暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Summary

ここでは、電気生理学的記録のためのマウスの網膜の暗順応のスライスを生成するための手順を説明します。

Abstract

私たちの視覚経験は、私たちの網膜光受容体の視物質が光エネルギーの光子を吸収し、細胞膜中の環状ヌクレオチド依存性チャネルの閉鎖につながる細胞内イベントのカスケードを開始するときに開始されます。膜電位で生じる変化は、桿体と錐体シナプス端末の両方からの神経伝達物質の放出量の削減に順番につながる。光受容体の膜電位の光誘発変化が網膜の下流の活動につながるかを測定するために、科学者は数十年の^1,2のための網膜スライス標本からの電気生理学的記録を行っている。過去にこれらのスライスは、ろ紙に接続されて網膜組織にカミソリの刃を使って手動でカットされている。近年でスライスの別の方法は、網膜組織が低ゲル化温度の寒天に埋め込まれているそれによって開発され、クールな解決策にスライスミクロトーム^3,4を振動させる。この準備は少なく、表面の損傷と非常に堅牢な光誘発反応と網膜のスライスを生成します。ここでは、この手順を視覚的に色素を漂白避けるために、赤外光の下で実行する方法を文書化します。

Protocol

1。準備電極

1. 1M NaClに両方それらを浸漬し、それらの間に15Vの駆動〜20秒に1 Hzの正弦波を用いて、記録と参照電極を準備する
2. マイクロピペットプラー（サターインスツルメンツP - 97）を使用して、記録電極を行います。パッチピペットは、1.2mmの外径と0.69ミリメートル（サッタインスツルメンツ、カタログ番号B120 - 69 - 10）の内径とホウケイ酸ガラスを使用してください。電極の先端を通して直列抵抗を測定する。 MΩ〜12は、細胞体のためMΩ〜5〜直径の使用中の5μmの細胞体のための〜直径の使用中の20μm以下、ピペットの先端径を選択する標的細胞の大きさに基づいて。
3. 地上/参照電極を準備する。 1M NaCl中で、注射器を使用すると、（カタログ番号A7002、シグマ）3.5％寒天を含む1 mMのNaClを含む小さなセクションのポリエチレンチューブ（Intramedic、PE205）を記入してください。 Ag / AgCl参照電極上にこの寒天橋を置きます。

2。準備ソリューション

1. 外部浴溶液、エイムズ"メディアを含む重炭酸塩（1 L）：エイムズの1本"培地（Sigma、カタログ番号A1420）、細菌を防ぐため、 _炭酸水素ナトリウム1.9gの、ペニシリン-ストレプトマイシン（カタログ番号P0781、シグマ）の7 mLの成長。 〜280 mOsmに浸透圧を調整します。
2. ソリューションをスライス、エイムズ"pH緩衝HEPES（1 L）を含有する培地：エイムズの1本"中、NaClの0.887グラム、HEPESの2.38グラム、ペニシリン - ストレプトマイシンの7 mLの。 1M NaOHおよび/または1M HClを用いて〜7.4にpHを調整する。 〜280 mOsmに浸透圧を調整します。
3. カリウム-アスパラギン酸（K - ASP）ピペット内部の溶液（mMで）：125 K -アスパラギン酸、10のKCl、10 HEPES、5 NMG - HEDTA、0.5のCaCl _2、1 ATPとMg、0.2 GTPとMg、pHをするために調整されるNMG - OH、及び浸透圧を持つ〜7.3〜280 mOsmに調整されます。
4. のdH ₂ Oを150mlに溶けて、網膜を含む低ゲル化温度アガロース（5重量％）、寒天7.5gの（カタログ番号A7002、シグマ）を安定させるための寒天バックストップ

3。実験の日

1. 雪解け〜K - Aspを内部溶液と冷凍庫からお好みの蛍光体の1.5mLの。経験的に決定されるべき適切な濃度に蛍光体を希釈する。
2. 遮光貯蔵容器として水浴（30-32 ° C）に所定の場所にNaHCO _3を （〜200mL）を含むエイムズ"メディアを注ぎ、5％CO ₂ / 95％O ₂ガスとの平衡化
3. 、HEPESを含むエイムズ"メディアの〜110 mLのボトルをいっぱいに氷の上に位置し、100％O ₂で平衡。
4. ファラデーケージの上に温水タンクにNaHCO _3を含む残りのエイムズ"メディアを置き、そして5％CO ₂ / 95％O ₂ガスを用いて平衡化します。パラフィルムは、溶液の上部空間にガスをトラップするために使用されることがあります。
5. HEPESと〜115℃でアガロースを融解することで熱溶液とエイムズ"メディアを25mLに、（カタログ番号A0701、シグマ）0.75gを添加することにより、低ゲル化温度アガロース（3％）の準備。気泡のない透明な溶液、及び水浴（〜42 ° C）にストアするまでかき混ぜる。
6. K - Aspを内部溶液を記録ピペットを記入し、チップ抵抗を確認してください。

