Summary
في هذا البروتوكول ، وصفت لنا طريقة جديدة لدراسة تأثير عدم التجانس الخلايا الدبقية على النمو مع محوار
Abstract
في الجهاز العصبي المركزي لجميع الثدييات ، المحاوير قطعت بعد اصابة غير قادر على تجديد لأهدافها الأصلية والانتعاش وظيفية سيئة للغاية 1. فشل تجديد محور عصبي هو نتيجة تضافر عوامل عدة من بينها البيئة الخلايا الدبقية معادية ، المثبطة الميلين جزيئات ذات الصلة ، وانخفضت القدرة الذاتية على التجدد الخلايا العصبية 2. النجمية هي الأكثر الغالب نوع من الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي وتلعب دورا هاما في وظائف محوار تحت علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الظروف 3. على النقيض من oligodendrocytes مثلي ، النجمية هي خلية السكان غير متجانسة تتألف من قبل مجموعات سكانية فرعية نجمية مختلفة مع morphologies متنوعة والتعبير الجيني 4. الأهمية الفنية لهذا التباين ، مثل تأثيرها على النمو المحور ، غير معروفة الى حد كبير.
لدراسة الخلايا الدبقية ، وخصوصا وظيفة نجمية عدم التجانس في سلوك الخلايا العصبية ، التي أنشئت لدينا طريقة جديدة من خلال المشاركة في استنبات الخلايا العصبية المنقى الظهرية عالية العقد الجذرية مع الخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها من القشرة الفئران. بواسطة هذه التقنية ، تمكنا من مقارنة مباشرة التصاق الخلايا العصبية والنمو محوار على المجموعات السكانية الفرعية النجمية المختلفة في إطار نفس الشرط.
في هذا التقرير ، أن نعطي للبروتوكول مفصل لهذا الأسلوب لعزل الخلايا النجمية والثقافة ، والعزلة الجذرية الظهرية العقد العصبية وتنقيتها ، وشارك في ثقافة DRG الخلايا العصبية مع الخلايا النجمية. ويمكن أيضا هذا الأسلوب أن تمتد إلى مناطق أخرى من الدماغ لدراسة التفاعل الخلوية أو إقليمية محددة بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.
Protocol
1. الخلية الدبقية الثقافة
يمكن أن يكون مثقف الخلايا الدبقية من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. يظهر في الشكل العملية برمتها العملية.
يوم الثقافة طلاء 1 لوحة وcoverslips
- ميكروسكوب تعقيم جاف الجولة coverslips في الأوتوكلاف.
- لوحة coverslips تعقيمها في تعقيم لوحة الثقافة 24 أيضا.
- معطف coverslips مع يسين بولي واحتضان لمدة 2 ساعة تحت درجة حرارة الجذر.
- لوحات معطف الثقافة جيدا في 6 بنفس طريقة الخطوة 3.
- غسل coverslips و 6 - جيدا لوحة الثقافة مرتين بالماء المقطر والهواء الجاف في غطاء الثقافة.
- إضافة 200 المتوسطة DMEM ميكرولتر (FBS مع 10 ٪) في كل بئر في 24 لوحة وكذلك 2 مل في كل بئر في 6 - جيدا لوحة ووضعها في الحاضنة تحت درجة 37 مع 5 ٪ CO 2
اليوم 2 القشرة عزل وزراعة الخلايا الدبقية
- تعقيم تشريح تدفق إيجابي غطاء محرك السيارة.
- بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
- رش جميع الأسطح مع الايثانول 70 ٪ وانتظر 15 دقيقة قبل الاستخدام.
- تغيير متوترة : تخدير الفئران الوليدة (P2 - P6) من انخفاض حرارة الجسم ، وقطع رأس في قاعدة ماغنوم framen باستخدام مقص التشغيل.
- فتح الجمجمة على طول الدرز السهمي باستخدام مقص القزحية وتقشر الجمجمة.
