Summary
In diesem Protokoll beschrieben wir eine neue Methode, um den Einfluss von Gliazellen Heterogenität auf Axon Wachstum mit einer Studie
Abstract
In dem zentralen Nervensystem von Säugetieren, sind abgetrennte Axone nach einer Verletzung nicht in ihre ursprünglichen Ziele und funktionelle Wiederherstellung zu regenerieren ist sehr schlecht 1. Das Scheitern der Axonregeneration ist ein kombiniertes Ergebnis von mehreren Faktoren ab, einschließlich der feindlichen Gliazellen Umwelt, hemmende Myelin verwandten Molekülen und verminderte innere Neuron regenerative Kapazität 2. Astrozyten sind der vorherrschende Typ Gliazellen im zentralen Nervensystem und spielen eine wichtige Rolle bei der Axon-Funktionen unter Physiologie und Pathologie Bedingungen 3. Gegensatz zu den homologen Oligodendrozyten, Astrozyten sind eine heterogene Zellpopulation durch verschiedene Astrozyten Subpopulationen mit unterschiedlichen Morphologien und Genexpression 4 zusammen. Die funktionelle Bedeutung dieser Heterogenität, wie ihre Einflüsse auf die Axon-Wachstum, ist weitgehend unbekannt.
Zur Untersuchung der Gliazellen, vor allem die Funktion der Astrozyten Heterogenität in Neuron Verhalten, haben wir eine neue Methode durch Co-Kultivierung hoch gereinigten Spinalganglien Neuronen mit Gliazellen aus der Ratte Cortex erhalten. Mit dieser Technik konnten wir den direkten Vergleich Neuron Haftung und Axon-Wachstum auf verschiedenen Astrozyten Subpopulationen unter den gleichen Bedingungen.
In diesem Bericht geben wir die ausführliche Protokoll dieser Methode für Astrozyten Isolation und Kultur, Spinalganglien Neuronen Isolierung und Aufreinigung, und die Co-Kultur von DRG-Neuronen mit Astrozyten. Diese Methode könnte auch auf andere Hirnregionen erweitert werden, um zelluläre oder regional spezifische Wechselwirkung zwischen Neuronen und Gliazellen zu studieren.
Protocol
1. Glia Cell Culture
Gliazellen können aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems gezüchtet werden. Der gesamte Prozess ist in Bearbeitung Abbildung dargestellt.
Tag 1 Coating Kultur Platte und Deckgläser
- Dry sterilisiert Glas Mikroskop runde Deckgläser in einem Autoklaven.
- Platte der sterilisierten Deckgläschen in sterilisierte 24-well Platten.
- Bestreichen Sie die Deckgläser mit Poly-Lysin und inkubieren für 2 Stunden unter root Temperatur.
- Coat 6-well-Platten in der gleichen Weise wie in Schritt 3.
- Waschen Sie die Deckgläser und 6-Loch-Kulturplatte zweimal mit destilliertem Wasser ab und trocknen in Kultur Kapuze.
- Geben Sie 200 ul DMEM Medium (mit 10% FBS) in jedes Well in 24-Well-Platte und 2 ml in jedes Well in 6-Well-Platte und setzte sie in Inkubator unter 37 Grad mit 5% CO 2
Tag 2 Isolating Kortex und Gliazellen Kultur
- Sterilisieren Sie die positive flow Dissektion Kapuze.
- Schalten Sie UV-Licht für 20 min.
- Spray alle Oberflächen mit 70% Ethanol und warten Sie 15 min vor dem Gebrauch.
- Wechsel angespannt: Anesthetize Rattenjungen (P2-P6) durch Hypothermie und enthaupten an der Basis der framen magnum mit Betriebssystem Schere.
- Öffnen der Schädeldecke entlang der Sagittalnaht mit einem Iris-Schere und ziehen Sie den Schädel.
- Entfernen Sie das Vorderhirn und steckte sie in ein gekühltes L15 Medium unter Stereomikroskop, sorgfältig reinigen Sie die Dura und Pia Membran mit Blutgefäßen, isolieren die Hirnrinde und waschen mehrmals mit L15-Medium.
- Schneiden Sie die Hirnrinde in kleine Stücke mit mikrochirurgischen Schere.
- Add 0,125% Trypsin-EDTA mit L15 Medium in Cortex Stücke und inkubieren vorbereitet in 37 Grad für 15 min.
- Transfer-Gewebe-Blöcke in 20 mL DMEM-Medium mit 20% FBS in 50ml Tube, fügen DNase-Stammlösung zu einer Endkonzentration 10ug/mL absaugen Gewebe Lösung nach oben und unten für 20-mal mit dem Feuer aus poliertem Glas Pasteure Pipette, sammeln die einzelnen Zellen Suspension.
- Waschen Sie die Zellsuspension einmal mit DMEM-Medium, resuspendieren Zellen in DMEM mit 10% FBS, count-Zellen unter dem Mikroskop mit einer Zählkammer, Samenzellen zu 5000-10000/cm 2. Pflegen Sie Zellen in einer 37 Grad 5% Inkubator, ändern die Hälfte des Mediums 2 mal pro Woche.
2. Spinalganglien Neuronen Isolation, Kultur und Reinigung
Tag 1 Bereiten Kultur Werkstoff
- Bestreichen Sie die sterilisierten Deckgläschen mit Poly-Lysin, waschen Deckgläser zweimal mit destillieren Wasser und der Luft trocknen, steckte sie in 24-Well-Platten.
- Add 100 &mgr; Neurobasal Medium mit 2% B27 und 2.5S NGF (50 ng / mL), legte Platte in 37 Grad 5% CO 2.
