Summary
O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia
Abstract
Cultura fatia organotípicas hipocampo é um método in vitro para analisar os mecanismos de lesão neuronal em que a arquitetura básica e composição do hipocampo é relativamente preservado 1. O sistema de cultura organotípicas permite o exame dos efeitos neuronal, astrocíticos e microglia, mas como uma preparação ex vivo, não aborda os efeitos do fluxo de sangue, ou recrutamento de células inflamatórias periféricas. Para o efeito, este método de cultura é freqüentemente utilizado para examinar lesão hipóxico excitotoxic e aos neurônios piramidais do hipocampo, mas também tem sido usado para examinar a resposta inflamatória. Aqui nós descrevemos os métodos para a geração de culturas fatia do hipocampo do cérebro do roedor pós-parto, administrar estímulos tóxicos para induzir a lesão neuronal, e assaying e quantificar a morte neuronal no hipocampo.
Protocol
1. Preparação
Antes de começar, montar os instrumentos necessários cirúrgica, dissecção e meios de cultura, e sete dias de ratos velhos ou filhotes de rato. O protocolo é o mesmo para mouse e preparações de ratos.
(I) Os materiais e equipamentos
- Tesoura operacional (comprimento em linha reta 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro dissecando tesoura, (comprimento 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Aço Carbono Dumont Pinças (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Vidro modificado "transferência" pipetas (parte inferior da pipeta Pasteur removido e suavizada pela borda)
- Aclar filme plástico cortadas a 2 "em x 2" em praças (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
- Cobrir esponjas 4 em por 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
- 30 milímetros Millicell insere membrana (0,4 mm; Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain helicóptero Tecido com dois gumes lâmina de barbear (McIlwain helicóptero tecido, empresa Vibratome, St. Louis, MO)
- Microscópio invertido com CCD da câmera e software de análise de imagem
(Ii) Média Dissecação (DM; 1 litro em pH 7,3)
| Salina balanceada de Hank | 1 frasco (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 mM) | 350 mg |
| HEPES (10 mM) | 2,83 g |
| Glicose (33,3 mM) | 6,0 g |
| Penicilina estreptomicina / (100x) | 10 mL |
| BSA (0,3%) | 300 mg |
| MgSO 4 7H 2 O | 1,44 g |
(Iii) meio de cultura (400 mL)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 mL |
| *** Sal Balanço de Hank (Invitrogen 24020-117) | 100 mL |
| Soro de cavalo (Invitrogen 26050-070) | 100 mL |
| HEPES buffer (1 M; Invitrogen 15630-080) | 5 mL |
| Penicilina estreptomicina / (100x) | 4 mL |
| *** Adicionar 12,8 g de glicose para Salt 500 mL de Hank Balance antes de fazer meio de cultura | |
(Iv) Animais
7 dias de idade ou filhotes de ratos rato pós-parto, geralmente uma ninhada por experimento.
2. No Dia da Cultura
- Todas as ferramentas de dissecação e Aclar filme deve ser embebido em álcool etílico 70% por 30 minutos antes de começar. A superfície do capô, a dissecção da lâmina, e helicóptero tecido deve ser desinfetado com etanol.
- Prepare vários (3-4) 6 placas de cultura de tecidos bem, adicione um meio de cultura mL por poço, e inserir uma membrana Millipore permeáveis em cada poço. Coloque 6-bem placas no 37 ° incubadora até que esteja pronto para transferir fatias.
- Prepare vários (4-6) 60 mm com placas DM e colocar no gelo.
- Rapidamente decapitar com uma tesoura e mergulhe em 70% o álcool etílico, e rapidamente expor o cérebro com uma incisão sagital do crânio. Remova cuidadosamente o cérebro e coloque imediatamente em DM frio. Separá-lo em dois hemisférios e coloque cada lado medial do hemisfério para baixo em uma esponja de cobertura para 2-3 segundos.
- Levantar delicadamente e coloque o hemisfério para a praça Aclar filme e coloque no helicóptero tecidos; corte coronal do cérebro em 350 seções mM. Quando terminar, retire com cuidado a praça Alcar com o hemisfério seccionados e submergir em DM frio.
