Summary
I detta protokoll beskrivs vi en ny metod för att studera inverkan av gliacellsmarkörer heterogenitet på axon tillväxt med en
Abstract
I det centrala nervsystemet hos alla däggdjur, avhuggna axoner efter skada inte kan förnya sina ursprungliga mål och funktionell återhämtning är mycket dålig 1. Felet av Axon förnyelse är en kombinerad resultatet av flera faktorer, inklusive fientliga gliacellsmarkörer miljö, hämmande myelin relaterade molekyler och minskade inneboende neuron regenerativ kapacitet 2. Astrocyterna är de mest dominerande gliaceller celltyp i centrala nervsystemet och spelar en viktig roll i axonet uppdrag enligt fysiologi och patologi villkor 3. Kontrast till den homologa oligodendrocyter, astrocyter är en heterogen cellpopulation består av olika astrocyternas subpopulationer med olika morfologier och genuttryck 4. Den funktionella betydelsen av denna heterogenitet, till exempel deras påverkan på Axon tillväxten är i stort sett okänd.
För att studera gliacellsmarkörer, speciellt funktion astrocyternas heterogenitet i neuron beteende har vi etablerat en ny metod genom samtidig odling renat hög rygg nervceller rotganglier med gliaceller från råttan cortex. Genom denna teknik kunde vi direkt jämföra neuron vidhäftning och axon tillväxt på olika astrocyter delpopulationer på samma villkor.
I denna rapport ger vi den detaljerade protokoll av denna metod för astrocyter isolering och kultur, dorsala nervceller ganglier isolering och rening, samt co-kultur DRG nervceller med astrocyter. Denna metod skulle även kunna utvidgas till andra delar av hjärnan för att studera cellulära eller regionala specifika interaktionen mellan nervceller och gliaceller.
Protocol
1. Glia Cell Culture
Gliaceller kan odlas från olika regioner i centrala nervsystemet. Hela processen visas i processen figur.
Dag 1 Beläggning kultur plattan och täckglas
- Torr steriliserade glas mikroskop runt täckglas i en autoklav.
- Tavla de steriliserade täckglas i steriliserade 24-bra kultur plattan.
- Täck täckglas med poly-lysin och inkubera i 2 timmar under roten temperatur.
- Coat 6-väl odlingsplattor på samma sätt som i steg 3.
- Tvätta täckglas och 6-samt kultur plattan två gånger med destillerat vatten och lufttorka i kultur huva.
- Tillsätt 200 mikroliter DMEM medium (med 10% FBS) i varje brunn i 24-brunnar och 2 ml i varje brunn i 6-brunnar och sätta dem i kuvös i 37 grader med 5% CO 2
Dag 2 Isolera cortex och gliaceller cellodling
- Sterilisera det positiva huven flödet dissekering.
- Slå på UV-ljus i 20 min.
- Spraya alla ytor med 70% etanol och vänta 15 min före användning.
- förändring spänd: Bedöva råttungar (P2-P6) av hypotermi, och halshugga vid basen av framen magnum med operativsystem sax.
- Öppna kraniet längs sagittala suturen med en iris sax och dra av skallen.
- Ta bort framhjärnan och sätta dem i kylt L15 medium, i stereomikroskop, rengör försiktigt dura och Pia membran med blodkärl, isolera cortex och tvätta flera gånger med L15 medium.
- Skär cortex i små bitar med mikrokirurgi sax.
- Lägg till 0,125% trypsin-EDTA beredd med L15 medium till cortex bitar och inkubera i 37 grader i 15 min.
- Överför vävnad block till 20ml DMEM medium med 20% FBS i 50mL röret, lägg DNas stamlösningen till slutlig koncentration 10ug/mL, aspirera vävnaden lösningen upp och ner för 20 gånger med eld polerat glas Pasteure pipett samla enstaka celler suspension.
- Tvätta cellsuspension en tid med DMEM medium, återsuspendera celler i DMEM med 10% FBS, räkna celler i mikroskop med en hemocytometer, utsäde celler vid 5000-10000/cm 2. Upprätthålla celler i ett 37 graders 5% inkubator, ändra hälften av de medelstora 2 gånger per vecka.
2. Dorsalrotsganglier Nervceller Isolering, kultur och Purification
Dag 1 Förbered Kultur Material
- Täck steriliserade täckglas med poly-lysin, tvätta täckglas två gånger med destillera vatten och lufttorka, lägg dem i 24-brunnars plattor.
- Lägg 100μL Neurobasal medium med 2% B27 och 2.5S NGF (50 ng / ml), lägg plattan i 37 graders 5% CO 2.
