从一个暗适应切片制备小鼠视网膜神经细胞的膜片钳录音

Summary

在这里，我们描述了产生暗适应对小鼠视网膜电生理记录片的过程。

Abstract

启动时，在我们的视网膜感光细胞的视色素吸收光能量的光子，并启动一个封闭的环核苷酸门控通道在细胞膜，导致细胞内事件级联我们的视觉体验。膜电位的变化，导致神经递质的释放杆和锥突触终端数量的减少反过来。为了测量在感光膜电位光诱发的变化如何导致在视网膜上下游活动，科学家们从几^十年 1,2的视网膜切片准备的电生理记录。在过去，这些片被切断与视网膜组织，是连接到滤纸上的刀片手动，近年来已开发的另一种方法的切片，使视网膜组织中嵌入胶凝温度琼脂低和在阴凉的解决方案与切片振动切片^3,4。这种准备产生表面损伤少和非常强大的光诱发反应的视网膜切片。在这里，我们的文件，此过程中如何可以根据红外光，以避免视觉色素漂白。

Protocol

1。准备电极

1. 准备记录和参比电极浸泡在1M氯化钠，并推动它们之间的15V〜20秒1 Hz的正弦波
2. 请使用微量拉马（萨特仪器的P - 97）的记录电极。对于补丁移液器使用硼硅玻璃1.2毫米外径和内径0.69毫米（萨特仪器，CAT＃B120 - 69 - 10）的一个。通过电极尖端测量串联电阻。根据靶细胞的大小选择枪头直径;胞体〜使用直径在20微米〜5MΩ胞体〜在使用直径5微米〜12MΩ。
3. 准备地面/参比电极。用注射器填充1毫米氯化钠一小部分聚乙烯管（Intramedic PE205），其中包括3.5％的琼脂（Sigma公司; CAT＃A7002）在1M氯化钠。这超过了Ag / AgCl参比电极放置琼脂桥。

2。准备解决方案

1. 外部液，含有碳酸氢盐（1升）的艾姆斯媒体：1艾姆斯瓶“中等（Sigma公司; CAT＃A1420），1.9克_碳酸氢钠 3，7毫升的青霉素，链霉素（Sigma公司; CAT＃P0781），以防止细菌增长。调整渗透压〜280 mOsm。
2. 切片的解决方案，艾姆斯介质pH缓冲HEPES（1升）：1瓶Ames的培养基，0.887克的氯化钠，2.38克HEPES，7毫升的青霉素，链霉素。使用1M NaOH和/或1M盐酸调节pH值至7.4〜。调整渗透压〜280 mOsm。
3. 10 -天门冬氨酸钾（K - ASP）移液器内部的解决方案（毫米）：125的K -天门冬氨酸，氯化钾，10 HEPES，5 _{NMG - HEDTA}氯化钙2，1的ATP GTP镁毫克，0.2，0.5， pH值调整到〜7.3 NMG - OH和渗透压调整〜280 mOsm。
4. 稳定低胶凝温度琼脂糖包含视网膜（按重量的5％），琼脂7.5克（Sigma公司;猫＃A7002）逆止琼脂融化在150毫升_{DH 2} O

3。实验日

1. 解冻〜1.5毫升的K - ASP内部解决方案，您所选择的荧光团从冰箱。稀释至适当浓度，应凭经验确定的荧光。
2. 倒艾姆斯含有碳酸氢钠_3（约200毫升）的避光贮存容器，然后将水浴（30-32℃）的地方“媒体和平衡5％的_CO 2 / _95％O 2气体
3. 填充〜110毫升含有HEPES，放置在冰艾姆斯媒体的瓶子和100％O ₂的平衡。
4. 广场余下的Ames的媒体，包含一个法拉第笼顶部的加热_水库碳酸氢钠3，和_5％的CO _{2 /} 95％O 2气体的平衡。封口膜可用于捕获的气体在上述解决方案的空间。
5. 准备加入0.75克的低胶凝温度琼脂糖（3％）; HEPES和热量的解决方案〜115 ° C至融化琼脂糖（Sigma公司猫＃A0701）25毫升艾姆斯媒体。搅拌，直至溶液清晰​​，无气泡，并在存储水浴（42℃）。
6. 填充的K - ASP的内部解决方案的一个记录的吸液管和检查尖阻力。