- إزالة الدماغ الأمامي ووضعها في المتوسط L15 المبردة ، تحت stereomicroscope ونظيفة بعناية غشاء الجافية والحنون مع الأوعية الدموية ، وعزل القشرة ويغسل عدة مرات مع L15 المتوسط.
- قطع القشرة الى قطع صغيرة مع مقص المجهرية.
- إضافة 0.125 ٪ التربسين EDTA - L15 أعدت مع القشرة الى قطع متوسطة واحتضانها في 37 درجة لمدة 15 دقيقة.
- نقل كتل الأنسجة في المتوسط DMEM 20mL FBS مع 20 ٪ في 50mL الأنبوب ، إضافة إلى الأسهم الدناز الحل النهائي 10ug/mL تركيز ، نضح الحل النسيج صعودا وهبوطا لمدة 20 مرات مع الزجاج المصقول النار Pasteure ماصة ، وجمع الخلايا تعليق واحد.
- غسل تعليق الخلية مرة واحدة مع DMEM المتوسطة ، وإعادة تعليق الخلايا في DMEM FBS مع 10 ٪ ، وعدد الخلايا تحت المجهر مع الخلايا عدادة الكريات البذور ، في 5000-10000/cm 2. المحافظة على الخلايا في الحاضنة 37 درجة 5 ٪ ، وتغير من نصف المتوسط 2 مرات في الأسبوع.
2. الجذر الظهري عزل الخلايا العصبية العقد والثقافة وتنقية
اليوم 1 تحضير مادة الثقافة
- معطف coverslips تعقيمها مع بولي يسين coverslips يغسل ، ومرتين مع تقطير المياه والهواء الجاف ، ووضعها في 24 لوحات جيدة.
- إضافة المتوسطة Neurobasal 100μL مع 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل) ، ووضع لوحة في ثاني درجة 37 5 2 ٪.
اليوم 2 عزل DRGs من أجنة
- تعقيم الغطاء التدفق بالطريقة نفسها كثقافة الخلية الدبقية.
- الموت ببطء وفأر حامل (E15) بواسطة جرعة زائدة مع CO 2 ، والبطن تعقيمها بواسطة الايثانول 70 ٪ ، معزولة الأجنة من رحم ووضعها موضع المتوسطة L15 مبردة.
- عزل النخاع الشوكي متصلا مع العقد الجذرية الظهرية تحت stereomicroscope ونقل إلى الأطباق مع 35mm المتوسطة L15 مبردة.
- تعليق واحد جمع خلية ويغسل مرة واحدة مع NBF المتوسط (متوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل)).
اليوم 3 تنقية الخلايا العصبية DRG
- 18H - 24H بعد البذر الخلايا العصبية ، إضافة 1 ملم الأسهم FUDR تتركز حل للثقافة عصبون إلى تركيز النهائي من 20 ميكرون ، والحجم النهائي من 200 ميكرولتر.
- 72H في وقت لاحق ، يستعاض عن نصف المتوسط مع المتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL) دون FUDR. بعد ذلك ، وتغير كل يوم وسيلة أخرى.
3. Coculture الخلايا العصبية مع الخلايا الدبقية DRG
- وعندما وصلت الخلية الدبقية الثقافة التقاء (حوالي 20 يوما بعد البذر) ، وعلى استعداد لcoculture مع الخلايا العصبية.
- قبل 24 ساعة مضيفا ان الخلايا العصبية المنقى ، تم تغيير الخلايا الدبقية المتوسطة والمتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل).
- وقد تم جمع الخلايا العصبية تنقيته من الآبار والثقافة ، والحصول على تعليق واحد الخلايا عن طريق تمرير الميكانيكية من خلال ماصة النار Pasteure المصقول.
- بعد فرز العدد ، كان المصنف في الخلايا العصبية 500/cm 2 على الخلايا الدبقية متكدسة في المتوسط Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL).
- ويمكن تسجيل نمو الخلايا العصبية والتصاق الخلايا الدبقية على neurite وتحليلها في نقاط زمنية مختلفة بواسطة برنامج تحليل الصور وكيمياء سيتولوجية مناعية باستخدام الأجسام المضادة نوع من الخلايا المحددة.
