Summary
В этом протоколе, мы описали новый метод изучения влияния гетерогенности глиальных ячейку аксон роста с
Abstract
В центральной нервной системе всех млекопитающих, разорвала аксоны после травмы не в состоянии регенерировать их первоначальными целями и восстановления функций очень плохое 1. Провал регенерации аксонов совместным результатом нескольких факторов, включая враждебные глиальных среде клетки, тормозящий миелина связанных молекул и снижения внутреннего нейрона регенеративной способностью 2. Астроциты являются наиболее преобладающим типом клеток глии в центральной нервной системе и играют важную роль в аксон функций в соответствии с физиологии и патологии условиях 3. Отличие от гомологичной олигодендроцитов, астроцитов являются гетерогенными популяции клеток состоит различными астроцитов субпопуляций с различными морфологии и экспрессии генов 4. Функциональное значение этой неоднородности, такие, как их влияния на рост аксонов, в значительной степени неизвестно.
Для изучения глиальных клеток, особенно функции астроцитов неоднородности в поведении нейронов, мы установили новый метод совместного культивирования высоким спинным очищенный корень ганглиев нейронов с глиальных клеток, полученных от крыс коры головного мозга. По этой техники, мы имели возможность непосредственно сравнить адгезии нейронов и аксонов роста на различных субпопуляций астроцитов при том же условии.
В данном отчете мы приводим подробный протокол этого метода для астроцитов изоляции и культуры, задний корешок ганглиях нейронах выделения и очистки, а также со-культуры DRG нейроны с астроцитов. Этот метод также может быть распространена и на другие области мозга для изучения клеточной или региональной специфики взаимодействия нейронов и глиальных клеток.
Protocol
1. Культура Глия сотовый
Глиальные клетки могут быть культурным из разных регионов центральной нервной системы. Весь процесс показан в процессе фигуры.
День 1 Покрытие пластины культуры и покровные
- Сухой стерилизовать круглые покровные стекла микроскопа в автоклаве.
- Пластина стерилизовать покровных в стерилизованные 24-луночных культуры пластины.
- Пальто покровные с поли-лизина и инкубировать в течение 2 часов под корень температуры.
- Пальто 6-и культуре пластины таким же образом, как шаг 3.
- Вымойте покровные и 6-и культуре пластины в два раза дистиллированной водой и просушите в культуре капотом.
- Добавить 200 мкл среды DMEM (с 10% FBS) в каждую лунку в 24-луночного планшета и 2 мл в каждую лунку в 6-луночный планшет и поместить их в инкубатор под 37 градусов с 5% CO 2
День 2 Изоляция коры и глиальных клеточных культур
- Стерилизовать положительные капот рассечение потока.
- Включите УФ-светом в течение 20 мин.
- Спрей все поверхности с 70% этанола и подождите 15 минут перед использованием.
- Изменение времени: обезболить крысят (P2-P6) на переохлаждение, и обезглавить на базе framen магнум использовании операционных ножницами.
- Открытое черепа вдоль стреловидного шва использованием ножниц радужной оболочки и шелушиться черепа.
- Удаление переднего мозга и положить их в охлажденном L15 среде, под стереомикроскопа, тщательно очистите оболочки и мягкая оболочка с кровеносными сосудами, изолировать коры и промойте несколько раз L15 среды.
- Вырезать коры на мелкие кусочки с ножницами микрохирургии.
- Добавить 0,125% трипсина-EDTA подготовлен с L15 среду на куски коры и инкубировать в 37 градусов в течение 15 мин.
- Передача ткани блоков в 20 мл среды DMEM с 20% FBS в 50 мл трубки, добавьте ДНКазы фондовом решение окончательное 10ug/mL концентрации, аспирация ткани решение вверх и вниз по 20 раз с огнем полированного стекла Pasteure пипетки, собирать суспензии отдельных клеток.
- Вымойте клеточной суспензии один раз с DMEM среде, повторно приостанавливать клеток в DMEM с 10% FBS, граф клетки под микроскопом с гемоцитометра, клетки семян на 5000-10000/cm 2. Поддерживать клетки в 37 градусов 5% инкубатор, изменение половине среды 2 раза в неделю.