Tag 2 Isolate DRGs aus Embryonen
- Sterilisiert die Abzugshaube in der gleichen Weise wie Gliazellen Kultur.
- Euthanize eine schwangere Ratte (E15) von Überdosierung mit CO 2, sterilisiert Bauch von 70% Ethanol, wurden Embryonen aus der Gebärmutter isoliert und in gekühlten L15 Medium.
- Isolieren Rückenmark mit angeschlossenem Spinalganglien unter Stereomikroskop und Transfer zum 35mm Gerichte mit gekühltem L15 Medium.
- Sammeln Sie einzelne Zellsuspension und waschen einmal mit NBF Medium (Neurobasal Medium mit 2% B27 und 2.5S NGF (50 ng / mL)).
Tag 3 Purify DRG-Neuronen
- 18h-24h nach Neuron Aussaat, fügen Sie eine 1 mM konzentriert FUDR Stammlösung auf das Neuron Kultur bis zu einer Endkonzentration von 20 uM und ein Endvolumen von 200 ul.
- 72h später ersetzen die Hälfte des Mediums mit Neurobasal Medium mit 2% B27 und 2.5S NGF (50ng/mL) ohne FUDR. Danach wechseln das Medium jeden zweiten Tag.
3. Cokultur DRG-Neuronen mit Gliazellen
- Wenn Gliazellen Kultur Konfluenz (ca. 20 Tage nach der Aussaat) erreichten, waren sie bereit für Kokultur mit Neuronen.
- 24 Stunden vor der Zugabe des gereinigten Neuronen wurden Gliazellen mittel-bis Neurobasal Medium mit 2% B27 und 2.5S NGF (50 ng / mL) geändert.
- Gereinigtes Neuronen aus Kultur-Wells wurden gesammelt, wurden einzelne Zellen durch mechanische, die durch Feuer poliert Pasteure Pipette erhalten.
- Nach Auszählung der Zahl, wurden Neuronen bei 500/cm 2 auf konfluenten Gliazellen in Neurobasal Medium mit 2% B27 und 2.5S NGF (50ng/mL) ausgesät.
- Neurons Haftung und Neuritenwachstum auf Gliazellen konnte aufgezeichnet und analysiert werden zu verschiedenen Zeitpunkten durch Bildanalyse-Software und Immunzytochemie mit Zelltyp spezifischen Antikörpern.
4. Repräsentative Ergebnisse
- Gliazelle Kultur: Nach dem Impfen wird Gliazellen konfluieren rund 20 Tage. Unter Phasenkontrast Mikroskopopa, es war leicht zu erkennen, dass verschiedene morphologische Gliazellen Subpopulationen unterschiedliche Wachstumsmuster Unterkonstruktionen gebildet und die GFAP positive Astrozyten einen Anteil von mehr als 90%, wie durch immuocytochemisty Technik (Bild 1, Bild 2) gezeigt.
- DRG-Neuronen Kultur: In unserer Methode, nach 72 Stunden FUDR Behandlung, die Reinheit des DRG-Neuronen wird so hoch wie 99% innerhalb von 6 Tagen, zeigte DRG-Neuronen ihrer einzigartigen Morphologie und mit hoher Dichte Neuritenwachstum (Abbildung 3, Abbildung 4).
- Gliazelle und Neuronen Kokultur: DRG-Neuronen Haftung und Neuritenwachstum aufgetreten leicht auf Gliazellen innerhalb von 4 Stunden nach der Aussaat, sorgfältige Beobachtungen haben gezeigt, dass Neuronen Haftung und Neuritenwachstum von Glia-Zell-Subpopulationen, die spezielle Wachstumsmuster Unterkonstruktionen entstanden beeinflusst, könnte dies leicht identifiziert werden unter Phasenkontrast-Mikroskop und durch Immunzytochemie (Abbildung 5, Abbildung 6).
Abbildung 1. Morphologie der konfluenten Gliazellen. Kortikale Gliazellen auf Polylysin beschichteten Deckglas wurden ausplattiert und kultiviert für 20 Tage, beachten Sie die unterschiedlichen Wachstumsmuster von Gliazellen, Zellen auf der linken Seite in einer Strahlungsleistung Weise angeordnet.
Abbildung 2. Confluent Gliazellen durch sauren Gliafaserproteins (GFAP)-Antikörper markiert. Beachten Sie die abgestrahlte Anordnung von GFAP (rot) positive Zellen auf der rechten Seite.
Abbildung 3. Spinalganglien Neuronen wuchs in vitro ohne FUDR Behandlung. Kontaminierenden Zellen gebildet DRG-Neuronen "Hintergrund.
Abbildung 4. Spinalganglien Neuronen wuchs in vitro nach FUDR Behandlung. Der Hintergrund kontaminierenden Zellen waren vollständig eliminiert.
Abbildung 5. Spinalganglien Neuronen auf Glia-Zellen gezüchtet. Neurons Haftung und Neuritenwachstum wurden auf die abgestrahlte angeordneten Zellen gehemmt und begrenzt auf der rechten Seite Gliazellen.
Abbildung 6. Spinalganglien Neuronen wachsen auf Gliazellen durch Neurofilament Antikörper markiert. Die Neuriten (grün) auf die abgestrahlte angeordnet linken Seite Gliazellen waren gehemmt und begrenzt auf der rechten Seite, waren alle Gliazellen durch GFAP Antikörper (rot) gekennzeichnet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von FMMU neue Erkenntnis Stiftung und teilweise NIH finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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