Summary
在这个协议中，我们描述了一个新的方法来研究与轴突生长的神经胶质细胞的异质性的影响
Abstract
在中央的所有哺乳动物的中枢神经系统，切断损伤后的轴突无法再生到原来的目标和功能恢复是非常差的1。轴突再生的失败是几个因素，包括敌对的神经胶质细胞环境，抑制髓鞘相关分子和减少内在的神经元的再生能力2的综合作用的结果。星形胶质细胞是最突出的中枢神经系统的神经胶质细胞类型，并在轴突功能的生理和病理条件3下发挥重要作用。对比同源少突胶质细胞，星形胶质细胞是一个由不同的星形胶质细胞亚群具有不同的形态和基因表达的 4组成的异质细胞群。这种异质性的功能意义，如对轴突的生长影响，在很大程度上是未知的。
为了研究神经胶质细胞，尤其是在星形胶质细胞神经元行为的异质性的功能，我们建立了合作培养高纯度的背根与从大鼠皮层获得的神经胶质细胞神经节神经元的一种新方法。通过这项技术，我们能够直接比较不同的星形胶质细胞亚群在相同条件下神经细胞的粘附和轴突的生长。
在这份报告中，我们给这种方法的星形胶质细胞的分离和文化，背根神经节神经元的分离和提纯，和背根神经节神经元与星形胶质细胞共培养的详细协议。这种方法也可以扩展到其他脑区，研究细胞或地区的特定神经元和神经胶质细胞之间的相互作用。
Protocol
1。胶质细胞培养
来自不同地区的中枢神经系统神经胶质细胞可以培养。整个过程是在过程图所示。
第1天涂层培养板和盖玻片
- 干燥灭菌的玻璃显微镜下一轮盖玻片高压灭菌器。
- 板到灭菌的24孔培养板消毒盖玻片。
- 外套与多聚赖氨酸和根的温度下2小时孵化的盖玻片。
- 大衣6步骤3相同的方式培养板。
- 两次洗净的盖玻片和6孔培养板，用蒸馏水和空气干燥文化引擎盖。
- 在6孔板，每孔在24孔板和2毫升，每孔加200μLDMEM培养基（含10％胎牛血清）和37度下，将它们放入孵化器5 ％的CO 2
第2天的隔离皮层和神经胶质细胞培养
- 消毒正流夹层罩。
- 紫外线灯开启20分钟。
- 喷雾用70％乙醇的所有表面和使用前等待15分钟。
- 改变紧张：由低温麻醉幼鼠（P2 - P6），并在framen使用操作系统剪刀的万能基地斩首。
- 打开头盖骨沿矢状使用虹膜剪和关闭颅骨剥离缝合。
- 删除前脑和他们放进冷冻L15中等，体视显微镜下，仔细，清洁血管硬膜和软膜，隔离皮层和L15的中型洗几次。
- 显微剪刀切成小块的皮质。
- 添加0.125％胰蛋白酶EDTA制备成皮质件，并培育与L15的介质，在37度15分。
- 组织块转移到20ML的DMEM培养基含20％FBS，于50ml试管中，脱氧核糖核酸酶原液加入终浓度为10ug/mL，吸组织解决方案，并与火抛光的玻璃Pasteure吸管的20倍，收集的单细胞悬浮液。
- 洗细胞悬液一次DMEM培养基，重新暂停含10％胎牛血清的DMEM细胞，计数细胞与血球，种子细胞，在显微镜下5000-10000/cm 2 。细胞保持在37度5％的孵化器，改变介质的每周2次的一半。
2。背根神经节神经元的分离，培养和纯化
第1天准备文化的物质
- 外套与多聚赖氨酸，洗盖玻片消毒盖玻片两次提取水和空气干燥，放入24孔板。
- 100μLNeurobasal培养基添加2％B27与2.5S神经生长因子（50毫微克/毫升），放入37度5％的CO 2板。
第2天，从胚胎分离的背根节
- 消毒胶质细胞培养相同的方式流罩。
- 过量的CO 2，由70％乙醇消毒腹部安乐死一个孕鼠（E15），胚胎从子宫中分离到L15的冷冻介质。
- 隔离脊髓背根神经节在体视显微镜和转让下连接与L15的冷冻介质为35mm菜。
- 收集单细胞悬液和用NBF培养基（Neurobasal培养基含2％B27与2.5S神经生长因子（50毫微克/毫升））。
第3天净化DRG神经元
- 18H - 24H，神经元的播种后，添加1毫米的集中FUDR股票解决方案的神经元文化的终浓度为20微米和200μL的最终体积。
- 72小时后，更换Neurobasal含2％B27和2.5S神经生长因子（50ng/mL）的培养基没有FUDR中期的一半。之后，改变培养基隔日。
3。共培养背根神经节神经元与神经胶质细胞
- 当神经胶质细胞培养达到合流（播种后20天左右），他们准备与神经元共培养。
- 24小时前加入纯化的神经元，神经胶质细胞的培养基改变Neurobasal培养基中含有2％B27与2.5S神经生长因子（50毫微克/毫升）。
- 纯净的神经元是从文化的井，单细胞悬浮液获得通过火抛光Pasteure吸管机械传递。
- 计数后，接种于融合的神经胶质细胞神经元在Neurobasal培养基含2％B27与2.5S神经生长因子（50ng/mL）500/cm 2 。
- 神经细胞粘附和神经胶质细胞神经突起的生长，可以在不同时间点记录和图像分析软件和使用的细胞类型特异性抗体的免疫细胞化学分析。