4。実験を始める

1. マウスを安楽死させるとすぐに湾曲したハサミを使って目を削除します。赤外線ゴーグルは、視覚的な色素の漂白を防ぐために、すべての手順を使用する必要があります。
2. 鉗子で目を押さえながら転がり、そして薄い両面刃を使用してからそれらを防ぐために、フィルター紙の上に目を置く、角膜にスリットを作る。
3. すぐに眼球が破裂されると、エイムズ"メディアで満たされた皿に、彼らの目を移す。
4. エントリポイントとして角膜にスリットを使用して、小さなはさみはレンズと硝子体を除去することができる後に、角膜の残りの部分を切り取るために使用されます。網膜は、アイカップにアタッチしたままになって、そして32で闇の中にアイカップを保管° Cを5％CO ₂ / 95％O ₂で平衡化したエイムズ"メディアにいることに注意してください。

5。スライス

1. アイカップのいずれかを二等分すると網膜色素上皮から網膜を解離する。組織が平らにできるように、網膜の辺を削除します。
2. 溶かした寒天と35ミリメートルのペトリ皿を埋めるためにラテックス電球と小さなガラスパスツールピペットを使用して、その一貫性をテストするために寒天を介して全体に鉗子をドラッグします。
3. あなたは、寒天が固化し始めることができる場合：
   1. 寒天の上に網膜を転送します。
   2. 網膜の周りに余分な溶液を吸収するキムワイプのねじれた部分を使用してください。
   3. 直接網膜上に場所寒天の2〜3滴を、迅速にその周りに壁を形成するために、網膜上のプラスチック製のシリンダーを配置。寒天内で網膜を中心にしながらプラスチックの円筒の側面の下の追加溶かした寒天を滴らせる。
   4. ペトリ皿tを転送する冷却するために氷水浴をO。
4. 〜45秒後、氷水浴から組織を除去し、プラスチック製のシリンダーの外ブロック寒天を押し出すプランジャーを使用して、網膜から最も遠い側から押す。
5. 網膜を含む寒天の小さなブロックを切り取って試料ディスク上に寒天のバックスに対して所定の位置にブロックを瞬間接着剤に片側かみそりの刃を使用してください。
6. 振動ミクロトームのトレイに試料ディスクを転送し、網膜を持つブロックが完全に水没することができるようにトレイに氷冷エイムズのHEPESを注ぐ。
7. 〜200μmの厚さと網膜のスライスは、最大ブレード振動速度で切断し、前進翼の速度は、各スライスで網膜を切って4〜5秒かかるように設定することができます。
8. 一度にそれぞれの使用可能なスライスのいずれかを削除する11号手術用メスの刃を使用してください
9. 網膜を含む適切なスライスが録音室に配置されますと、それらを横断するナイロン糸とスライスのアンカーでダウン重み付けされています。ナイロン糸は、録画の遮るもののない網膜を残して、網膜の周囲の寒天を押したままにします。
10. 正立顕微鏡のステージに録音室を転送する、カーテンを閉じて、赤外カメラでスライスを表示するには、赤外光源をオンにします。

6。録画

1. 一度良い網膜スライスは、（そのまま光受容体および適切な切削角を持つ）℃、5％で平衡化したCO ₂ 35 37に加熱される加熱されたエイムズ"メディアと5 mL / minのより高い率で網膜を灌流開始識別されます。 / 95％O _2。
2. いくつかの表面の損傷は、スライスのプロセスに起因する明らかな可能性があります。細胞のこの通常薄い層が壊れた先端にピペットを用いて除去し、そして穏やかに死んだ細胞体を離れて吸うことができます。これは一般的に生きている細胞を下に明らかになります。その位置関心の地層中に配置されている健康な細胞体を識別する。
3. KAsp内部溶液をマイクロピペットを記入し、ピペットの先端部を介して正（外側）の圧力を適用し、ダウンマイクロマニピュレーターを用いて、セルのレベルに録音室にピペットの先端を下げると。
4. それは細胞膜をディンプルようにピペットの先端を移動し、高抵抗のシールを作るために穏やかな負の（内側）の圧力を適用する。全細胞モードは細胞に侵入する電極に負圧を適用することによって達成することができます。
5. LEDを使用して網膜組織を刺激するし、光に応答を呼び起こすことができる。
6. 録音がピペット内部溶液中でフルオロフォアからの蛍光を想起させることによって作らされたセルを撮影。

7。代表的な結果

図1。ここでは、増加する強さの光の点滅に暗順応網膜ニューロンの光誘発電位が示されている。

図2。細胞は蛍光体、ルシファーイエローで満たされている網膜のスライスからの蛍光画像。誘発蛍光は、パッチのレコーディングが行われたから、細胞の形態を示しています。

Discussion

脊椎動物の網膜からのスライスの記録は、何十年も^1,2のために作られており、網膜回路が入射光をエンコードする方法のより深い理解を提供することにかなり成功している。かみそりの刃に直接振動ミクロトームで切断するのではなくの利点は、網膜のスライスが表面に少ないダメージを被ることがあります。吸引ピペットで、このダメージとターゲットだけ細胞のタイプのほとんどは^、5,6を識別し、それが光に堅牢な応答が表示されている網膜回路、でその接続を保持する表面の下の健康な細胞を除去するのは簡単です。したがって、暗順応網膜のスライスからのパッチクランプ記録は、調査員が神経計算で識別されるセルのクラスが果たす役割を決定できるようにすることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781