Summary
In questo protocollo, abbiamo descritto un nuovo metodo per studiare l'influenza delle eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni con un
Abstract
Nel sistema nervoso centrale di tutti i mammiferi, gli assoni interrotto dopo l'infortunio non sono in grado di rigenerare i propri obiettivi di originale e di recupero funzionale è molto povera 1. Il fallimento della rigenerazione assonale è il risultato combinato di diversi fattori tra cui l'ambiente ostile di cellule gliali, inibitori delle molecole legate mielina dei neuroni e una diminuzione intrinseca capacità rigenerativa 2. Astrociti sono il tipo più predominante delle cellule gliali nel sistema nervoso centrale e svolgono un ruolo importante nelle funzioni dell'assone in fisiologia e le condizioni di patologia 3. Contrasto con l'omologo oligodendrociti, gli astrociti sono una popolazione cellulare eterogenea composta da diverse sottopopolazioni astrociti con morfologie diverse e l'espressione genica 4. Il significato funzionale di questa eterogeneità, come ad esempio le loro influenze sulla crescita degli assoni, è in gran parte sconosciuto.
Per studiare le cellule gliali, in particolare la funzione di eterogeneità astrociti nel comportamento dei neuroni, abbiamo stabilito un nuovo metodo di co-colture di neuroni alta radice purificata gangli dorsali con le cellule gliali ottenuto dalla corteccia di ratto. Con questa tecnica, siamo stati in grado di confrontare direttamente l'adesione e la crescita degli assoni dei neuroni in diverse sottopopolazioni astrociti nelle stesse condizioni.
In questo rapporto, diamo il protocollo dettagliato di questo metodo per l'isolamento astrociti e la cultura, i neuroni dei gangli dorsali isolamento e la purificazione, e la co-coltura di neuroni DRG con astrociti. Questo metodo potrebbe essere esteso anche ad altre regioni del cervello per studiare cellulare o regionali specifici di interazione tra i neuroni e cellule gliali.
Protocol
1. Glia colture cellulari
Cellule gliali possono essere coltivate provenienti da diverse regioni del sistema nervoso centrale. L'intero processo è mostrato in figura processo.
Giorno 1 cultura piastra di rivestimento e coprioggetto
- Sterilizzati a secco tondo microscopio vetro coprioggetto in autoclave.
- Targhetta del coprioggetto sterilizzati sterilizzato in 24 pozzetti cultura.
- Rivestire il coprioggetto con poli-lisina e incubare per 2 ore a temperatura radice.
- Cappotto da 6 pozzetti cultura allo stesso modo il punto 3.
- Lavare i coprioggetti e 6-bene piastra di coltura per due volte con acqua distillata e aria secca nella cappa della cultura.
- Aggiungere 200 microlitri di media DMEM (con 10% FBS) in ciascun pozzetto a 24-pozzetti e 2 ml di ogni bene in 6 pozzetti e metterle in incubatrice sotto 37 gradi con il 5% di CO 2
Giorno 2 corteccia di isolamento e coltura di cellule gliali
- Sterilizzare il positivo cofano dissezione flusso.
- Accendere la luce UV per 20 minuti.
- Spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo e attendere 15 minuti prima dell'uso.
- cambiamento teso: cuccioli di ratto Anestetizzare (P2-P6) per ipotermia, e decapitare alla base della magnum framen con le forbici operativo.
- Aprire il cranio lungo la sutura sagittale con un forbice iride e staccare il cranio.
- Rimuovere il proencefalo e metterle in fresco L15 media, sotto stereomicroscopio, pulire accuratamente la membrana dura e pia con i vasi sanguigni, isolare la corteccia e lavare più volte con L15 media.
- Tagliare la corteccia in piccoli pezzi con forbice microchirurgia.
- Aggiungi 0,125% tripsina-EDTA preparati con L15 medio a pezzi corteccia e incubare a 37 gradi per 15 min.
- Trasferire blocchi di tessuto in 20 mL medium DMEM con 20% FBS in 50mL tubo, aggiungere soluzione madre DNasi per 10ug/mL concentrazione finale, aspirare la soluzione di tessuto su e giù per 20 volte con lucido vetro fuoco Pasteure pipetta, raccogliere la sospensione singole cellule.
- Lavare la sospensione cellulare una volta con DMEM medio, risospendere le cellule in DMEM con 10% FBS, contare le cellule al microscopio le cellule con un emocitometro, seme a 5000-10000/cm 2. Mantenere le cellule in grado incubatore 37 5%, cambiare la metà della media 2 volte alla settimana.
