Summary
En este protocolo, que describe un nuevo método para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales en el crecimiento del axón con una
Abstract
En el sistema nervioso central de los mamíferos, axones dañados después de una lesión no son capaces de regenerar a sus objetivos originales y la recuperación funcional es muy pobre 1. El fracaso de la regeneración axonal es el resultado combinado de varios factores, incluyendo el ambiente hostil de células gliales, las moléculas inhibidoras de mielina y disminución de la relación intrínseca capacidad de regeneración de las neuronas 2. Los astrocitos son el tipo de células gliales más predominante en el sistema nervioso central y desempeñan un papel importante en las funciones del axón en la fisiología y la patología de condiciones 3. A diferencia de los oligodendrocitos homólogos, los astrocitos son una población celular heterogénea compuesta por diferentes sub-poblaciones de astrocitos con diversas morfologías y la expresión génica 4. La importancia funcional de esta heterogeneidad, como su influencia en el crecimiento axonal, es prácticamente desconocida.
Para el estudio de las células gliales, especialmente la función de la heterogeneidad de los astrocitos en el comportamiento de las neuronas, que estableció un nuevo método de cultivo de alta co-purificado neuronas raíz dorsal ganglios con células gliales obtenido de la corteza cerebral de rata. Mediante esta técnica, hemos sido capaces de comparar directamente la adhesión neuronal y el crecimiento de los axones en las subpoblaciones astrocitos diferentes en las mismas condiciones.
En este informe, le damos el protocolo detallado de este método para el aislamiento de los astrocitos y la cultura, los ganglios de la raíz dorsal neuronas aislamiento y purificación, y el co-cultivo de neuronas DRG con los astrocitos. Este método también podría extenderse a otras regiones del cerebro para estudiar la interacción celular específica o regionales entre las neuronas y células gliales.
Protocol
1. Cultivo de células glía
Las células gliales pueden ser cultivadas de diferentes regiones del sistema nervioso central. Todo el proceso se muestra en la figura del proceso.
Día 1 de recubrimiento placa de cultivo y cubreobjetos
- Seco ronda esterilizados cubreobjetos de vidrio para microscopio en un autoclave.
- La placa cubreobjetos esterilizados en la placa esterilizada cultivo de 24 pocillos.
- Cubra el cubreobjetos con poli-lisina y se incuba durante 2 horas a temperatura de la raíz.
- Escudo de 6 y placas de cultivo de la misma manera que en el paso 3.
- Lave el cubreobjetos y 6-así placa de cultivo de dos veces con agua destilada y secar al aire en el capó cultura.
- Añadir 200 l medio DMEM (con 10% de SFB) en cada pocillo de 24 y placa y 2 mL en cada pocillo de 6 pocillos y ponerlos en la incubadora por debajo de 37 grados con 5% de CO 2
Día 2 corteza de aislamiento y cultivo de células gliales
- Esterilizar la campana de flujo positivo de disección.
- Encienda la luz UV durante 20 minutos.
- Rocíe todas las superficies con alcohol al 70% y esperar 15 minutos antes de su uso.
- cambian de tiempo: las crías de rata Anestesie (P2-P6) por hipotermia, y decapitar a la base de la magna framen con unas tijeras de operación.
- Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con una tijera iris y se desprenda del cráneo.
- Quitar el cerebro anterior y ponerlos en frío L15, bajo microscopio estereoscópico, limpiar cuidadosamente la membrana dura y pia con los vasos sanguíneos, aislar la corteza y lavar varias veces con medio L15.
- Cortar la corteza en trozos pequeños con tijeras de microcirugía.
- Agregar 0,125% de tripsina-EDTA preparada con medio L15 en pedazos la corteza y se incuban en 37 grados durante 15 minutos.
- Transferencia de bloques de tejido en 20 ml de medio DMEM con FBS al 20% en 50 ml de tubo, agregar la solución de DNasa acciones a 10ug/mL concentración final, se aspira la solución de los tejidos arriba y hacia abajo durante 20 horas con el fuego cristal pulido Pasteure pipeta, recoger la suspensión de células individuales.
- Lave la suspensión de células una vez con medio DMEM, volver a suspender las células en DMEM con FBS al 10%, recuento de células bajo el microscopio de las células de las semillas con un hemocitómetro, en 5000-10000/cm 2. Mantener las células en un incubador de grado 37 5%, el cambio de la mitad de la media dos veces por semana.
