Summary
Microcirculation के अवलोकन के लिए एक नई बहुमुखी विधि प्रस्तुत किया है. यह लंबी अवधि के अवलोकन के लिए उपयुक्त माना जाता है, और pharmacophysiological या आणविक जैविक उपायों के साथ संयोजन के लिए.
Abstract
पृष्ठभूमि: नियामक कारकों और vivo microcirculation में विस्तृत फिजियोलॉजी बनी हुई है इमेजिंग आविष्कार था के कई अलग अलग तौर तरीकों के बाद पूरी तरह स्पष्ट नहीं है. है जहां रक्त के प्रवाह के कई macroscopic मापदंडों प्रवाह वेग, रक्त के प्रवाह वेग और लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) में बदलाव को प्रतिबिंबित प्रवाह सूक्ष्म टिप्पणियों में रैखिक संबंध नहीं रखता है. आरबीसी वेग और आरबीसी प्रवाह, आरबीसी प्रवाह और प्लाज्मा प्रवाह की मात्रा के बीच है, और सूक्ष्म टिप्पणियों, microcirculatory विनियमन में अधिक विस्तृत अध्ययन की आवश्यकता के लिए वैज्ञानिक आधार का उपयोग परिधि के ऊतकों में में प्रवाह विनियमन के स्थानिक और लौकिक विविधता के विसंगति की खबरें हैं intravital माइक्रोस्कोपी.
विधि: हम माउस sternomastoid मांसपेशियों के vivo सूक्ष्म अवलोकन में जेफ है Lichtman की विधि को संशोधित. चूहे anesthetized हैं, हवादार, और सूक्ष्म अवलोकन के लिए PKH26L - fluorescently लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन.
परिणाम एवं निष्कर्ष: fluorescently लेबल लाल रक्त कोशिकाओं का पता चला और एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के द्वारा अच्छी तरह से प्रतिष्ठित है. आरबीसी प्रवाह में बिजली की उत्तेजना से प्रेरित वृद्धि के द्वारा पैदा की मांसपेशी संकुचन. आरबीसी वेग और केशिका घनत्व सहित अन्य मानकों की मात्रा का ठहराव संभव थे. चूहे अच्छी तरह से सर्जरी, दाग लाल रक्त कोशिकाओं के इंजेक्शन, सूक्ष्म अवलोकन, और बिजली की उत्तेजना सहन किया. कोई मांसपेशियों या रक्त वाहिनियों को नुकसान मनाया था सुझाव है कि हमारे विधि अपेक्षाकृत कम आक्रामक और लंबी अवधि टिप्पणियों के लिए अनुकूल है.
Protocol
आरबीसी झिल्ली धुंधला
- माउस लाल रक्त कोशिकाओं heparinization के साथ ही माउस तनाव से सही थे.
- माउस आरबीसी PKH26 डाई (, लाल फ्लोरोसेंट सेल linker किट, सिग्मा, संयुक्त राज्य अमरीका 551/567 एनएम) के साथ दाग रहे थे.
- आरबीसी पीबीएस में धोया गया और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए PKH26 डाई के 2μM समाधान के साथ incubated. प्रतिक्रिया प्लाज्मा जोड़ने (गर्मी 65 ° पहले सी पर 1 घंटे के लिए निष्क्रिय) और 1 मिनट के लिए incubated द्वारा बंद कर दिया गया था.
- दाग आरबीसी पीबीएस के साथ 5 बार धोया गया.
माउस तैयार
- तीन से छह महीने पुराने नर चूहों C57BL/10 इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. हम pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (50mg/kgBW) द्वारा anesthetized चूहों.
- चूहे तो एक polyethylene 20-पण ट्यूब के साथ intubated थे, यंत्रवत् हवादार, और 37 पर गरम ° सी Kapton पत्रक एक thermocouple सेंसर और प्रतिक्रिया तापमान नियंत्रक प्रणाली से जुड़े हीटर पर.
- गर्दन के ventral पक्ष मुंडा था. सही है और छोड़ दिया sternomastoid मांसपेशियों को अवगत कराया गया. मांसपेशियों को एक स्टेनलेस स्टील धारक द्वारा समर्थित थे और बाँझ क्रेब्स घंटी समाधान के साथ superfused.
