन के साथ एक स्लाइस की अंतिम इलाज के बाद. / (टी 0 अधिकतम-टी) - प्रतिशत कोशिका मृत्यु तो (टी 0 टी 24) सूत्र का उपयोग कर की गणना की जाती है. यह इस पद्धति का उपयोग करके खुद को प्रत्येक टुकड़ा सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि हिप्पोकैम्पस और एक के रूप में ग्लूटामेट रिसेप्टर अभिव्यक्ति और वितरण में परिवर्तन काफी के आकार व्याख्यान चबूतरे वाला दुम मस्तिष्क, और एक विफलता के लिए ही करने के लिए प्रत्येक टुकड़ा सामान्य से चला जाता है artifactual डेटा में परिणाम कर सकते हैं .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
NINDS द्वारा वित्त पोषित है, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, एजिंग रिसर्च के लिए अमेरिकन फेडरेशन ऑफ डाइम्स के मार्च
References
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