2. Gangli della radice dorsale neuroni isolamento, la cultura e purificazione
Giorno 1 Preparare Cultura Materiale
- Rivestire il coprioggetto sterilizzati con poli-lisina, coprioggetto lavare due volte con distillare l'acqua e l'aria secca, metterle in piastre da 24 pozzetti.
- Aggiungi 100μL medio Neurobasal con il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / mL), messo piastra in 37 CO grado 5% 2.
Giorno 2 Isolare DRG da embrioni
- Sterilizzato la cappa a flusso nello stesso modo come la cultura delle cellule gliali.
- Euthanize un ratto in gravidanza (E15) per overdose di CO 2, addome sterilizzati con etanolo al 70%, gli embrioni sono stati isolati da utero e messo in fresco L15 media.
- Isolare i cavi collegati spinale con i gangli spinali sotto stereomicroscopio e trasferimento a piatti da 35 mm con refrigerata L15 media.
- Raccogliere sospensione singola cella e lavare una volta con NBF medio (medio Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / ml)).
3 ° giorno Purify neuroni DRG
- 18h-24h dopo la semina neurone, aggiungere una soluzione concentrata di mm 1 magazzino FUDR alla cultura neurone ad una concentrazione finale di 20 micron e un volume finale di 200 ul.
- 72h dopo, sostituire la metà della media con media Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50ng/mL) senza FUDR. Dopo di che, cambiare il medium a giorni alterni.
3. Co-coltura neuroni DRG con le cellule gliali
- Quando la cultura di cellule gliali raggiunto confluenza (circa 20 giorni dopo la semina), erano pronti per la co-coltura con i neuroni.
- 24 ore prima di aggiungere i neuroni purificate, le cellule gliali media sono stati modificati e medie Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50 ng / ml).
- Neuroni purificati sono stati raccolti dai pozzi cultura, singolo sospensione le cellule sono state ottenute facendo passare meccanico attraverso pipetta Pasteure fuoco lucido.
- Dopo il conteggio del numero, i neuroni sono stati seminati a 500/cm 2 sul confluenti cellule gliali nel medio Neurobasal contenente il 2% B27 e 2,5 s NGF (50ng/mL).
- Adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti delle cellule gliali potrebbero essere registrati e analizzati in diversi momenti da un software di analisi delle immagini e immunocitochimica utilizzando anticorpi tipo specifico di cellule.
4. Rappresentante Risultati
- Coltura delle cellule gliali: Dopo la semina, le cellule gliali diventerà confluenti circa 20 giorni. Sotto microsc contrasto di faseOPE, è stato facilmente identificato che diverse sottopopolazioni morfologica delle cellule gliali formate diverse sottostrutture modello di crescita e la astrociti GFAP positivi rappresentato più del 90%, come indicato dalla tecnica immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2).
- DRG cultura neuroni: Nel nostro metodo, dopo 72 FUDR trattamento ore, la purezza dei neuroni DRG raggiungerà più in alto del 99% entro 6 giorni, i neuroni DRG hanno mostrato la loro morfologia unica e con una crescita dei neuriti alta densità (Figura 3, Figura 4).
- Co-coltura delle cellule gliali e neuroni: i neuroni DRG adesione e crescita dei neuriti verificato facilmente sulle cellule gliali entro 4 ore dopo la semina, attente osservazioni hanno mostrato che l'adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti sono stati influenzati da sottopopolazioni di cellule gliali che formano speciale sottostrutture modello di crescita, questo potrebbe essere facilmente identificati al microscopio a contrasto di fase e mediante immunocitochimica (Figura 5, Figura 6).
Figura 1. Morfologia delle cellule gliali confluenti. Corticale cellule gliali sono stati placcati in polilisina coprioggetto patinata e in coltura per 20 giorni, notare le differenze nello sviluppo di cellule gliali, le cellule sulla sinistra disposti in modo irradiata.
Figura 2. Confluenti cellule gliali etichettati da proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) anticorpale. Noti la disposizione irradiata di GFAP (rosso), le cellule positive sul lato destro.
Figura 3. Neuroni dei gangli dorsali è cresciuto in vitro senza trattamento FUDR. Le cellule contaminanti formata DRG sfondo neuroni '.
Figura 4. Neuroni dei gangli dorsali è cresciuto in vitro dopo il trattamento FUDR. Le cellule sfondo contaminanti erano stati eliminati completamente.
Figura 5. Neuroni dei gangli dorsali coltivati su cellule gliali. Adesione neuroni e la crescita dei neuriti sono stati inibiti sulle cellule irradiate organizzato e limitato sul lato destro cellule gliali.
