Summary
En ny mångsidig metod för observation av mikrocirkulation presenteras. Det anses lämpliga för observation under lång tid, och för kombination med pharmacophysiological eller molekylärbiologiska interventioner.
Abstract
BAKGRUND: Regulatoriska faktorer och detaljerade fysiologi av in vivo mikrocirkulationen har varit inte helt klarlagts efter många olika former av avbildning hade uppfunnit. Medan många makroskopiska parametrar blodflödet avspeglar flödeshastighet, förändringar i blodets strömningshastighet och röda blodkroppar (RBC) flux håller inte linjärt samband i mikroskopiska observationer. Det finns rapporter om diskrepans mellan RBC hastighet och RBC flux, RBC flux och plasma flöde volym, och tid och rum heterogena flödesreglering i perifera vävnader i mikroskopiska observationer, en vetenskaplig grund för kravet på mer detaljerade studier i mikrocirkulationen reglering med hjälp av intravital mikroskopi.
METODER: Vi ändrade Jeff Lichtman metod av in vivo mikroskopisk observation av muskler mus sternocleidomastoideus. Möss är sövda, ventilerade och injiceras med PKH26L-fluorescerande röda blodkropparna för mikroskopisk observation.
RESULTAT & SLUTSATSER: fluorescerande röda blodkroppar upptäcks och kännetecknas även av ett brett fält mikroskop. Muskelsammandragning framkallas genom elektrisk stimulering ökar RBC flux. Kvantifiering av andra parametrar, bland annat RBC hastighet och kapillär densitet var möjligt. Möss tolereras väl operationen, injektion av färgade röda blodkropparna, mikroskopisk observation, och elektrisk stimulering. Inga muskler eller blodkärl skada observerades, vilket tyder på att vår metod är relativt sett mindre invasiv och lämpar sig för långsiktiga observationer.
Protocol
RBC membranfärgning
- Mus röda blodkroppar korrigerades från samma musstam med heparin.
- Mus RBC färgades med PKH26 färgämne (551/567 nm, Röd fluorescerande celler länkare kit, Sigma, USA).
- RBC spolades i PBS och inkuberas med 2μM lösning av PKH26 färg i 5 minuter i rumstemperatur. Reaktionen stoppades genom att lägga till plasma (värmeinaktiverad i 1 timme vid 65 ° C i förväg) och inkuberas under 1 minut.
- Den färgade RBC spolades 5 gånger med PBS.
Mus Förberedelser
- Tre till sex månader gammal hane C57BL/10 möss har använts i denna studie. Vi sövda möss efter intraperitoneal injektion av pentobarbital (50mg/kgBW).
- Möss var då intuberade med ett 20-Gage-polyeten rör, mekaniskt ventilerade och värmde vid 37 ° C på en Kapton blad värmare ansluten till ett termoelement givare och feedback temperaturregulator system.
- Den ventrala sidan av halsen var rakad. Höger och vänster sternocleidomastoideus musklerna var exponerade. Musklerna stöddes av en rostfri hållare och superfused med steril Krebs Ringer lösning.
Injektion
- Målat röda blodkropparna var varm vid 37 ° C, utspätt med Krebs Ringer. 50ul av målat RBC (hematokrit 12%) var injiceras i musen från penis ven.
In vivo Mikroskopisk Observation av muskler
Vi följde Jeff W. Lichtman: s metod med modifikation 1:
- Djuren placerades på en värmedyna på toppen av en handgjord järn skede av en Nikon Eclipse-800 mikroskop. Vatten-doppning objektiv utnyttjades för live epi-fluorescerande observation. Vi observerade PKH26 målat RBC rinner inuti kärl i lysrörsbelysning för en kvicksilverlampa. Vi identifierade primära arterioler, sekundär arterioler, kapillärer och vener av deras röda blodkroppar flödesriktningarna och arkitekturer.
- En intensifierad SIT kamera (Hamamatsu Photonics, C2400, Japan) och video-frame grabber installerades för att fånga den låga intensitet signalen på realtidsvideo ränta (30 bilder per sekund). Bilderna har spelats in på DVD som videofiler.
Muskelstimulering
- En elektrisk puls skapades med hjälp av en perifer nerv Stimulator (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nya Zeeland), och levereras till musklerna ytan via en belagd rostfri sond. Ett minus sond slutet var placerad på den proximala delen av muskler och ett plus slut placerades på den distala delen av muskeln. Stelkramp stimuli fick vid 50 Hz i 5 sekunder. Den elektriska stimuli orsakade inte direkt myofiber skador på närhet kontaktytan.
RBC flödesanalys
- Inspelade DVD-videobilder överfördes Video Savant bildfiler genom frame grabber programvara (Video Savant, USA). Videobilder granskades i justerat hastigheten för att visualisera enskilda färgade RBC. RBC-flux mättes genom att räkna RBC, som flög genom ett fokuserat primärt arteriole per minut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktiga techinical punkter är följande: (1) underhåll av fysiologisk status för djur (ventilation, pH-värde perfusative lösningen, kroppstemperatur), (2) injektionsvolym av de färgade RBC, och (3) förutsättningar för observation (optimal lins urval, fluorescensintensiteten). Potentiella framtida tillämpningar är följande: (a) kombination med pharmacophysiological och / eller molekylärbiologiska insatser, (b) långvarig observation av arteriell / arteriolo-skleros och kärlnybildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla förfarandena i samband med djurförsök har granskats och godkänts av underutskottet för forskning Djurvård i Massachusetts General Hospital.
Acknowledgments
Vi tackar JW Lichtman om hans råd i in vivo-observation av muskler.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
