Summary
בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון עם
Abstract
במערכת העצבים המרכזית של כל היונקים, אקסונים ניתק לאחר פציעה אינם מסוגלים להתחדש ליעדים המקוריים שלהם התאוששות תפקודית ירודה מאוד 1. הכישלון של התחדשות האקסון הוא תוצאה משולבת של מספר גורמים, כולל סביבה עוינת תא גלייה, מעכבות מולקולות הקשורות המיאלין וירידה יכולת ההתחדשות הפנימית נוירון 2. האסטרוציטים הם סוג השולט ביותר תא גליה במערכת העצבים המרכזית לשחק תפקיד חשוב בפונקציות האקסון תחת הפיזיולוגיה והפתולוגיה התנאים 3. בניגוד הומולוגיים oligodendrocytes, האסטרוציטים הם אוכלוסייה הטרוגנית תא שהלחין subpopulations astrocyte מורפולוגיות שונות עם מגוון ביטוי גנים 4. משמעות תפקודית של ההטרוגניות הזאת, כמו השפעות על צמיחה האקסון, אינו ידוע ברובו.
כדי לחקור את תא גלייה, בעיקר פונקציה של ההטרוגניות astrocyte בהתנהגות נוירון, הקמנו שיטה חדשה על ידי שיתוף culturing גבוה מטוהרים הגב הגרעינים נוירונים ותאי גלייה עם השורש המתקבל בקליפת חולדה. על ידי טכניקה זו, הצלחנו להשוות ישירות הידבקות נוירון וצמיחה האקסון על subpopulations האסטרוציטים שונים בתנאי אותו.
בדו"ח זה, אנו נותנים את פרוטוקול מפורט של שיטה זו של בידוד האסטרוציטים ותרבות, השורש הגבי הגרעינים נוירונים בידוד וטיהור, ואת שיתוף התרבות של נוירונים עם DRG האסטרוציטים. שיטה זו יכולה גם להיות מורחבת לאזורים אחרים במוח ללמוד אינטראקציה ספציפית הסלולר או אזורית בין נוירונים ותאי גלייה.
Protocol
1. תא גליה תרבות
ותאי גלייה יכול להיות מתורבת מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית. התהליך כולו מוצג בתרשים התהליך.
1 יום ציפוי תרבות צלחת coverslips
- מיקרוסקופ יבש מעוקרים עגול זכוכית coverslips ב החיטוי.
- פלייט coverslips מעוקר לצלחת 24 לעקר גם תרבות.
- המעיל coverslips עם פולי-ליזין דגירה למשך 2 שעות תחת טמפרטורה השורש.
- 6 גם סמל תרבות צלחות באותה דרך כמו בשלב 3.
- שטפו את coverslips ו 6 גם צלחת תרבות פעמיים עם מים מזוקקים ואוויר יבש ברדס תרבות.
- הוספת 200 μL בינוני DMEM (עם FBS 10%) היטב כל צלחת 24 היטב 2 מ"ל היטב כל צלחת 6-היטב ולשים אותם לתוך החממה תחת תואר 37 עם 5% CO 2
2 יום קליפת בידוד והתרבות תא גלייה
- לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי.
- הפעל אור UV במשך 20 דקות.
- רסס את כל המשטחים עם אתנול 70% ולחכות 15 דקות לפני השימוש.
- השינוי במתח: גורי חולדה הרדימי (P2-P6) על ידי היפותרמיה, ועל לערוף בבסיס מגנום framen באמצעות מספריים ההפעלה.
- פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות מספריים איריס לקלף את הגולגולת.
- הסר את המוח הקדמי והכניס אותם לתוך מדיום L15 צונן, תחת stereomicroscope, בזהירות לנקות את קרום הדורה ופיאה עם כלי דם, לבודד את קליפת לשטוף מספר פעמים עם המדיום L15.
- חותכים את הקליפה לחתיכות קטנות עם מספריים microsurgery.
- הוסף 0.125% טריפסין-EDTA מוכן עם המדיום L15 לחתיכות קורטקס דגירה של 37 מעלות במשך 15 דקות.
- העברת גושי רקמה לתוך מדיום DMEM 20mL עם FBS של 20% שפופרת 50 מ"ל, להוסיף פתרון DNase המניות 10ug/mL הריכוז הסופי, לשאוב את הפתרון הרקמה הלוך ושוב במשך 20 פעמים עם זכוכית מלוטשת אש Pasteure פיפטה, לאסוף את ההשעיה תאים בודדים.
- שטפו את ההשעיה תא פעם אחת עם DMEM בינוני, מחדש תאים להשעות DMEM עם 10% FBS, לספור תאים תחת מיקרוסקופ עם תאים hemocytometer הזרע בבית 5000-10000/cm 2. שמור על תאים 37 מעלות באינקובטור 5%, שינוי מחצית 2 פעמים בינוני בשבוע.