2. Спинной корневой Ganglia Нейроны изоляции, культуры и очистки
День 1 Подготовка материальной культуры
- Пальто стерилизовать покровные с поли-лизин, покровные мыть дважды перегонять воду и воздух сухой, положить их в 24-луночных планшетах.
- Добавьте 100 мкл Neurobasal среде с 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл), положите пластину на 37 градусов на 5% СО 2.
День 2 изолят ДРГ из эмбрионов
- Стерилизованное поток капот точно так же, как глиальные культуры клеток.
- Эвтаназии беременных крыс (E15) от передозировки с СО 2, стерилизовать живота на 70% этанола, эмбрионы были изолированы от матки и введены в охлажденном L15 среды.
- Изолировать спинной мозг связан с спинной ганглий корня под стереомикроскопа и трансфер в 35 блюд с охлажденной L15 среды.
- Сбор суспензии отдельных клеток и мыть один раз с NBF среды (Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл)).
День 3 Purify DRG нейроны
- 18ч-24ч после посева нейрона, добавить 1 мМ концентрированный раствор фондовом ФУДР к культуре нейрона к конечной концентрации 20 мкМ и конечном объеме 200 мкл.
- 72 часа спустя, заменить половину среды с Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL) без ФУДР. После этого, измените среду через день.
3. Coculture DRG нейронов глиальные клетки
- Когда глиальных клеточных культур достигла слияния (около 20 дней после посева), они были готовы к coculture с нейронами.
- 24 часов, прежде чем добавить очищенные нейроны, глиальные клетки среду были изменены на Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл).
- Очищенная нейроны были собраны из культуры скважин, одну подвеску клетки были получены путем механического, проходящих через огонь полированной пипетки Pasteure.
- После подсчета количества, нейроны были посеяны на 500/cm 2 на сливной глиальных клеток в Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL).
- Нейроны адгезии и аксонов роста на глиальные клетки могут быть записаны и проанализированы в различные моменты времени на изображение программного обеспечения для анализа и иммуноцитохимии использованием типа клеток специфических антител.
4. Представитель Результаты
- Глиальные культуре клеток: после посева, глиальные клетки станут сливной около 20 дней. В рамках этапа microsc отличиеОПЕ, было легко определить, что различные морфологические глиальных субпопуляций ячейки формируются различные подструктуры модели роста и GFAP положительные астроциты приходилось более 90%, как показали immuocytochemisty техники (рис. 1, рис 2).
- DRG нейроны культуры: В нашем методе лечения после 72 ФУДР часов, чистота DRG нейроны будет достигать 99% в течение 6 дней, DRG нейроны показали свои уникальные морфологии и с высоким ростом аксонов плотности (рис. 3, рисунок 4).
- Глиальных клеток и coculture нейронов: DRG адгезии нейронов и аксонов произошло с готовностью на глиальные клетки в течение 4 часов после посева, тщательные наблюдения показали, что адгезия нейронов и аксонов роста под влиянием глиальные клетки, которая субпопуляций формируется специальный подструктуры модели роста, то это может быть легко идентифицированы под фазового микроскопа отличие и иммуноцитохимии (рис. 5, рисунок 6).
Рисунок 1. Морфология сливной глиальных клеток. Корковая глиальных клеток высевали на полилизином покрытием покровное и культивировали в течение 20 дней, обратите внимание на различные модели роста глиальных клеток, клетки с левой стороны расположены в излучается способом.
Рисунок 2. Сливной глиальных клеток, помеченных Глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) антител. Обратите внимание, излучаемая расположение GFAP (красный) позитивные клетки с правой стороны.
Рисунок 3. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке без лечения ФУДР. Загрязняющих ячейки, образованные DRG фоне нейронов.
Рисунок 4. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке после лечения ФУДР. Фон загрязнения клетки были ликвидированы полностью.