- Usando um microscópio de dissecação, separar as seções do hipocampo. Para ratos, deve haver cinco seções que abrangem rostral hipocampo caudal, e para mouse deve haver seções 3-4.
- Tirar as placas de 6 poços com inserções de membrana do 37 ° de cultura de tecidos incubadora. Transferência de fatias do hipocampo individualmente para a membranas permeáveis usando a pipeta de transferência de vidro. Se demasiado DM é liberado para a membrana, remover o excesso de DM com uma pipeta Pasteur. Coloque cinco fatias do hipocampo em cada membrana. Permitir que pelo menos três poços por condição, ou 15 fatias.
- Incubar as placas de cultura a 37 ° em 5% CO incubadora umidificada por 12-14 dias antes do início do experimento de toxicidade. O meio de cultura podem ser mudadas duas vezes por semana.
3. Induzir e quantificação lesão neuronal do hipocampo em Cultura Slice
- Depois de 12-14 dias em cultura, adicionar 5 mg / mL de iodeto de propídio (PI) para o meio de cultura. Esta etapa irá permitir a visualização e quantificação de morte celular basal.
- No dia seguinte, quantificar PIfluorescência na sub-região CA1 (e / ou CA3 ou denteado se desejado) de cada fatia do hipocampo e obter média das medições de fluorescência PI representando a morte de células basais (referido como tempo = 0 horas, ou T 0). Para aquisição de imagem e quantificação, usamos OpenLab software (Improvisação, UK), mas a aquisição de imagens e outros softwares de análise podem ser usados para quantificar a intensidade de fluorescência.
- Imediatamente após a aquisição da imagem de T 0 PI fluorescência, induzir lesão neuronal pelo seu método de escolha (temos usado 10 mM NMDA, oxigênio glucose-privação, ou LPS para uma hora como indutores de toxicidade neuronal 2,5). Após o estímulo tóxicos, substituir média com meio fresco contendo 5 mg / mL PI e manter fatias durante a noite.
- No dia 3, significa quantificar PI fluorescência da condição experimental em 24h, ou T 24.
- Após esta aquisição de imagem, mudar imediatamente médio e adicionar 10 mM NMDA e 5 mg / mL PI e fatias de incubar durante a noite para atingir a morte neuronal máxima.
- No dia 4, significa quantificar PI fluorescência da morte neuronal máxima, definida como T max. Calcular a morte celular por cento da seguinte forma: (T 24 - T 0) / (T max-T 0).
4. Resultados representante
Figura 1. (A) da linha de tempo para a geração de hipocampo e subsequente lesão experimental e de aquisição de imagem. (B) Imagens representativas de fatias do hipocampo basally (T 0), 24 horas após uma exposição de uma hora a 10 mM NMDA (T 24), e após mais 24 horas ou 10 mM NMDA para obter lesão neuronal máxima (T max).
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Discussion
Existem dois pontos importantes a seguir para garantir resultados reprodutíveis e consistentes ao replicar as experiências. Primeiro, é importante deixar que a idade fatias do hipocampo por 12-14 dias antes da experimentação. Com isolamento fatia, há uma resposta significativa da microglia e microglia permanecerá ativado por algum tempo, com um retorno a um estado de repouso ramificada ocorrem de dia 10 in vitro 3,6. Em segundo lugar, com média de PI intensidade de fluorescência é proporcional ao número de células lesadas 4. Fluorescência seqüencial é medido em três momentos: (i) em T 0, antes de NMDA ou estimulação OGD para medir os níveis basais de morte neuronal espontânea; (ii) a T 24, ou 24 horas após a estimulação com NMDA ou estímulo OGD ou outros, e (iii) a T max, após um tratamento final de fatias com um tratamento de 24 horas durante a noite letais com 10 mM NMDA, que produz a quantidade máxima de morte neuronal. A morte celular por cento é então calculada usando a fórmula (T 24 - T 0) / (T max-T 0). É fundamental para normalizar cada fatia para si mesmo usando este método porque o tamanho do hipocampo ea expressão dos receptores de glutamato e mudar significativamente a distribuição como um vai de rostral ao cérebro caudal, e um fracasso para normalizar cada fatia para si pode resultar em dados artifactual .
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Financiado pelo NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes
References
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- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
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- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
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