2. Ganglios dorsales neuronas raíz Aislamiento, cultivo y purificación
Día 1 Prepare Cultura Material
- Cubra el cubreobjetos esterilizados con poli-lisina cubreobjetos de lavado, dos veces con destilar el agua y el aire seco, ponerlos en placas de 24 pocillos.
- Añadir medio Neurobasal 100μL con un 2% B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml), se puso la placa en 37 grados de CO 2 al 5%.
Día 2 Aislar GRD a partir de embriones
- Esterilizar la campana de flujo en la misma forma que el cultivo de células gliales.
- La eutanasia a una rata preñada (E15) por sobredosis de CO 2, el abdomen esterilizados en un 70% de etanol, los embriones fueron aisladas de útero y la puesta en frío L15.
- Aislar a la médula espinal con los ganglios de la raíz dorsal conectada en microscopio estereoscópico y la transferencia a los platos refrigerados de 35 mm con medio L15.
- Recoger única suspensión de células y lavar una vez con NBF medio (medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml)).
Día 3 Purificar neuronas DRG
- 18h-24h después de la siembra de neuronas, añadir un 1 mM de solución concentrada de acciones FUDR a la cultura de las neuronas a una concentración final de 20 my un volumen final de 200 mL.
- 72 horas más tarde, reemplace la mitad de la media con medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL) sin FUDR. Después de eso, el cambio del medio día por medio.
3. Cocultivo neuronas DRG con las células gliales
- Cuando el cultivo de células gliales llegó a la confluencia (alrededor de 20 días después de la siembra), que estaban listos para co-cultivo con las neuronas.
- 24 horas antes de la adición de las neuronas purificadas, las células gliales medio se cambió a medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / mL).
- Neuronas purificada fueron recolectadas en pozos cultura, la suspensión células individuales se obtiene al pasar a través de una pipeta mecánica Pasteure pulidas al fuego.
- Después de contar el número, las neuronas se sembraron a 500/cm 2 en las células gliales confluentes en un medio de Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL).
- Adhesión de las neuronas y el crecimiento de las neuritas en las células gliales pueden ser registrados y analizados en diferentes momentos por el software de análisis de imagen y inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos tipo de células específicas.
4. Resultados representante
- Cultivo de células gliales: Después de la siembra, las células gliales que confluyen alrededor de 20 días. Bajo microsc de contraste de faseopa, que se puede identificar fácilmente que las diferentes subpoblaciones de células gliales forman morfológicas diferentes subestructuras patrón de crecimiento y los astrocitos GFAP positivos representaron más del 90%, como se muestra mediante la técnica de immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2).
- DRG neuronas cultura: En este método, después de 72 horas de tratamiento FUDR, la pureza de las neuronas DRG llegará tan alto como 99% en los 6 días, las neuronas DRG mostró sus morfologías únicas y con un alto crecimiento de neuritas densidad (Figura 3, Figura 4).
- Co-cultivo de células gliales y las neuronas: las neuronas DRG adherencia y crecimiento de las neuritas se produjo con facilidad en las células gliales en las 4 horas después de la siembra, la observación cuidadosa mostró que la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas se vieron influidos por las subpoblaciones de células gliales, que forman especiales subestructuras patrón de crecimiento, esto podría ser fácilmente identificados bajo el microscopio de contraste de fase y por inmunocitoquímica (Figura 5, Figura 6).
Figura 1. Morfología de las células gliales confluentes. Cortical células gliales se chapada en cubreobjetos recubiertos polilisina y se cultivaron durante 20 días, tenga en cuenta el patrón de crecimiento diferente de las células gliales, las células en la parte izquierda dispuestos en forma radiada.
Figura 2. Confluente células gliales marcado por proteína ácida glial fibrilar (GFAP) de anticuerpos. Tenga en cuenta la disposición emitida por GFAP (rojo) células positivas en el lado derecho.
Figura 3. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro sin necesidad de tratamiento FUDR. La contaminación de las células formadas DRG fondo de las neuronas.
Figura 4. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro después del tratamiento FUDR. Las células de fondo contaminantes se había eliminado por completo.
Figura 5. Neuronas dorsales ganglios de la raíz cultivada en células gliales. Adherencia y crecimiento de las neuritas neuronas se inhibieron en las células radiadas organizado y limitado en las células gliales lado derecho.