2. רוט הגבי הגרעינים בידוד נוירונים, התרבות טיהור
יום 1 הכינו חומר תרבות
- המעיל coverslips מעוקר עם פולי-ליזין, coverslips לשטוף פעמיים עם לזקק מים ואוויר יבש, לשים אותם לתוך 24 גם הצלחות.
- הוסף בינוני Neurobasal 100μL עם 2% ו - B27 2.5S NGF (50 נ"ג / מ"ל), לשים צלחת לתוך CO 37 מעלות 5% 2.
יום 2 בודד DRGs מעוברים
- לעקר את מכסה המנוע לזרום באותו אופן כמו תרבית תאים גליה.
- להרדים חולדה בהריון (E15) על ידי מנת יתר עם 2 CO, הבטן עיקור על ידי אתנול 70%, עוברים מן הרחם בודדו והכניסו בינוני L15 צונן.
- בודד מיתרי השדרה עם הגרעינים מחובר השורש הגבי תחת stereomicroscope ולהעביר מנות 35mm עם המדיום L15 צונן.
- איסוף ההשעיה תא בודד ולשטוף פעם עם NBF בינוני (מדיום Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50 ng / mL)).
יום 3 נוירונים DRG לטהר
- 18h-24h לאחר זריעת נוירון, להוסיף 1 FUDR מרוכז mM פתרון מניות לתרבות נוירון לריכוז סופי של 20 מיקרומטר ו נפח סופי של 200 μL.
- 72h מאוחר יותר, להחליף חצי בינוני עם בינוני Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50ng/mL) ללא FUDR. לאחר מכן, שנה את בינונית בכל יום אחר.
3. נוירונים DRG Coculture עם ותאי גלייה
- כאשר תרבית תאים גליה הגיע המפגש (בסביבות 20 ימים לאחר זריעה), הם היו מוכנים coculture עם הנוירונים.
- 24 שעות לפני הוספת נוירונים מטוהרים, גליה בינוני התאים שונו עד בינוני Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50 נ"ג / מ"ל).
- נוירונים מטוהרים נאספו מבארות תרבות, יחיד ההשעיה תאים התקבלו על ידי העברת מכני באמצעות פיפטה Pasteure מלוטש אש.
- לאחר ספירת, נוירונים היו זורעים בבית 500/cm 2 על ותאי גלייה ומחוברות Neurobasal במדיום המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50ng/mL).
- נוירונים הידבקות וצמיחה neurite על ותאי גלייה יכול להיות נרשמו ונותחו בנקודות זמן שונות על ידי תוכנת ניתוח תמונת immunocytochemistry סוג התא באמצעות נוגדנים ספציפיים.
4. נציג תוצאות
- תרבית תאים גליה: אחרי זריעה, ותאי גלייה יהפוך ומחוברות סביב 20 ימים. תחת microsc בניגוד שלבאופ, זה היה לזהות בקלות כי אחרת subpopulations מורפולוגית תא גלייה נוצר דפוס שונים substructures הצמיחה האסטרוציטים חיובי GFAP היוו יותר מ -90% כפי שמוצג על ידי טכניקה immuocytochemisty (איור 1, איור 2).
- תרבות DRG נוירונים: בשיטה שלנו, לאחר טיפול 72 שעות FUDR, את הטוהר של נוירונים DRG יגיע גבוה ככל 99% תוך 6 ימים, הנוירונים DRG הראה מורפולוגיות הייחודיים שלהם עם צמיחה neurite צפיפות גבוהה (איור 3, איור 4).
- Coculture גליה תא עצב: הידבקות נוירונים DRG ו תולדה neurite התרחש בקלות על ותאי גלייה בתוך 4 שעות לאחר זריעה, תצפיות זהיר הראה כי הידבקות נוירון וצמיחה neurite הושפעו subpopulations תא גלייה שהיוו מיוחד דפוס substructures צמיחה, זה יכול להיות מזוהה בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת השלב ועל ידי immunocytochemistry (איור 5, איור 6).
באיור 1. מורפולוגיה של תאים גליה ומחוברות. ותאי גלייה קליפתיים היו מצופה על coverslip מצופה polylysine ותרבותי עבור 20 ימים, שים לב דפוס צמיחה שונים של תאים גליה, תאים בצד שמאל מסודרים בצורה הקרין.
איור 2. ותאי גלייה ומחוברות שכותרתו ידי גליה נוגדן fibrillary חומצי חלבון (GFAP). הערה ההסדר קרנה של GFAP (אדום) תאים חיובי בצד ימין.
איור 3. הגב הגרעינים נוירונים שורש צמח חוץ גופית ללא טיפול FUDR. התאים זיהום נוצר DRG רקע "נוירונים.
איור 4. הגב הגרעינים נוירונים שורש צמח במבחנה לאחר הטיפול FUDR. התאים רקע זיהום חוסלה לחלוטין.
איור 5. הגב בגרעיני הבסיס נוירונים ותאי גלייה גדל על. נוירונים הידבקות וצמיחה neurite היו עצורים על תאים מסודרים הקרין ומוגבל על תאים בצד ימין גליה.