इंजेक्शन
- सना हुआ लाल रक्त कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस, क्रेब्स घंटी के साथ पतला पर गर्म थे. Penile नस से सना हुआ आरबीसी (हेमाटोक्रिट 12%) के 50ul माउस में इंजेक्ट किया गया था.
कंकाल की मांसपेशियों के vivo सूक्ष्म अवलोकन में
हम एक संशोधन के साथ जेफ डब्ल्यू Lichtman विधि का पालन :
- पशु एक हाथ से बनाई गई एक Nikon ग्रहण-800 खुर्दबीन के लोहे के मंच के शीर्ष पर एक हीटिंग पैड पर रखा गया है. जल सूई उद्देश्य लेंस जीना अवलोकन महामारी फ्लोरोसेंट के लिए उपयोग किया गया. हम पारा दीपक के फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत PKH26 संवहनी दाग आरबीसी बह अंदर मनाया. हम अपने लाल रक्त कोशिकाओं प्रवाह दिशाओं और आर्किटेक्चर द्वारा arterioles प्राथमिक, माध्यमिक arterioles, capillaries और नसों की पहचान की.
- एक तेज एसआईटी (हमामात्सू फोटोनिक्स, C2400, जापान) कैमरा और वीडियो फ्रेम धरनेवाला के लिए वास्तविक समय वीडियो दर प्रति सेकंड (30 फ्रेम) पर कम तीव्रता के संकेत पर कब्जा करने के लिए स्थापित किया गया था. छवियाँ डीवीडी पर वीडियो फ़ाइलों के रूप में दर्ज किए गए.
स्नायु उसकाव
- एक विद्युत स्पंद एक परिधीय तंत्रिका उत्तेजक औधधि (252 Innervator, FISHER & PAYKEL हेल्थकेयर, न्यूजीलैंड) का उपयोग करते हुए उत्पन्न किया गया, और एक लेपित स्टेनलेस जांच के माध्यम से मांसपेशियों की सतह को दिया. एक ऋण जांच अंत पेशी के समीपस्थ हिस्से पर रखा गया था और एक से अधिक अंत में पेशी के बाहर का भाग पर रखा गया था. टेटनस stimulations 5 सेकंड के लिए 50Hz की दर पर दिया गया है. बिजली उत्तेजनाओं संपर्क क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र पर प्रत्यक्ष myofiber नुकसान का कारण नहीं था.
आरबीसी प्रवाह विश्लेषण
- रिकार्ड डीवीडी वीडियो छवियों फ्रेम धरनेवाला सॉफ्टवेयर (वीडियो सावंत, संयुक्त राज्य अमरीका) के माध्यम से वीडियो पंडित छवि फ़ाइलों को स्थानांतरित कर दिया गया. वीडियो छवियों को समायोजित गति में समीक्षा क्रम में करने के लिए व्यक्तिगत दाग आरबीसी कल्पना. आरबीसी प्रवाह आरबीसी, जो प्रति मिनट एक केंद्रित प्राथमिक arteriole के माध्यम से उड़ान भरी गिनती करके मापा गया था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
महत्वपूर्ण techinical अंक निम्नानुसार हैं: (1) जानवर की शारीरिक स्थिति (वेंटिलेशन perfusative समाधान है, शरीर के तापमान के पीएच), (2) दाग आरबीसी के इंजेक्शन की मात्रा, और (3) शर्तों के अवलोकन के लिए रखरखाव (इष्टतम लेंस चयन, प्रतिदीप्ति तीव्रता). संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों के निम्नानुसार हैं: pharmacophysiological और / या आणविक जैविक उपायों के साथ संयोजन (क), (ख) arterio / arteriolo काठिन्य और neovascularization के अवलोकन के लंबे समय तक.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी पशु प्रयोगों से संबंधित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के अनुसंधान जानवर की देखभाल पर उपसमिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
Acknowledgments
हम मांसपेशियों के vivo अवलोकन में JW Lichtman में उनकी सलाह के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
