In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Summary

Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

Abstract

BACKGROUND: fattori di regolamentazione e la fisiologia dettagliata del microcircolo in vivo sono rimasti non del tutto chiarita, dopo molti differenti modalità di imaging aveva inventato. Mentre molti parametri macroscopici del flusso di sangue riflettono velocità di flusso, i cambiamenti nella velocità del flusso sanguigno e di globuli rossi (RBC) flusso non regge relazione lineare nelle osservazioni microscopiche. Ci sono rapporti di discrepanza tra RBC velocità e flusso di RBC, RBC flusso e il volume di flusso di plasma e di eterogeneità spaziale e temporale di regolazione del flusso nei tessuti periferici nelle osservazioni microscopiche, una base scientifica per la necessità di studi più dettagliati nella regolazione del microcircolo con microscopia intravitale.

METODI: Abbiamo modificato il metodo di Jeff Lichtman di osservazione microscopica in vivo dei muscoli sternocleidomastoideo mouse. I topi sono anestetizzati, ventilato, e iniettati con PKH26L-fluorescente GR etichettati per l'osservazione microscopica.

RISULTATO & CONCLUSIONI: globuli rossi fluorescente vengono individuati e distinti anche da un ampio campo ottico. Contrazione muscolare evocata da aumentare la stimolazione elettrica indotta nel flusso di RBC. Quantificazione di altri parametri tra cui la velocità dei globuli rossi e la densità dei capillari erano fattibili. I topi ben tollerato la chirurgia, l'iniezione di globuli rossi macchiato, osservazione al microscopio, e la stimolazione elettrica. Nessun danno muscolare o vaso sanguigno è stato osservato, suggerendo che il nostro metodo è relativamente meno invasivo e adatto per osservazioni a lungo termine.

Protocol

RBC membrana colorazione

1. Topo globuli rossi sono stati corretti dal ceppo di topi con lo stesso eparinizzazione.
2. Topo RBC sono state colorate con PKH26 colorante (551/567 nm; Rosso fluorescente kit linker cellulari, Sigma, USA).
3. RBC sono state lavate in PBS e incubate con una soluzione di 2μM PKH26 colorante per 5 minuti a temperatura ambiente. La reazione è stata bloccata con l'aggiunta di plasma (inattivato con il calore per 1 ora a 65 ° C in anticipo) e incubate per 1 minuto.
4. Il macchiato RBC sono state lavate 5 volte con PBS.

Preparazione del mouse

1. Da tre a sei mesi di sesso maschile C57BL/10 topi sono stati utilizzati in questo studio. Siamo topi anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50mg/kgBW).
2. I topi sono poi stati intubati con un 20-gage tubo in polietilene, ventilati meccanicamente, e riscaldato a 37 ° C su un foglio di Kapton riscaldamento collegato a un sensore di temperatura termocoppia e sistema di feedback del controller.
3. Il lato ventrale del collo è stata rasata. I muscoli sternocleidomastoideo destro e sinistro sono stati esposti. I muscoli sono stati sostenuti da un supporto in acciaio inox e superfused con soluzione sterile Krebs Ringer.

Iniezione

1. Globuli rossi colorati sono stati riscaldati a 37 ° C, diluito con Krebs Ringer. 50ul macchiato di globuli rossi (ematocrito 12%) è stato iniettato in un mouse dalla vena del pene.

In vivo osservazione microscopica dei muscoli scheletrici

Abbiamo seguito il metodo di Jeff W. Lichtman 's con modifica ^1:

1. Gli animali sono stati posti su una piastra elettrica in cima ad una mano di ferro di una fase di Eclipse-800 microscopio Nikon. Acqua-immersione obiettivi obiettivi sono stati utilizzati per vivere epi-fluorescenza osservazione. Abbiamo osservato PKH26 all'interno macchiato RBC scorrere del vascolari sotto la luce di una lampada fluorescente Mercurio. Abbiamo identificato arteriole primaria, secondaria arteriole, capillari e delle vene dalle loro direzioni di flusso globuli rossi e le architetture.
2. Una telecamera intensificata SIT (Hamamatsu Photonics, C2400, Giappone) e video-frame grabber sono stati installati per catturare il segnale di bassa intensità al tempo reale tasso di video (30 fotogrammi al secondo). Le immagini sono state registrate su DVD come file video.

Stimolazione muscolare

1. Un impulso elettrico è stata generata utilizzando uno stimolatore del nervo periferico (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nuova Zelanda), e consegnato alla superficie dei muscoli attraverso una sonda rivestita in acciaio. Una fine meno sonda è stata posta sulla parte prossimale del muscolo e una fine più è stato posto sulla parte distale del muscolo. Stimolazioni tetano sono stati dati alla velocità di 50 Hz per 5 secondi. Gli stimoli elettrici non ha causato danni diretti miofibre in prossimità della zona di contatto.

RBC flusso di analisi

1. Registrato immagini video DVD Video sono stati trasferiti i file di immagine Savant tramite il software di frame grabber (Video Savant, USA). Le immagini video sono state riviste in velocità regolata in modo da visualizzare i singoli macchiato RBC. RBC flusso è stata misurata mediante conteggio dei globuli rossi, che ha volato attraverso un arteriola focalizzato primario al minuto.

Discussion

Importanti punti TECNICHE sono i seguenti: (1) mantenimento dello stato fisiologico dell'animale (ventilazione, perfusative pH della soluzione, la temperatura corporea), (2) volume di iniezione del macchiato RBC, e (3) condizioni per l'osservazione (lente ottimale selezione, intensità di fluorescenza). Potenziali applicazioni future sono i seguenti: (a) combinazione con interventi biologici pharmacophysiological e / o molecolari, (b) osservazione a lungo termine di arterio / arteriolo-sclerosi e neovascolarizzazione.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 dye		Sigma-Aldrich		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.