어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Summary

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

Abstract

우리의 시각적 경험은 우리의 망막 photoreceptors의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수하여 세포막의 순환 - 염기 - 문이 채널의 폐쇄로 이어질 세포 사건의 폭포를 시작하면 시작됩니다. 멤브레인 전위의 결과로 변경 막대와 원뿔 시냅스 터미널 모두에서 신경 전달 물질 방출의 양을 감소에 차례로 연결됩니다. photoreceptor 막 잠재력에 가벼운 evoked 변화가 망막에 하류 활동으로 연결 방법을 측정하기 위해 과학자들은 수십 년 ^1,2에 대한 망막 슬라이스 준비에서 electrophysiological 음반을 만들었습니다. 과거에는 이러한 조각은 거름종이에 첨부되어 망막 조직에 면도날로 수동으로 절단되었습니다;과 함께 최근 몇 년 동안 깔끔히의 또 다른 방법은 망막 조직이 낮은 겔화 온도 한천 배지에 포함된 의하여 개발되었으며 냉각 솔루션에 슬라이스 마이크로톰 ^{3,4 진동.} 이 준비가 덜 표면 손상이 매우 강력한 빛을 evoked 반응과 함께 망막 조각을 생산하고 있습니다. 여기 우리는이 절차는 시각 색소를 표백되지 않도록 적외선에 따라 할 수있는 방법을 문서.

Protocol

1. 준비 전극

1. 1M NaCl의 모두를 수영하고 둘 사이 15V 운전 ~ 20 S.에 대한 1 Hz에서 사인 파를 사용하여 녹음과 참조 전극을 준비
2. micropipette 풀러 (서터 인스 트루먼 트의 P - 97을)를 사용하여 기록 전극을 만듭니다. 패치 - pipettes은 1.2 mm의 외부 직경 0.69 mm (셔터 인 스트 루먼트, 고양이 # B120 - 69 - 10)의 내경과 borosilicate 유리를 사용하십시오. 전극의 끝부분을 통해 일련의 저항을 측정합니다. MΩ ~ 12 세포 기관에 대한 MΩ ~ 5 ~ 직경 5 μm의 사용 세포 기관에 대한 ~ 직경 20 μm의 사용, 피펫 팁 직경을 선택 대상 세포의 크기에 따라.
3. 지상 / 참조 전극을 준비합니다. 1M NaCl에서, 주사기를 사용하면 (CAT # A7002 시그마) 3.5 % 아가르를 포함 1 ㎜ NaCl과 작은 섹션 폴리에틸렌 튜브 (Intramedic, PE205)를 입력합니다. 자세 / AgCl 기준 전극을 통해이 한천 다리를 놓습니다.

2. 준비 솔루션

1. 외부 목욕 솔루션, 에임스 '비카보네이트 (1 패)를 포함하는 미디어 : 에임 스의 1 병'중간 (시그마, 고양이 # A1420), NaHCO ₃ 1.9 g 페니실린 - 스트렙토 마이신 7 ML (시그마, 고양이 # P0781) 세균 방지 성장. ~ 280 mOsm에 osmolarity를​​ 조정합니다.
2. 솔루션을 깔끔히, 에임 '산도 버퍼 HEPES (1 패)를 포함하는 미디어 : 에임 스의 1 병'매체, NaCl의 0.887 g, 2.38 g HEPES의 페니실린 - 스트렙토 마이신 7 ML. 1M NaOH 및 / 또는 1M HCL을 사용하여 ~ 7.4으로 산도를 조정합니다. ~ 280 mOsm에 osmolarity를​​ 조정합니다.
3. 칼륨 - Aspartate (K - ASP) 피펫 내부 솔루션 (MM)을 : 125 K - Aspartate은 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG - HEDTA, 0.5 CaCl _2, 1 ATP - MG, 0.2 GTP - MG, 산도가 조정됩니다 와 ~ 7.3 NMG는 - 아, 그리고 osmolarity는 280 mOsm ~하도록 조정됩니다.
4. 망막을 포함한 낮은 겔화 온도 아가로 오스 (무게로 5 %), 아가르의 7.5 G (시그마, 고양이 # A7002)를 안정화에 대한 아가르 역전은 DH ₂ O. 150 ML에 녹아