Рисунок 5. Спинной корень ганглиев нейронов, выращенных на глиальных клеток. Нейроны адгезию и рост аксонов были заторможены по излучаемой расположены клетки и ограниченный с правой стороны глиальных клеток.
Рисунок 6. Спинной корень ганглиев нейронов, растущих на глиальные клетки помечены нейрофиламентов антител. Аксонов (зеленый) были заторможены по излучаемой расположены левой стороны глиальных клеток и ограниченный с правой стороны, все глиальные клетки были помечены GFAP антител (красный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот эксперимент протокол был разработан, чтобы достичь две цели для изучения глиальных клеток, влияние особенно астроцитов неоднородности на нейрон адгезии и аксонов роста. Первая цель заключалась в поддержании астроцитов неоднородность как можно больше, в этом эксперименте, сливающийся глиальных клеток культуры обогащенного астроциты была смешанной первичной культуре без каких-либо химической обработки и распространения пищеварения, что может еще больше ухудшить клетки и вызывают повреждение реакция астроцитов. Окончательный астроцитов чистоты более 90% GFAP положительным, с загрязнением фибробласты менее 1% и это будет проверено fibrobasts FN. Низкой плотности высева в начале сотворил клетки подвергаются несколько раундов деления до слияния. В рамках этапа микроскопом напротив, глиальных неоднородность ячейки наблюдали различные подструктуры формируются различные морфологические астроцитов. Второй целью было получить высокие очищенной нейронов DRG и coculture их глиальных клеток для изучения неоднородности влияние на поведение нейрона. Заражение клеток в спинной ганглий корень, такие как фибробласты и клетки Шванн очевидно, может влиять или изменять аксон роста в культуре условий 5, 6, чтобы избежать этого нежелательного влияния, DRG нейроны культивировали в бессывороточной среде и лечить ФУДР за 72 часа, чтобы убить всех другие типы клеток. После такой обработки DRG нейроны могут быть очищены достигает 99%. Это было более эффективным, чем традиционный метод, который необходимо рассматривать культуру нейронов в несколько раз 7. Одноместный нейронов DRG адгезии и аксонов рост может легко контролировать и отслеживать под фазового контраста микроскопа время записи истекает и метод анализа изображений, их взаимодействие с глиальные клетки могут быть проанализированы в деталях иммуноцитохимии и электронной техники микроскопом.
Было отмечено, что DRG нейроны не могут быть сохранены в пробирке в течение более 4 недель, их выживание было никаких признаков сокращения, но они не могли присоединиться к подложке больше, как правило, они бы отключить и закатать.
DRG нейроны могут быть сохранены на астроглиальных клеток в течение длительного времени (более 2 месяцев). Это долгосрочный coculture между высоким очищенной DRG нейроны и астроциты сделать отслеживание отдельных нейронов и аксонов роста на другой тип астроцитов легче, но и избежать неконтролируемого влияния от других клеток загрязнения в спинной ганглий корня. В течение всего процесса культуры, все клетки нужно обращаться осторожно, и все клетки всегда должны быть погружены в питательную среду. Чтобы получить высокий нейронов DRG чистоты, критическая точка продолжительность лечения ФУДР, более 72 часов лечение будет значительно компромисс сотовой жизнеспособность и короткие сроки лечения не может убить все клетки загрязнения. В оптимальном состоянии, можно получить большое количество нейронов DRG высокой чистоты в течение 1 недели. Используя этот coculture системы, мы обнаружили, что, в отличие от обычно убеждения, гетерогенных астроциты были разные влияет на нейроны и аксоны адгезии роста и субпопуляции астроциты показал сильное торможение как адгезия нейронов и аксонов роста. Кроме того, взаимодействие между астроцитов и аксонов роста, этот метод может быть использован в других исследованиях, таких как образование миелина, развитии нейронов изменения в собственных мощностей рост аксонов, гены и сигнальные пути, связанные с аксона роста. Она также может быть использован на мышах и других животных центральной нервной системы регионах для изучения взаимодействия между нейронами и глиальных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано FMMU новое открытие фундамент и частично NIH финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