Figura 6. Neuroni dei gangli dorsali crescono sulle cellule gliali etichettati da anticorpi neurofilamenti. La neurite (verde) sono stati inibiti sul irradiata celle disposte a sinistra gliali e limitato sul lato destro, tutte le cellule gliali sono stati etichettati da anticorpi GFAP (rosso).
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Discussion
Questo protocollo esperimento è stato progettato per raggiungere due obiettivi per studiare le cellule gliali, l'influenza di eterogeneità soprattutto astrociti sulla adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti. Il primo obiettivo era quello di mantenere l'eterogeneità astrociti il più possibile, in questo esperimento, la confluenza delle cellule gliali cultura astrociti arricchito è stato mixato cultura primaria senza alcun trattamento chimico e la propagazione digestione, che possono ulteriormente danneggiare la cellula e indurre una risposta ferimento di astrociti. La purezza finale astrociti è superiore al 90% GFAP positivi, con fibroblasti contaminazione inferiore all'1%, come verificato da fibrobasts FN. La densità di semina a bassa all'inizio cellule fatto subire vari cicli di divisione prima di confluenza. Al microscopio contrasto di fase, l'eterogeneità delle cellule gliali è stato osservato dai diversi sottostruttura formata da diversi astrociti morfologiche. Il secondo obiettivo era quello di ottenere elevati neuroni DRG purificata e co-coltura con cellule gliali per studiare l'influenza eterogeneità sul comportamento dei neuroni. Cellule contaminanti nei gangli delle radici dorsali, come fibroblasti e cellule di Schwann potrebbe apparentemente influenzare o cambiare la crescita degli assoni nelle condizioni di coltura 5, 6, per evitare questa influenza non desiderati, i neuroni DRG sono stati coltivati nel siero di media liberi e trattati da FUDR per 72 ore per uccidere tutti i tipi di cellule. Dopo questo trattamento, i neuroni DRG potrebbe essere purificati alto come 99%. E 'stato più efficiente metodo tradizionale che deve trattare la cultura neuroni più volte 7. Singola adesione dei neuroni DRG e la crescita degli assoni potrebbe essere facilmente controllata e tracciata al microscopio a contrasto di fase con tempo di registrazione lapse e metodo di analisi delle immagini, la loro interazione con le cellule gliali possono essere analizzati in dettaglio mediante immunocitochimica e la tecnica di microscopia elettronica.
È stato osservato che i neuroni DRG non potevano essere mantenute in vitro per più di 4 settimane, la loro sopravvivenza non aveva alcun segno di riduzione, ma non hanno potuto aderire al substrato più, di solito si sarebbero staccare e arrotolare.
Neuroni DRG potrebbe essere mantenuto sulle cellule astrogliali per lungo tempo (più di 2 mesi). Questo co-coltura a lungo termine tra i neuroni DRG ad alta purificato e astrociti consentono la tracciabilità dei singoli neuroni e della crescita degli assoni su diversi tipi di astrociti più facilmente, è anche di evitare l'influenza incontrollata di cellule altre contaminazioni nei gangli delle radici dorsali. Durante il processo di intera cultura, tutte le cellule devono essere maneggiati con cura e tutte le cellule devono essere sempre immersi nel terreno di coltura. Per ottenere i neuroni DRG ad alta purezza, un punto critico è la durata del trattamento FUDR, più di 72 ore dalla trattamento sarà compromesso in modo significativo la vitalità cellulare e trattamento breve periodo di tempo non possono uccidere tutte le cellule contaminazione. Nella condizione ottimale, possiamo ottenere grandi quantità di neuroni DRG ad alta purezza entro 1 settimana. Utilizzando questo sistema di co-coltura, abbiamo scoperto che, in contrasto con le credenze condivise, astrociti eterogenei aveva diverse influenze sulla adesione e la crescita degli assoni dei neuroni, astrociti e sottopopolazione ha mostrato forte inibizione dei neuroni sia per l'adesione e la crescita degli assoni. Oltre l'interazione tra astrociti e la crescita degli assoni, questo metodo potrebbe essere utilizzato in altri studi su come la formazione della mielina, i cambiamenti di sviluppo neuronale nella capacità intrinseca di crescita degli assoni, i geni e il segnale percorsi legati alla crescita degli assoni. Può anche essere utilizzato nei topi e nelle regioni centrali degli altri animali 'del sistema nervoso per studiare l'interazione tra i neuroni e cellule gliali.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da nuovi FMMU trovando fondazione e in parte fondi NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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