Summary
organoptypic hippocampal 슬라이스 문화 모델입니다
Abstract
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화의 기본 아키텍처와 해마의 구성이 상대적으로 1 보존되어있는 부상의 연결 메커니즘을 검토에서 체외 방식입니다. organotypic 문화 시스템은 astrocytic의 연결 및 microglial 효과 시험은 가능하지만, 전직 생체내 준비로 주변 염증 세포의 혈액 흐름, 또는 모집의 효과를 해결하지 않습니다. 이를 위해,이 문화 방법은 자주 해마의 피라미드 뉴런에 excitotoxic 및 hypoxic 부상을 확인하는 데 사용됩니다뿐만 아니라 염증 반응을 검사하는 데 사용되었습니다. 여기에 우리는 출생 후의 쥐 두뇌에서 hippocampal 슬라이스 문화를 생성의 연결 부상을 유발하는 유해 자극을 관리하고, 시금 및 hippocampal의 연결을 죽음을 quantifying위한 방법을 설명합니다.
Protocol
1. 준비
시작하기 전에, 필요한 수술 도구, 해부, 문화 미디어, 그리고 칠일 늙은 쥐 또는 마우스 새끼를 조립. 프로토콜은 마우스 및 쥐 준비에 대해 동일합니다.
(I) 재료 및 장비
- 운영 가위 (직선 길이 6 ", 고양이 # RS6818, Roboz, 게이 더 스버그, MD)
- 마이크로 가위, 해부 (길이 4 ', "고양이 # RS5910합니다. Roboz, 게이 더 스버그, MD)는
- 카본 스틸 더몬트 족집게 (CAT # RS - 5045.Roboz, 게이 더 스버그, MD)
- 수정 유리 "전송"pipettes (삭제 파스퇴르 피펫의 아래쪽과 가장자리 smoothed)
- Aclar 플라스틱 필름은 광장에서 (하니웰, # 812071, 포츠빌, PA) "X 2"2 컷
- 3에 의한 스폰지 4 (켄달, 고양이 # 3157, 맨스필드, MA) 커버
- 30mm Millicell 막 삽입 (0.4 μm의, Millipore, 베드 포드, MA)
- 양날 면도날 (맥일웨인 조직 헬기, Vibratome 회사, 세인트 루이스, MO)와 Mcllwain 조직 헬기
- CCD 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어와 함께 바뀌 현미경
(2) 해부 매체 (DM, 산도 7.3에서 1리터)
| 행크의 균형 소금 | 1 병에 (95.2 g/1L) (시그마 : H2387) |
| NHCO 3 (4.2 ㎜) | 350 MG |
| HEPES (10 ㎜) | 2.83 g |
| 포도당 (33.3 ㎜) | 6.0 g |
| 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x) | 10 ML |
| BSA (0.3 %) | 300 MG |
| MgSO 4 7H 2 O | 1.44 g |
(3) 문화 매체 (400 ML)
| 멤 (Invitrogen 11575-032) | 200 ML |
| *** 행크의 대차 소금 (Invitrogen 24020-117) | 100 ML |
| 호스 혈청 (Invitrogen 26050-070) | 100 ML |
| HEPES 버퍼 (1 M, Invitrogen 15630-080) | 5 ML |
| 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x) | 4 ML |
| *** 문화 매체를하기 전에 500 ML 행크의 밸런스 솔트 12.8 g의 포도당을 추가 | |
(4) 동물
칠일 늙은 쥐 또는 마우스 출생 후의 새끼, 실험마다 일반적으로 하나의 쓰레기.
2. 문화 당일
- 모든 해부 도구와 Aclar 영화는 시작하기 전에 30 분 70 % ETOH에 배어 있어야합니다. 절개 후드, 블레이드 및 조직 헬기의 표면은 에탄올로 소독해야합니다.
- (3-4) 여러 여섯 잘 조직 문화 번호판을 준비, 잘 당 1 ML 문화 매체를 추가하고 각 우물에 Millipore 투과 막를 삽입합니다. 37 장소는 6 - 잘 접시 ° 보육 조각을 전송할 준비까지.
- DM 얼음에 장소 몇 가지 (4-6) 60mm 플레이트를 준비합니다.
- 신속하게 가위로 목을 베다와 70% ETOH에서 수영을하고, 신속하게 두개골의 saggital 절개로 머리를 노출. 조심스럽게 추위 DM에 즉시 두뇌과 장소를 제거합니다. 두 반구로 그것을 분리 후 2-3 초 동안 표지 스폰지의 각 반구 내측 면을 아래로 놓습니다.
- 부드럽게 조직 헬기에 Aclar 영화 광장과 장소에 반구를 리프트와 장소, 350 μm의 섹션에 coronally 머리를 잘라. 완료되면, 부드럽게 감기 DM에서 sectioned 북반구와 잠수함과 Alcar 광장을.