3. 실험의 날

1. 해동 ~ K - ASP 내부 솔루션과 냉동고에서 원하는 형광단 1.5 ML. 경험적으로 결정되어야하는 적절한 농도에 형광단을 희석.
2. 물 목욕 (30-32 ° C)에 가벼운 꽉 스토리지 컨테이너와 다음 장소로 NaHCO ₃ (~ 200 ML)이있는 에임스 '미디어를 붓고 5 %의 CO ₂ / 95% O ₂ 가스를 평형
3. 얼음 HEPES, 장소를 포함하는 에임스 '미디어 ~ 110 ML과 병을 채우기 및 100 % O ₂ 평형.
4. 패러데이 케이지 위에 온수 저수지에서 NaHCO _3가 들어있는 나머지 에임스 '미디어를 삽입하고, 5 % CO ₂ / 95% O ₂ 기체와 평형. Parafilm는 솔루션 위의 공간에 가스를 트랩하는 데 사용할 수 있습니다.
5. HEPES와 ~ 115 ° C 아가로 오스를 녹기에서 열 솔루션 에임스 '미디어의 25 ML한다 (CAT # A0701 시그마) 0.75 g을 추가하여 낮은 겔화 온도 아가로 오스 (3 %)를 준비합니다. 물을 욕조에서 거품없이 명확하고, 저장하는 솔루션까지 저어 (~ 42 ° C).
6. K - ASP 내부 솔루션과 함께 녹음 피펫을 채울 및 팁 저항을 확인하십시오.

4. 실험 시작

1. 마우스를 안락사 신속하게 곡선 가위를 사용하여 눈을 제거합니다. 적외선 고글은 시각 색소의 표백 방지하기 위해 모든 절차를 사용해야합니다.
2. 포셉로 시선을 누른 상태 압연, 그리고 얇은 이중 단면 블레이드를 사용을 방지하기 위해 필터 종이에 눈을 장소, 각막에 슬릿합니다.
3. 곧 눈알이 구멍이므로, 에임스 '미디어 가득한 그릇에 사람들이 시선을 전송합니다.
4. 진입 점으로 각막에 슬릿을 사용하여, 작은 가위는 렌즈와 유리를 제거할 수있는 후 각막의 나머지 부분을 버려야하는 데 사용됩니다. 망막은 세안 컵에 부착된 상태, 32에서 어둠의 세안 컵을 저장 ° C를 5 % CO ₂ / 95% O ₂ equilibrated 에임스 '미디어에주의하십시오.

5. 깔끔히

1. eyecups 중 하나를 Hemisect 및 망막 안료 상피에서 망막을 떼어 놓다. 조직이 평평 거짓말 수 있도록 망막의 가장자리를 제거합니다.
2. 녹인 한천과 함께 35mm 페트리 접시를 채우기 위해 라텍스 전구와 작은 유리 파스퇴르 피펫을 사용하고 일관성을 테스트하는 한천을 통해 전체 포셉를 끕니다.
3. 당신은 한천이 응고 볼 시작할 수 있습니다 경우 :
   1. 한천의 상단에 망막을 전송합니다.
   2. 망막 주위의 여분의 솔루션을 흡수 Kimwipe의 뒤틀린 조각을 사용합니다.
   3. 장소 2-3 망막에 직접 아가르의 방울 신속하게 주위 벽을 형성하기 위해 망막을 통해 플라스틱 실린더를 놓으십시오. 한천 이내에 망막을 중심으로하면서 그런 다음 플라스틱 실린더의 측면 아래 추가 녹인 한천 드립.
   4. 페트리 접시 T를 전송냉각 얼음 물 목욕 O.
4. ~ 45 초 얼음 물을 욕조에서 조직을 제거하고 한천은 망막에서 멀리 측면에서 추진, 플라스틱 실린더 밖으로 블록 돌출하는 플런저를 사용하면.
5. 망막을 포함 한천의 작은 블록을 잘라 표본 디스크에있는 한천 역전에 대한 장소에 블록을 superglue하는 일방적인 면도날을 사용합니다.
6. 진동 마이크로톰 트레이에 표본 디스크를 전송하고 망막과 블록이 완전히 물 속에 잠긴 수 있도록 트레이에 얼음 차가운 에임스 HEPES 잔.
7. ~ 200 μm의의 두께 망막 조각은 최대 블레이드 진동 속도로 잘라 앞으로 블레이드 속도는 각각의 슬라이스에있는 망막을 통해 줄일 4-5초 걸립니다 이러한 설정할 수 있습니다.
8. 한 번에 하나씩 각 사용 가능한 슬라이스 하나를 제거하는 11 호 메스 블레이드를 사용하여
9. 망막을 포함한 좋은 조각은 기록 챔버에 배치하고 그들을 건너 나일론 스레드와 슬라이스 앵커와 함께 아래 가중치 있습니다. 나일론 스레드는 레코딩을위한 가리지 망막을 떠나, 망막을 둘러싼 한천을 누르십시오.
10. 똑바로 현미경의 무대에 녹화 실로 전송, 커튼을 닫고 적외선에 민감한 카메라에 슬라이스를 볼 수있는 적외선 광원을 설정합니다.

