Summary
Новый универсальный метод для наблюдения микроциркуляцию представлена. Считается, подходит для долгосрочного наблюдения, так и для комбинации с pharmacophysiological или молекулярно-биологических вмешательств.
Abstract
ИСТОРИЯ ВОПРОСА: Регулирующие факторы и подробные физиологии микроциркуляции в естественных условиях остаются окончательно не уточнена после многих различных форм визуализации были изобретены. Хотя многие макроскопических параметров потока крови отражает скорость течения, изменения скорости кровотока и красные кровяные клетки (эритроциты) поток не выполняется линейная зависимость в микроскопических наблюдений. Есть сообщения, расхождения между РБК и РБК скорости потока, РБК потока и потока плазмы объема и пространственной и временной неоднородности регулирование стока в периферических тканях в микроскопических наблюдений, научной основы для требований более детальных исследований в микроциркуляторном регулированию использования прижизненной микроскопии.
Методы: Мы изменили метод Джефф Лихтман о в естественных условиях микроскопических наблюдений мышцы мыши грудино-сосцевидный. Мыши под наркозом, вентилируемые, и вводили PKH26L-флуоресцентно меченых эритроцитов для микроскопического наблюдения.
РЕЗУЛЬТАТ И ВЫВОДЫ: флуоресцентно меченых эритроцитов обнаружены и отличается хорошо широким полем зрения микроскопа. Сокращение мышц вызванные электрической стимуляцией индуцированный рост РБК потока. Количественная оценка других параметров, включая РБК скорости и плотности капилляров было возможно. Мыши хорошо переносится операции, инъекции окрашенные эритроциты, микроскопические наблюдения и электрической стимуляции. Нет мышц или повреждению кровеносных сосудов наблюдается, предполагая, что наш метод является относительно менее инвазивных и подходит для длительных наблюдений.
Protocol
Мембраны эритроцитов окрашивание
- Мышь клетки красной крови были исправлены с тем же штаммом мыши с гепаринизация.
- Мышь РБК окрашивали PKH26 красителя (551/567 нм, красный флуоресцентный комплект компоновщика клетки, Sigma, США).
- РБК промывали в PBS и инкубировали с 2 мкм решение PKH26 красителя в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением плазмы (тепло инактивированной в течение 1 часа при температуре 65 ° C заранее) и инкубировали в течение 1 минуты.
- Окрашенных РБК промывали 5 раз с PBS.
Мышь Подготовка
- От трех до шести месяцев летний мужчина C57BL/10 мышей были использованы в этом исследовании. Мы наркозом мышей при введении препарата в фенобарбиталом (50mg/kgBW).
- Мыши были тогда интубированных с 20-Gage полиэтиленовых труб, искусственной вентиляции легких, и нагревают при температуре 37 ° С на обогреватель Kapton лист связан с термопары датчика и обратной связи регулятора температуры системы.
- Вентральной стороне шеи был выбрит. Правой и левой грудино-сосцевидный мышцы подвергались. Мышцы были поддержаны из нержавеющей стали и держатель superfused стерильным раствором Кребса Рингера.
Инъекция
- Витражи были эритроциты нагревают при 37 ° С, разбавляют Кребса Рингера. 50ul окрашенных эритроцитов (гематокрит 12%) вводили мыши из полового члена вены.
В естественных условиях Микроскопические наблюдения скелетных мышц
Мы следовали Джефф В. Лихтман 'ы метода с модификацией 1:
- Животные были помещены на грелку на вершине ручной железо этапе Nikon Eclipse-800 микроскоп. Водо-погружения объективы были использованы для живых эпи-флуоресцентного наблюдения. Мы наблюдали PKH26 окрашенных РБК течет внутри сосудистого под флуоресцентным светом ртутной лампы. Мы определили первичные артериол, среднее артериол, капилляров и вен их эритроциты направления потока и архитектур.
- Активизировались SIT камера (Hamamatsu Photonics, C2400, Япония) и видео-захвата кадров были установлены, чтобы захватить низкой интенсивности сигнала на видео в реальном времени скорости (30 кадров в секунду). Изображения были записаны на DVD, видео файлов.
Миостимуляторы
- Электрический импульс, создан с помощью стимулятора периферических нервов (Innervator 252, Fisher & Paykel здравоохранения, Новая Зеландия), и доставлен в мышцах поверхность через покрытием из нержавеющей зонда. Минус конец зонда был сделан на проксимальной части мышцы и плюс конце был сделан на дистальной части мышцы. Столбняк стимуляции были даны из расчета 50 Гц в течение 5 секунд. Электрические стимулы не вызывают прямого ущерба myofiber по близости от площади контакта.
РБК потока анализ
- Записанные изображения DVD видео были перенесены видео файлы Savant образ с помощью программного обеспечения видеозахвата (Video Savant, США). Видеоизображение, были рассмотрены в установленном скорость, чтобы визуализировать отдельных окрашенных РБК. РБК потока измерялась путем подсчета РБК, который летел через сосредоточены первичные артериол в минуту.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно techinical точек таковы: (1) поддержание физиологического состояния животного (вентиляция, рН perfusative решение, температуры тела), (2) объемом впрыска от окрашенных РБК, и (3) условия наблюдения (оптимальный объектив Выбор, интенсивности флуоресценции). Потенциальные будущие приложения являются: (а) вместе с pharmacophysiological и / или молекулярно-биологических мероприятий, (б) долгосрочные наблюдения артерио / arteriolo-склероз и образование новых сосудов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все процедуры, связанные с экспериментов на животных, были рассмотрены и одобрены Подкомитетом по исследованиям животных Уход за Massachusetts General Hospital.
Acknowledgments
Мы благодарим JW Лихтман за его советы в в естественных условиях наблюдения мышц.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
