Summary
שיטה צדדי חדש להסתכלות של microcirculation מוצג. זה נחשב מתאים תצפית ארוכת טווח, ועל בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological או המולקולרית.
Abstract
רקע: גורמי רגולציה ופיזיולוגיה מפורט ב microcirculation vivo נותרו לא הבהיר באופן מלא לאחר שיטות שונות של הדמיה המציא. בעוד פרמטרים רבים מקרוסקופית של זרימת הדם לשקף מהירות זרימה, שינויים מהירות זרימת הדם ואת כדוריות הדם האדומות (RBC) השטף אינו מחזיק קשר לינארי בין תצפיות מיקרוסקופיות. ישנם דיווחים של אי התאמה בין מהירות RBC RBC שטף, השטף RBC ונפח הפלזמה זרימה של הטרוגניות במרחב ובזמן של ויסות זרימת ברקמות הפריפריה תצפיות מיקרוסקופיות, בסיס מדעי הדרישה של מחקרים מפורטים יותר בתקנה microcirculatory באמצעות intravital במיקרוסקופ.
שיטות: שיטה שונה של ג'ף ליכטמן של בהתבוננות מיקרוסקופית vivo של השרירים sternomastoid העכבר. עכברים מורדמים, מאוורר, והזריקו עם PKH26L-fluorescently RBCs שכותרתו להסתכלות מיקרוסקופית.
התוצאה & מסקנות: RBCs שכותרתו fluorescently מזוהים ומכובדת היטב על ידי מיקרוסקופ שדה רחב. התכווצות שרירים שעורר להגדיל גירוי חשמלי המושרה RBC השטף. כימות הפרמטרים האחרים לרבות מהירות RBC וצפיפות נימי היו ריאלי. עכברים נסבל היטב את הניתוח, הזרקת RBCs מוכתם, תצפית מיקרוסקופי, גירוי חשמלי. שריר לא נזק או כלי דם נצפתה, טוען כי השיטה שלנו הוא יחסית פחות פולשני מתאים לטווח ארוך תצפיות.
Protocol
RBC מכתים קרום
- עכבר לתאי דם אדומים תוקנו מהמאמץ אותו עם העכבר heparinization.
- עכבר RBC הוכתמו לצבוע PKH26 (551/567 ננומטר, והמקשר האדום פלורסנט תא הערכה, Sigma, ארה"ב).
- RBC נשטפו PBS ו מודגרות עם פתרון 2μM של צבע PKH26 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התגובה נעצר על ידי הוספת פלזמה (חום מובטל במשך שעה 1 ב 65 ° C מראש) ו מודגרות דקה 1.
- RBC מוכתם נשטפו 5 פעמים עם PBS.
עכבר הכנה
- שלושה עד שישה חודשים הישן זכר C57BL/10 עכברים ששימשו במחקר זה. אנו עכברים בהרדמה על ידי הזרקה של intraperitoneal pentobarbital (50mg/kgBW).
- עכברים היו צנרר ואז עם צינור 20-gage פוליאתילן, מאוורר מכני, וחיממה על 37 מעלות צלזיוס החימום גיליון Kapton מחובר חיישן תרמי וטמפרטורה משוב מערכת הבקר.
- הצד הגחוני של הצוואר היה מגולח. השרירים sternomastoid ימין ועל שמאל נחשפו. השרירים נתמכו על ידי בעל נירוסטה superfused עם פתרון סטרילי Ringer קרבס.
הזרקה
- RBCs ויטראז היו התחמם ב 37 מעלות צלזיוס, בדילול מלא עם קרבס Ringer. 50ul של RBC מוכתם (המטוקריט 12%) היה מוזרק עכבר מהעורק הפין.
בהתבוננות מיקרוסקופית vivo של שרירי השלד
עקבנו שיטת ג'ף ליכטמן וו 's עם שינוי 1:
- בעלי חיים הונחו על כרית חימום על גבי הבמה בעבודת יד ברזל של מיקרוסקופ Nikon Eclipse-800. מים טובלים עדשות אובייקטיבי נוצלו לצורך השגחה עלית פלורסנט לחיות. צפינו PKH26 מוכתם בתוך RBC של כלי הדם זורם תחת אור הניאון של מנורת כספית. זיהינו arterioles העיקרי, arterioles משניים, נימים וורידים על ידי כיוונים RBCs שלהם זרימה ארכיטקטורות.
- מצלמה SIT התעצמה (Hamamatsu Photonics, C2400, יפן) ו-Video מסגרת חוטף הותקנו כדי ללכוד את האות בעוצמה נמוכה בשיעור בזמן אמת וידאו (30 מסגרות לשנייה). תמונות נרשמו ב-DVD כמו קבצי וידאו.
גירוי שרירים
- פולס חשמלי נוצר באמצעות גירוי העצבים ההיקפית (Innervator 252, Fisher & Paykel בריאות, ניו זילנד), ונמסרו משטח השריר באמצעות בדיקה חלד מצופה. סוף בדיקה מינוס הושם על החלק הפרוקסימלי של שרירים סוף פלוס הושם על החלק הדיסטלי של שריר. גירויים טטנוס ניתנו בקצב של 50Hz למשך 5 שניות. גירויים חשמליים לא לגרום לנזק ישיר על myofiber בקרבת אזור המגע.
RBC ניתוח השטף
- הוקלט תמונות וידאו DVD הועברו קבצי וידאו סאוואנט תמונה באמצעות תוכנת מסגרת חוטף (וידאו סאוואנט, ארה"ב). תמונות וידאו נבדקו מהירות מותאם כדי להמחיש RBC מוכתם בודדים. RBC השטף נמדד על ידי ספירת RBC, אשר טס דרך עורקיק ראשוני ממוקד לדקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Techinical נקודות חשובות הן כדלקמן: (1) תחזוקה של המצב הפיזיולוגי של החיה (, אוורור pH של הטמפרטורה פתרון perfusative, גוף), (2) נפח הזרקה של RBC מוכתם, ו (3) התנאים תצפית (עדשה אופטימלי , בחירת עוצמת הקרינה). יישומים עתידיים אפשריים הם כדלקמן: (א) בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological ו / או המולקולרית, (ב) לטווח ארוך תצפית של עורקים / arteriolo טרשת ו-neovascularization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הנהלים הקשורים בניסויים בבעלי חיים היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת המשנה על טיפול בבעלי חיים למחקר של בית החולים הכללי במסצ'וסטס.
Acknowledgments
אנו מודים ג"ו ליכטמן על העצה שלו בהתבוננות vivo של השרירים.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
