Summary
Une nouvelle méthode polyvalente pour l'observation de la microcirculation est présenté. Il est considéré comme convenable pour observation à long terme, et pour la combinaison avec pharmacophysiological ou moléculaire interventions biologiques.
Abstract
CONTEXTE: Les facteurs réglementaires et de la physiologie de la microcirculation détaillée des vivo sont restés pas totalement clarifiée après de nombreuses différentes modalités d'imagerie avait inventé. Alors que de nombreux paramètres macroscopiques de l'écoulement sanguin reflète la vitesse d'écoulement, des changements dans la vitesse d'écoulement du sang et de globules rouges (GR) de flux ne tient pas de relation linéaire dans les observations microscopiques. Il ya des rapports de divergence entre RBC et RBC vitesse de flux, de flux et le volume de RBC flux de plasma, et de l'hétérogénéité spatiale et temporelle de la régulation du débit dans les tissus périphériques dans les observations microscopiques, une base scientifique pour l'exigence d'études plus détaillées en matière de réglementation microcirculatoire aide microscopie intravitale.
Méthodes: Nous avons modifié la méthode de Jeff Lichtman de l'observation microscopique in vivo dans des muscles sterno-souris. Les souris sont anesthésiées, aéré, et injecté avec PKH26L-fluorescence globules rouges marqués pour l'observation microscopique.
RESULTAT ET CONCLUSIONS: globules rouges marqués par fluorescence sont détectées et distinguées ainsi par un microscope à champ large. La contraction musculaire provoquée par augmentation de la stimulation électrique induite dans le flux de RBC. Quantification des autres paramètres, y compris la vitesse de RBC et de la densité capillaire étaient réalisables. Souris bien toléré la chirurgie, injection de globules rouges colorés, l'observation microscopique, et la stimulation électrique. Aucun muscle ou endommager les vaisseaux sanguins a été observée, suggérant que notre méthode est relativement moins invasive et adaptée aux observations à long terme.
Protocol
Coloration de la membrane de RBC
- Cellules rouges du sang de souris ont été corrigées à partir de la souche de souris même avec héparinisation.
- Souris RBC ont été colorés avec PKH26 colorant (551/567 nm; rouge kit fluorescentes linker cellulaire, Sigma, USA).
- RBC ont été lavés dans du PBS et incubées avec une solution de 2 pm PKH26 colorant pendant 5 minutes à température ambiante. La réaction a été stoppée par l'addition de plasma (inactivé par la chaleur pendant 1 heure à 65 ° C à l'avance) et incubées pendant 1 minute.
- Les vitraux de RBC ont été lavées 5 fois avec du PBS.
Préparation de la souris
- Trois à six mois masculine C57BL/10 souris ont été utilisées dans cette étude. Nous souris anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (50mg/kgBW).
- Souris ont ensuite été intubé avec un tube de polyéthylène 20-Gage, ventilé mécaniquement et chauffé à 37 ° C sur un chauffe-feuille de Kapton relié à un capteur à thermocouple et contrôleur de système rétroaction de la température.
- La face ventrale du cou a été rasé. Les muscles sterno-droite et de gauche ont été exposés. Les muscles ont été soutenus par un support en acier inoxydable et perfusées avec stériles Krebs Ringer solution.
Injection
- Globules rouges colorées ont été réchauffée à 37 ° C, dilué avec de Krebs Ringer. 50ul de vitraux RBC (hématocrite de 12%) a été injecté dans la souris dans la veine du pénis.
Dans l'observation microscopique in vivo des muscles squelettiques
Nous avons suivi la méthode de Jeff W. Lichtman 's avec modification 1:
- Les animaux ont été placés sur un coussin chauffant au-dessus d'un stade de fer fait à la main d'un Nikon Eclipse-800 microscope. Eau-trempage des lentilles d'objectif ont été utilisés pour vivre épi-fluorescence observation. Nous avons observé l'intérieur teinté PKH26 RBC écoulement du vasculaires sous la lumière fluorescente d'une lampe au mercure. Nous avons identifié les artérioles primaire, secondaire, artérioles, capillaires et les veines de leurs directions d'écoulement des globules rouges et les architectures.
- Une caméra SIT intensifié (Hamamatsu Photonics, C2400, Japon) et la vidéo-frame grabber ont été installés pour capter le signal de faible intensité à la cadence vidéo en temps réel (30 images par seconde). Les images ont été enregistrées sur un DVD sous forme de fichiers vidéo.
Stimulation musculaire
- Une impulsion électrique est généré en utilisant un stimulateur nerveux périphérique (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, la Nouvelle-Zélande), et livrés à la surface musculaire via une sonde revêtement inoxydable. Une extrémité de la sonde minus a été placé sur la partie proximale du muscle et une fin plus a été placé sur la partie distale du muscle. Stimulations tétanos ont été donnés au taux de 50Hz pendant 5 secondes. Les stimuli électriques ne causent pas de dommages fibres musculaires direct sur le voisinage de la surface de contact.
RBC flux de l'analyse
- Enregistré images vidéo de DVD ont été transférés les fichiers vidéo via un logiciel d'image Savant frame grabber (Video Savant, USA). Les images vidéo ont été examinés dans la vitesse ajustée afin de visualiser différents teinté RBC. RBC flux est mesuré par comptage de RBC, qui volait à travers une artériole concentré primaires par minute.
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Discussion
Parmi les points techinical sont comme suit: (1) maintien de l'état physiologique de l'animal (aération, pH de la solution de la température du corps perfusative,), le volume d'injection (2) de l'tachés de RBC, et (3) les conditions d'observation (optique optimale sélection, l'intensité de fluorescence). Applications potentielles futures sont les suivants: (a) combinaison avec pharmacophysiological et / ou moléculaires interventions biologiques, (b) observation à long terme des artério / artériolo-sclérose et de la néovascularisation.
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Disclosures
Toutes les procédures liées à l'expérimentation animale ont été examinés et approuvés par le Sous-Comité de protection des animaux de recherche du Massachusetts General Hospital.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier JW Lichtman pour ses conseils en observation in vivo de muscles.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