4。代表性的成果
- 胶质细胞培养：播种后，胶质细胞将成为融合为20天左右。在第一阶段对比显微OPE，这是很容易识别，不同形态的神经胶质细胞亚群形成了不同的增长模式的子结构和GFAP阳性星形胶质细胞占90％以上immuocytochemisty技术（图1，图2）所示。
- DRG神经元的文化 ：在我们的方法，FUDR治疗72小时后，DRG神经元的纯度将达到6天之内高达99％高，DRG神经元表现出其独特的形态和高密度突起的生长（图3，图4）。
- 胶质细胞和神经元共培养 DRG细胞的粘附和轴突生长发生在播种后4小时内的神经胶质细胞容易，仔细观察发现，神经细胞的粘附和突起的生长是由神经胶质细胞亚群，形成了特殊的经济增长模式的子结构的影响，这可以很容易地确定相差显微镜下，免疫细胞化学法（图5，图6）。
图1。融合的神经胶质细胞的形态。皮质神经胶质细胞，接种于多聚赖氨酸涂布盖玻片培养20天，请注意不同的经济增长模式的神经胶质细胞，细胞辐射的方式排列在左侧。
图2。聚合胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体标记注意GFAP（红色），在右侧的阳性细胞的辐射安排。
图3。背根神经节神经元生长在体外无FUDR治疗 。污染的细胞形成背根神经节神经元“的背景。
图4。背根神经节神经元增长FUDR治疗后在体外 。背景污染的细胞已经完全消除。
图5。背根神经节神经胶质细胞生长的神经元的神经细胞粘附和突起的生长受到抑制，并在右侧的神经胶质细胞对辐射的细胞排列有限。
图6。背根神经节神经元的神经丝蛋白抗体标记的神经胶质细胞生长 。突起（绿色）是抑制辐射安排左侧的神经胶质细胞，并在右侧的限制，所有的神经胶质细胞标记GFAP抗体（红色）。
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Discussion
这个实验协议的目的是要达到两个目标，以研究神经胶质细胞，神经细胞粘附和突起的生长，特别是星形胶质细胞的异质性的影响。第一个目标是保持星形胶质细胞的异质性，尽可能在本实验中，胶质细胞的融合文化，丰富的星形胶质细胞混合小学文化，无任何化学处理和消化的传播，这可能会进一步破坏细胞，并诱导星形胶质细胞的损伤反应。最后的星形胶质细胞纯度为90％以上，GFAP阳性污染成纤维细胞，不到1％，由fibrobasts FN核实。开始时所作的细胞的接种密度低，经过几轮司前汇合。相差显微镜下观察，神经胶质细胞的异质性是由不同形态的星形胶质细胞形成的不同的子结构。第二个目标是获得高纯度的DRG神经元共培养他们与神经胶质细胞研究的神经行为的异质性影响力。在背根神经节，如成纤维细胞和雪旺氏细胞污染细胞可以明显影响或改变轴突的生长在培养条件下，6，为了避免这种不必要的影响，DRG神经元在无血清培养基培养72小时通过FUDR治疗，杀死所有其他类型的细胞。这种治疗方法后，DRG神经元可纯化高达99％。这是超过传统的方法，该方法需要治疗的神经元文化的几次 7更有效率。单背根神经节神经细胞粘附和轴突的生长，可以很容易地监视和跟踪时间的推移录制和图像分析方法相显微镜下，他们与神经胶质细胞之间的相互作用可以通过免疫细胞化学和电子显微镜技术详细分析。
有人指出，DRG神经元不能在体外维持4周以上，他们的生存已经没有减少的迹象，但他们不能坚持不再基板，他们通常会分离，并卷起。
DRG神经元，就可以维持很长一段时间（超过2个月）星形胶质细胞。长期共培养高纯度的DRG神经元和星形胶质细胞之间的这种长期跟踪单个神经元和轴突的生长，对不同类型的星形胶质细胞更容易，也避免在背根神经节的其他污染细胞不受控制的影响。在整个文化的过程中，应小心处理所有的细胞，并应始终在所有的细胞培养液中浸泡。要获得高纯度的DRG神经元，一个关键点是FUDR治疗的持续时间，超过72小时的治疗将大大损害细胞活力和治疗时间短，可能无法杀死所有的污染细胞。在最佳条件下，我们可以1星期内获得大量高纯度的DRG神经元。使用此共培养系统，我们发现，在普遍持有的信念相反，异构的星形胶质细胞对神经细胞的粘附和轴突的生长有不同的影响，以及亚群的星形胶质细胞神经细胞粘附和轴突的生长表现出较强的抑制。除了星形胶质细胞和轴突的生长之间的相互作用，这种方法可用于其他研究髓鞘的形成，如在神经元发育的变化，内在的轴突的生长能力，基因和信号通路与轴突的生长。它也可以用在老鼠和其他动物的中枢神经系统的区域研究神经元和神经胶质细胞之间的相互作用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是FMMU新发现的基础和部分美国国立卫生研究院拨款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