4. ممثل النتائج
- زراعة الخلايا الدبقية : بعد الغرس وسوف تصبح الخلايا الدبقية متموجة حوالي 20 يوما. تحت microsc النقيض من المرحلةمكتب مستشار رئيس الوزراء ، تم التعرف عليه بسهولة أن مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الدبقية المورفولوجية المختلفة شكلت الأساسات نمط النمو والخلايا النجمية GFAP إيجابية شكلت أكثر من 90 ٪ كما هو مبين من خلال تقنية immuocytochemisty (الشكل 1 ، الشكل 2).
- وأظهرت الخلايا العصبية DRG في أسلوب لدينا ، بعد 72 ساعة FUDR العلاج ، ونقاء من الخلايا العصبية DRG سيصل عالية مثل 99 ٪ في غضون 6 أيام ، morphologies فريدة من نوعها والتي ترتفع فيها كثافة نمو neurite (الشكل 3 الشكل 4) : DRG الخلايا العصبية الثقافة.
- الخلية الدبقية والخلايا العصبية coculture : DRG الخلايا العصبية الالتصاق وثمرة neurite حدث بسهولة على الخلايا الدبقية في غضون 4 ساعات بعد الغرس والملاحظات بعناية أظهرت أن تأثرت التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite بواسطة الخلية الدبقية المجموعات السكانية الفرعية الخاصة التي شكلت الأساسات نمط النمو ، يمكن التعرف بسهولة على هذا تحت المجهر النقيض من مرحلة وكيمياء سيتولوجية مناعية (الشكل 5 الشكل 6).
الشكل 1. مورفولوجيا الخلايا الدبقية متموجة. كانت مطلية الخلايا الدبقية القشرية على ساترة المغلفة متعدد الليزين وتربيتها لمدة 20 يوما ، لاحظ نمط النمو مختلفة من الخلايا الدبقية ، الخلايا على الجانب الأيسر رتبت بطريقة المشعة.
الشكل 2. الخلايا الدبقية متموجة صفها الدبقية الضد لييفي الحمضية (GFAP) البروتين. ملاحظة الترتيب يشع من الخلايا (الحمراء) GFAP إيجابي على الجانب الأيمن.
الشكل 3. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر من دون علاج FUDR. الخلايا الملوثة شكلت خلفية DRG الخلايا العصبية ".
الشكل 4. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر بعد العلاج FUDR. تم القضاء على الخلايا الخلفية تلويث تماما.
الشكل 5. العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المزروعة في الخلايا الدبقية ، وقد تحول دون التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite على خلايا تشع رتبت ومحدودة على الخلايا الدبقية الجانب الأيمن.
الشكل 6. وكان العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المتزايدة على الخلايا الدبقية التي المسمى neurofilament الأضداد ، وقد تحول دون وneurite (الأخضر) على الترتيب يشع الخلايا الدبقية الجانب الأيسر ومحدودة على الجانب الأيمن ، وصفت جميع الخلايا الدبقية التي الضد GFAP (الحمراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد صمم هذا البروتوكول التجربة للوصول إلى هدفين لدراسة الخلايا الدبقية ، وتأثير عدم التجانس نجمية خصوصا على التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite. وكان الهدف الأول هو الحفاظ على تجانس نجمية قدر الإمكان ، في هذه التجربة ، مختلطة متموجة ثقافة الخلية الدبقية النجمية أغنت الثقافة الأولية دون أي علاج الكيميائي وانتشار عملية الهضم ، الأمر الذي قد يلحق المزيد من الضرر الخلوي واستجابة لحث اصابة الخلايا النجمية. نقاء النهائي نجمية أكثر من 90 ٪ GFAP إيجابية ، مع الليفية تلوث أقل من 