Figura 6. Neuronas dorsales ganglios de la raíz que crece en las células gliales marcado por anticuerpos neurofilamentos. El neuritas (verde) se inhibió en la radiación dispuestos células gliales lado izquierdo y limitada en el lado derecho, todas las células gliales se marcaron con anticuerpos GFAP (rojo).
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Discussion
Este protocolo experimento fue diseñado para alcanzar dos metas para estudiar las células gliales, la influencia de la heterogeneidad, especialmente los astrocitos en la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas. El primer objetivo era mantener la heterogeneidad de los astrocitos en lo posible, en este experimento, la confluencia de las células gliales cultura astrocitos enriquecido se mezcla la cultura primaria sin ningún tipo de tratamiento químico y la propagación de la digestión, lo cual puede dañar las células e inducir la respuesta de una lesión de los astrocitos. La pureza de astrocitos final es más del 90% GFAP positivas, con los fibroblastos contaminación menos del 1% según lo verificado por fibrobasts FN. La densidad de siembra de baja al inicio las células ha sido la de varias rondas de división antes de su confluencia. Bajo el microscopio de contraste de fase, la heterogeneidad de las células gliales se observó por la subestructura formada por diferentes diferentes astrocitos morfológicas. El segundo objetivo era conseguir altos purificada neuronas DRG y co-cultivo con células gliales para estudiar la influencia de la heterogeneidad en el comportamiento de las neuronas. Células contaminantes en los ganglios de la raíz dorsal, como los fibroblastos y las células de Schwann, aparentemente podría influir o modificar el crecimiento de los axones en las condiciones de cultivo 5, 6, para evitar que esta influencia no deseados, las neuronas DRG fueron cultivadas en medio libre de suero y tratados por FUDR de 72 horas para matar a todos los otros tipos celulares. Después de este tratamiento, las neuronas DRG puede ser purificado hasta el 99%. Que era más eficiente que el método tradicional que necesita para el tratamiento de la cultura de las neuronas en varias ocasiones 7. Adhesión sola neurona DRG y crecimiento de los axones pueden ser fácilmente controlados y seguidos bajo el microscopio de contraste de fase de grabación de lapso de tiempo y el método de análisis de imágenes, su interacción con las células gliales pueden ser analizados en detalle por inmunocitoquímica y técnica de microscopía electrónica.
Se observó que las neuronas DRG no pudo mantenerse in vitro durante más de 4 semanas, su supervivencia había ninguna señal de reducción, pero no pudieron adherirse al sustrato por más tiempo, por lo general que se separe y se enrolla.
Las neuronas DRG podría mantenerse en las células astroglial por un largo tiempo (más de 2 meses). Esta co-cultivo a largo plazo entre las neuronas DRG alta purificada y astrocitos hacer el seguimiento de las neuronas individuales y crecimiento de los axones en diferentes tipos de astrocitos con mayor facilidad, sino que también evitar la influencia incontrolada de las células de otro tipo de contaminación en los ganglios de la raíz dorsal. Durante el proceso de la cultura general, todas las células deben ser manejados cuidadosamente y todas las células deben ser siempre inmerso en medio de cultivo. Para obtener las neuronas DRG alta pureza, a un punto crítico es la duración del tratamiento FUDR, más de 72 horas de tratamiento significativamente comprometer la viabilidad celular y el tratamiento de corto tiempo no puede matar a todas las células de la contaminación. En las condiciones óptimas, se puede obtener gran cantidad de neuronas de alta pureza DRG dentro de 1 semana. El uso de este sistema de co-cultivo, se encontró que, a diferencia de creencias comunes, los astrocitos se heterogénea diferentes influencias sobre la adhesión de las neuronas y crecimiento de los axones y astrocitos subpoblación mostró fuerte inhibición de la adhesión neuronal y en el crecimiento del axón. Además de la interacción entre astrocitos y crecimiento de los axones, este método podría ser utilizado en otros estudios sobre como la formación de la mielina, los cambios neuronales en el desarrollo de la capacidad intrínseca de crecimiento de los axones, los genes y la señal de las vías relacionadas con el crecimiento del axón. También se puede utilizar en los ratones y otros animales "regiones del sistema nervioso central para estudiar la interacción entre las neuronas y células gliales.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por FMMU nueva búsqueda de fundación y en parte la financiación del NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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