4。开始实验

1. 安乐死鼠标，迅速取出眼用弯剪刀。应被用于所有的程序，以防止视觉色素漂白红外护目镜。
2. 放在滤纸上，以防止他们从滚动，使用超薄双面刀片眼睛，使角膜缝钳。
3. 尽快刺破眼球，转移到与Ames的媒体充满了菜，他们的眼睛。
4. 使用角膜为切入点的缝隙，小剪刀剪去其余部分角膜，晶状体和玻璃体后可以去掉。小心视网膜仍然附着眼罩，并存储在黑暗眼罩在32 °艾姆斯“媒体与5％的CO ₂ / 95％O _2的平衡彗星。

5。切片

1. Hemisect一个眼罩，和视网膜脱离的视网膜色素上皮。取出的视网膜边缘，让组织平躺。
2. 使用乳胶泡一个小玻璃巴斯德吸管，以填补35毫米的Petri盘与融化的琼脂，并通过琼脂拖过的镊子，以检验其一致性。
3. 当你可以开始看到琼脂凝固：
   1. 视网膜传送至琼脂顶部。
   2. 使用一个Kimwipe扭曲，以吸收周围的视网膜多余的溶液。
   3. 广场2-3滴琼脂直接在视网膜上，并迅速放在一个塑料圆筒视网膜形成了它周围的墙壁。然后往下淌的塑料圆筒两侧额外融化的琼脂，而围绕琼脂内的视网膜。
   4. 转让的Petri菜吨Ø冰水浴冷却。
4. 〜45秒后从冰水浴中删除的组织和使用柱塞挤出琼脂块的塑料圆筒，从视网膜最远的一侧推。
5. 使用一个双面刀片切出一个小数据块包含视网膜琼脂和到位，对试样的光盘上的琼脂逆止强力胶块。
6. 标本光盘传输振动切片机托盘，倒入托盘允许与视网膜块完全淹没冰冷艾姆斯HEPES。
7. 视网膜片〜200微米的厚度，可以切割​​最大的刀片振动速度和向前的刀片速度设定等，它需要4至5秒，穿过视网膜上的每个切片。
8. 使用11号手术刀刀片一次删除每个可用的片之一
9. 含有视网膜的好片放入录制商会和加权对着干的尼龙线片锚。尼龙线按住琼脂周围的视网膜，使视网膜录音通畅。
10. 录音室转移到直立显微镜阶段，关闭窗帘，打开红外光源，红外感光摄像头，以查看片。

6。记录

1. 一旦一个良好的视网膜片（完整的感光细胞和适当的切削角度）确定开始灌注视网膜率大于5 mL / min的加热艾姆斯媒体被加热到35 37 ° C和_5％的CO 2平衡/ 95％O _2。
2. 一些表面的损害可能是由于切割过程明显。这通常是一层薄薄的细胞，可以使用一个破碎的一角吸管去除，并轻轻的吸吮了死细胞机构。这通常会发现下面的活细胞。确定一个健康的细胞体，其位置位于利益阶层。
3. 填写与KAsp内部解决方案的一个微量，并申请通过吸管尖正面（向外）的压力，降低进录音室吸管尖，使用显微细胞水平。
4. 移动枪头，这样它的酒窝细胞膜，并适用于温柔负（向内）的压力，使高抗密封。全细胞模式，可以实现应用负压电极进入细胞打破。
5. 刺激视网膜组织使用的LED就可以唤起反应轻。
6. 照片，录音唤起从吸管内部解决的荧光团的荧光的细胞。

7。代表性的成果

图1在这里，一个暗适应视网膜神经元增加强度的光闪烁光诱发的潜力。

图2：从视网膜切片的细胞已被填充的荧光，路西法黄河荧光图像。诱发荧光显示的细胞补丁录音形态。

Discussion

片脊椎动物视网膜的录音已经几^十年 1,2，已经相当成功，提供了一个如何视网膜电路编码入射光更深入的了解。振动切片，而不是直接用刀片切割的优点是视网膜切片，在表面产生较少的损害。具有吸吸管，这是容易消除这种损害健康细胞和目标，只是在表面之下，他们的连接保留在视网膜的电路，其中大部分的细胞^类型已经确定了5,6，轻，显示强劲的反应。因此，从暗适应视网膜切片膜片钳录音可以允许的调查，以确定确定细胞类神经计算所扮演的角色。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781