איור 6. הגב בגרעיני הבסיס נוירונים ותאי גלייה הגוברת על ידי נוגדן הנקרא neurofilament. Neurite (ירוק) היו עצורים על תאים מסודרים הקרין הצד השמאלי גליה ומוגבלת בצד ימין, כל התאים גליה תויגו על ידי נוגדן GFAP (אדום).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הניסוי תוכנן להגיע שתי מטרות ללמוד ותאי גלייה, השפעה ההטרוגניות של astrocyte במיוחד על הידבקות נוירון וצמיחה neurite. המטרה הראשונה היתה לשמור על ההטרוגניות astrocyte ככל האפשר, בניסוי הזה, ומחוברות גליה תרבית תאים האסטרוציטים מועשר היה מעורב תרבות ראשוני ללא כל טיפול כימי התפשטות לעיכול, העלולים לגרום נזק נוסף התא ולגרום בתגובה לפציעה של האסטרוציטים. טוהר astrocyte הסופית היא יותר מ 90% GFAP חיובית, עם fibroblasts זיהום פחות מ -1% כפי אומת על ידי fibrobasts FN. צפיפות זריעה נמוכה תאים עשה בתחילת לעבור כמה סיבובים של חלוקת לפני המפגש. תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, ההטרוגניות התא גליה נצפתה על ידי מסד שונים שיצרו האסטרוציטים מורפולוגיים שונים. המטרה השנייה הייתה להגיע גבוה נוירונים DRG מטוהרים coculture אותם עם ותאי גלייה ללמוד את השפעת ההטרוגניות על התנהגות הנוירונים. תאים לזהם בגרעיני הבסיס הגבי כגון fibroblasts ותאי שוואן יכול לכאורה להשפיע או לשנות את צמיחת האקסון בתנאים תרבות 5, 6, כדי למנוע השפעה לא רצויה זו, היו DRG נוירונים בתרבית בינוני חופשי בסרום מטופלים על ידי FUDR עבור 72h להרוג את כל התא סוגים אחרים. לאחר הטיפול הזה, הנוירונים DRG יכול להיות מטוהרים גבוה ככל 99%. זה היה יעיל יותר מאשר השיטה המסורתית אשר צריך לטפל בתרבות נוירונים מספר פעמים 7. סינגל הידבקות DRG נוירון וצמיחה האקסון יכול להיות קל לפקח ולעקוב אחריו תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד ידי זמן לשגות הקלטה וניתוח שיטת הדמיה, האינטראקציה שלהם עם ותאי גלייה יכול להיות מנותח על ידי פרטים immunocytochemistry וטכניקה מיקרוסקופ אלקטרוני.
צוין כי נוירונים DRG לא יכול להישמר במבחנה במשך יותר מ 4 שבועות, ההישרדות שלהם היה שום סימן של ירידה אבל הם לא יכלו לדבוק המצע יותר, בדרך כלל הם היו לנתק ומגלגלים.
נוירונים DRG יכול להישמר על תאים astroglial במשך זמן רב (יותר מ 2 חודשים). זה coculture לטווח ארוך גבוהה בין הנוירונים DRG ו האסטרוציטים מטוהרים להפוך את מעקב של נוירונים בודדים צמיחה האקסון על סוג אחר של האסטרוציטים בקלות רבה יותר, אלא גם למנוע את השפעת זיהום בלתי מבוקרת של תאים אחרים בגרעיני השורש הגבי. במהלך תהליך תרבות שלמה, כל התאים יש לטפל בזהירות את כל התאים תמיד צריך להיות שקוע בינוני תרבות. כדי להגיע גבוה DRG נוירונים טוהר, נקודה קריטית היא משך הטיפול FUDR, יותר מ 72h הטיפול באופן משמעותי פשרה הכדאיות הסלולר וטיפול זמן קצר לא יכול להרוג את כל התאים זיהום. במצב האופטימלי, אנחנו יכולים להשיג כמות גדולה של נוירונים DRG גבוהה טוהר בתוך שבוע 1. באמצעות מערכת זו coculture, מצאנו כי, בניגוד אמונות, האסטרוציטים הטרוגנית היו השפעות שונות על הידבקות נוירונים וצמיחה האקסון, ו האסטרוציטים subpopulation הראו עיכוב חזק הדבקה הן נוירון וצמיחה האקסון. מלבד האינטראקציה בין astrocyte וצמיחה האקסון, בשיטה זו ניתן להשתמש על מחקרים אחרים, כגון היווצרות המיאלין, שינויים בהתפתחות העצבית יכולת הצמיחה הפנימית האקסון, גנים אות מסלולים הקשורים לצמיחה האקסון. זה יכול לשמש גם בעכברים ואזורים מרכזיים בעלי חיים אחרים במערכת העצבים לחקור את האינטראקציה בין נוירונים ותאי גלייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי FMMU חדש למציאת הקרן באופן חלקי במימון NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