6. 녹음

1. 일단 좋은 망막 슬라이스는 (그대로 photoreceptors하고 적절한 절단 각도) 속도로 망막을 perfusing 시작 확인된 35 37 가열 가열 에임스 '매체와 이상 5 ML / 분 ° C와 5 % CO ₂ equilibrated / 95% O _2.
2. 일부 표면 손상이 깔끔히 처리로 인해 뚜렷한 수 있습니다. 세포의이 일반적으로 얇은 레이어가 부러 팁있는 피펫을 사용하여 제거하고, 부드럽게 죽은 세포의 시체를 멀리 빠는 수 있습니다. 이것은 일반적으로 살 세포를 아래에 공개합니다. 그의 위치에 대한 관심의 지층에 위치하고 건강한 세포 기관을 식별합니다.
3. KAsp 내부 솔루션 micropipette을 입력하고 피펫의 팁을 통해 긍정적인 (외부) 압력을 적용하고, 아래 micromanipulator를 사용하여 세포의 수준으로 기록 챔버에 피펫의 팁을 낮은합니다.
4. 그것은 세포막을 보조개 이러한 피펫 팁을 이동하고, 높은 저항 인감 수 있도록 부드러운 부정 (안으로) 압력을 적용합니다. 전체 셀 모드는 세포에 침입하기 위해 전극에 부정적인 압력을 적용하여 얻을 수 있습니다.
5. LED를 사용하여 망막 조직을 자극하면 다음 빛에 반응을 보여주고 있습니다.
6. 녹음이 피펫 내부 솔루션에 형광단에서 형광을 evoking에 의해 만들어진있는 세포 모습을 사진에 담아보세요.

7. 대표 결과

그림 1. 여기는 어두운 적응 증가 강도의 빛을 깜박하는 망막 신경 세포 것이 표시됩니다의 가능성에 불을 - evoked.

그림 2. 세포가 형광단, 루시퍼 노란색으로 가득했습니다 망막 슬라이스에서 형광 사진. Evoked 형광이 패치 레코딩이되었다하는 세포의 형태를 보여줍니다.

Discussion

척추 망막에서 슬라이스 녹음 수십 년 ^1,2에 대해되었습니다, 그리고 망막 회로는 입사 광을 인코딩하는 방법에 깊은 이해를 제공하는 매우 성공적으로되었습니다. 진동 마이크로톰와 절삭 오히려 직접보다 면도날로의 장점은 망막 조각이 표면에 덜 손상을 초래한다는 것입니다. 흡입 피펫으로 그것은 단지 세포 유형의 대부분 ^5,6을 확인했습니다 망막 회로, 그들의 연결을 유지 표면 아래 손상 및 대상 건강한 세포를 제거하는 간단하고, 표시되는 강력한 반응을 빛을 수 있습니다. 따라서 어두운 적응 망막 조각의 패치 클램프 녹음 신경 계산에서 확인 휴대 클래스에 의해 재생 역할을 결정하기 위해 조사를 허용할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781