1 ٪ حيث يتم التحقق من قبل FN fibrobasts. كثافة منخفضة في بداية البذر الخلايا التي تخضع لعدة جولات من الانقسام قبل التقاء. تحت المجهر النقيض من المرحلة ، لوحظ عدم تجانس الخلايا الدبقية التي طيدة المختلفة التي شكلتها النجمية المورفولوجية المختلفة. وكان الهدف الثاني للحصول على الخلايا العصبية عالية DRG المنقى وcoculture لهم الخلايا الدبقية لدراسة تأثير عدم التجانس على سلوك الخلايا العصبية. وكانت الخلايا الجذرية العقد في تلويث الظهرية مثل الخلايا الليفية وخلايا شوان يمكن أن تؤثر على ما يبدو أو تغيير في ظروف نمو محوار ثقافة 5 ، 6 ، لتجنب هذا التأثير غير المرغوب فيه ، مثقف الخلايا العصبية في DRG المتوسطة مجانا المصل ويعامل بها لFUDR 72H لقتل جميع أنواع الخلايا الأخرى. بعد هذا العلاج ، يمكن تنقية الخلايا العصبية DRG عالية مثل 99 ٪. كان أكثر فعالية من الأسلوب التقليدي الذي يحتاج إلى علاج الخلايا العصبية الثقافة عدة مرات 7. يمكن أن تكون واحدة التصاق الخلايا العصبية والنمو DRG محوار رصدها وتتبعها بسهولة تحت المجهر النقيض من المرحلة عن طريق تسجيل مرور الوقت والتصوير أسلوب التحليل ، يمكن تحليل تفاعلها مع الخلايا الدبقية في التفاصيل التي كيمياء سيتولوجية مناعية والالكترونية تقنية المجهر.
ولوحظ أنه لا يمكن أن يستمر DRG الخلايا العصبية في المختبر لأكثر من 4 أسابيع ، وبقائهم على قيد الحياة لم يكن علامة على خفض ولكن لم يتمكنوا من الانضمام إلى أي ركيزة لفترة أطول ، فإنها عادة فصل ونشمر.
يمكن الحفاظ على الخلايا العصبية DRG astroglial لوقت طويل (أكثر من 2 شهرا). هذا coculture الطويل بين الخلايا العصبية عالية DRG المنقى والنجمية تجعل عملية تعقب واحدة من الخلايا العصبية والنمو محوار على نوع مختلف من الخلايا النجمية بسهولة أكبر ، فإنه أيضا تجنب تأثير التلوث غير المنضبط من الخلايا الأخرى في العقد الجذرية الظهرية. أثناء عملية ثقافة بأكملها ، يجب أن يتم التعامل معها بعناية جميع الخلايا ، وينبغي دائما كافة الخلايا تكون مغمورة في وسط الثقافة. للحصول على الخلايا العصبية DRG عالية النقاء ، وهذه نقطة حاسمة هي مدة العلاج FUDR ، سوف يزيد بشكل ملحوظ وسط 72H العلاج الخلوي وجدوى العلاج القصير الوقت قد لا تقتل كل الخلايا التلوث. في الحالة المثلى ، يمكننا الحصول على كمية كبيرة من الخلايا العصبية عالية النقاء DRG في حدود 1 في الاسبوع. باستخدام هذا النظام coculture ، وجدنا أنه ، على عكس المعتقدات الشائعة ، غير المتجانسة النجمية والتأثيرات المختلفة على التصاق الخلايا العصبية والنمو محور عصبي ، والخلايا النجمية subpopulation أظهرت تثبيط قوية للالتصاق الخلايا العصبية على حد سواء والنمو محور عصبي. إلى جانب التفاعل بين نجمية والنمو المحور ، ويمكن استخدام هذا الأسلوب في دراسات أخرى على مثل تشكيل المايلين ، ومسارات التنمية المرتبطة التغييرات الجوهرية في الخلايا العصبية محوار قدرات النمو ، والجينات ، وإشارة إلى نمو محور عصبي. ويمكن أن تستخدم أيضا في الفئران والحيوانات الأخرى المركزية مناطق الجهاز العصبي لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة الجديدة FMMU إيجاد الأساس والمعاهد الوطنية للصحة التي تمول جزئيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