- 해부 현미경을 사용하여 hippocampal 섹션을 구분합니다. 밀고 들어, 꼬리 해마에 주동이의 스패닝 5 섹션이 있어야하고, 마우스 되려면 3-4 섹션이 있어야합니다.
- 37 ° 조직 문화의 인큐베이터에서 막 삽입과 함께 6 자 번호판을 가져가라. 유리 전송 피펫을 사용하여 투과 세포막에 개별적으로 hippocampal 조각 전송합니다. 너무 DM은 멤브레인에 출시되면, 파스퇴르 피펫과 DM 초과를 제거합니다. 각 막 위에 다섯개의 hippocampal 조각 플레이스. 조건 당 적어도 3 웰스, 15 조각 허용합니다.
- 독성 실험을 시작하기 전에 12-14일에 대한 5 %의 CO humidified 인큐베이터에서 37 °에있는 문화 번호판을 품어. 문화 매체는 일주일에 두 번 변경할 수 있습니다.
3. 슬라이스 문화 Hippocampal의 연결 부상을 유도하고 Quantifying
- 문화 12~14일 후, 문화 미디어에 5 μg / ML의 propidium 요오드화물의 (PI)를 추가합니다. 이 단계는 시각화와 기저 세포 사망의 부량 수 있습니다.
- 그 다음날, PI를 계량각 hippocampal 슬라이스의 CA1의 subregion (및 / 또는 CA3 또는 이가있는 원하는 경우)의 형광 및 취득은 기저 세포 죽음 (시간라고도 = 0 시간, 또는 T 0) 대표 PI 형광 측정을 의미합니다. 이미지 수집 및 부량 위해, 우리는 OpenLab 소프트웨어 (순발력, 영국),하지만 다른 이미지 인수를 사용하여 분석 소프트웨어는 형광 강도를 계량하는 데 사용할 수 있습니다.
- 즉시 T 0 PI 형광의 이미지 취득 후, 선택의 방법 (우리의 연결 독성 2,5를 유도 한 시간 10 μm의 NMDA, 산소 - 포도당 박탈, 또는 LPS를 사용한)으로의 연결을 부상을 유발. 독성 자극 후, 5 μg / ML PI를 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하고 야간 조각 유지합니다.
- 일 3, PI 24 시간의 실험 조건의 형광 또는 T 24을 의미 계량.
- 이 이미지 수집 후, 즉시 매체를 변경 및 10 μm의 NMDA 및 5 μg / ML PI와 최대한의 연결을 죽음을 달성하기 위해 밤새 품어 슬라이스를 추가합니다.
- 일 4, T 최대로 정의 최대한의 연결을 죽음의 PI의 형광을 의미 계량. 다음과 같이 %의 세포 죽음을 계산 : (T 24 - T 0) / (T 최대 - T 0).
4. 대표 결과
그림 1. hippocampal와 후속 실험 부상 및 이미지 수집의 세대 (A) 타임 라인. (B) hippocampal basally 조각 (T 0), 10 μm의 NMDA (T 24)에 1 시간 노출 다음 24 시간과 최대한의 연결을 부상 (T 최대)을 구하는 NMDA 추가로 24 시간 또는 10 μm의 이후. 대표 이미지
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Discussion
실험을 복제하면 재현할하고 일관된 결과를 보장하기 위해 수행하는 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 실험 전에 12-14일에 대한 hippocampal 조각의 시대를하게하는 것이 중요합니다. 슬라이스 절연을 통해 상당한 microglial 응답이 있으며, microglia는 체외에서 3,6 일 10 가지를내는 발생 휴식 상태로 돌아와, 일정 기간 동안 활성 상태로 유지됩니다. 둘째, PI 형광 강도가 부상 세포의 수를 4로 비례 의미합니다. 선형 형광 세 시간 지점에서 측정한다 (I) T 0, NMDA 또는 자연의 연결을 죽음의 기저 수준을 측정하는 OGD 자극하기 전에, (2) T 24, 또는 24 시간 NMDA 또는 OGD 또는 다른 자극과 자극 후 그리고 (iii) T 맥스에서의 연결을 죽음의 최대한의 금액을 생산하는 10 μm의 NMDA와 함께 24 시간 야간 치명적인 치료와 조각의 최종 치료를 다음과. / (T 최대 - T 0) - %의 세포 사망은 다음 수식을 (T 0 T 24)를 사용하여 계산됩니다. 하나 크게 해마 및 글루 탐 산염 수용체의 표현 및 유통의 변화의 크기가 꼬리 뇌, 그리고 그 자체로 각각의 슬라이스를 정상화하기 위해 실패 주동이의 나갈 수 있기 때문에이 방법을 사용하여 자체 각각의 슬라이스를 정상화하기 위해 중요한 것은 artifactual 데이터가 발생할 수 있습니다 .
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NINDS, 미국 심장 협회, 노화 연구에 대한 미국 연방, 천 년 3 월에 의해 투자
References
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