Dag 2 Isolera DRG från embryon
- Steriliseras flödet huven på samma sätt som gliacellsmarkörer kultur.
- Euthanize en dräktig råtta (E15) genom överdos med CO 2, steriliserad buken med 70% etanol, var embryon isolerade från livmodern och tas i kylt L15 medium.
- Isolera ryggmärg med anslutna dorsalrotsganglier i stereomikroskop och transfer till 35mm rätter med kyld L15 medium.
- Samla enda cellsuspension och tvätta en gång med NBF medium (Neurobasal medium som innehåller 2% B27 och 2.5S NGF (50 ng / ml)).
Dag 3 Rena DRG nervceller
- 18h-24h efter neuron sådd, lägg en 1 mm koncentrerad lösning FUDR lager till neuron kulturen till en slutlig koncentration av 20 mikroM och en slutlig volym på 200 mikroliter.
- 72h senare, ersätta hälften mediet med Neurobasal medium som innehåller 2% B27 och 2.5S NGF (50ng/mL) utan FUDR. Efter det, ändra på medellång varannan dag.
3. Coculture DRG nervceller med gliaceller
- När gliaceller cellkultur nått sammanflödet (cirka 20 dagar efter sådd) var de redo för coculture med nervceller.
- 24 timmar innan du lägger den renade nervceller, var gliaceller medelstora ändrats till Neurobasal medium som innehåller 2% B27 och 2.5S NGF (50 ng / ml).
- Renat nervceller samlades in från kultur brunnar var enskilda celler erhållna suspensionen på mekanisk passerar Fire Polished Pasteure pipett.
- Efter att ha räknat antalet, var nervceller seedade på 500/cm 2 på konfluenta gliaceller i Neurobasal medium som innehåller 2% B27 och 2.5S NGF (50ng/mL).
- Nervceller vidhäftning och neurite tillväxt på gliaceller kan registreras och analyseras vid olika tidpunkter genom bildanalys mjukvara och immuncytokemi med celltyp specifika antikroppar.
4. Representativa resultat
- Gliaceller cellodling: Efter sådd kommer gliaceller bli konfluenta omkring 20 dagar. Enligt faskontrast microscopa, det var lätt att identifiera att olika morfologiska gliacellsmarkörer subpopulationer bildas olika delstrukturer tillväxtmönster och GFAP positiva astrocyter svarade för mer än 90% vilket visas av immuocytochemisty teknik (Figur 1, Figur 2).
- DRG nervceller kultur: I vår metod, efter 72 timmar FUDR behandling kommer renheten i DRG nervceller vara så hög som 99% inom 6 dagar, visade DRG nervceller sina unika morfologier och med hög densitet neurite tillväxt (Figur 3, Figur 4).
- Gliacellsmarkörer och nervceller coculture: DRG nervceller vidhäftning och neurite utväxt inträffade lätt på gliaceller inom 4 timmar efter sådd visade noggranna observationer att neuron vidhäftning och neurite tillväxt påverkades av gliacellsmarkörer delpopulationer som bildade speciella underkonstruktioner tillväxtmönster, kan detta vara lätt att identifiera i faskontrastmikroskop och genom immuncytokemi (Figur 5, Figur 6).
Figur 1. Morfologi sammanhängande gliaceller. Var kortikala gliaceller pläterade på polylysine bestruket täckglas och odlade i 20 dagar, notera de olika tillväxtmönster av gliaceller, celler på vänster sida arrangerade i en strålade sätt.
Figur 2. Sammanflytande gliaceller märkas av gliaceller fibrillära sura protein (GFAP) antikroppar. Observera utstrålade arrangemang av GFAP (röda) positiva celler på höger sida.
Figur 3. Dorsalrotsganglier nervceller växte in vitro utan FUDR behandling. Förorenar celler bildas DRG neuron "bakgrund.
Figur 4. Dorsalrotsganglier nervceller växte in vitro efter FUDR behandling. Bakgrunden förorenar cellerna hade eliminerats helt.
Figur 5. Dorsalrotsganglier nervceller som odlas på gliaceller. Nervceller vidhäftning och neurite tillväxten hämmades på arrangerade utstrålade celler och begränsad på höger sida gliaceller.
Figur 6. Dorsalrotsganglier nervceller växer på gliaceller märkas av neurofilament antikropp. Den neurite (grön) hämmades på arrangerade utstrålade vänster gliaceller och begränsad på höger sida var alla gliaceller märkas av GFAP antikropp (röd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta experiment protokoll var utformad för att nå två mål för att studera gliaceller, speciellt astrocyternas heterogenitet påverkan på neuron vidhäftning och neurite tillväxt. Det första målet var att upprätthålla astrocyternas heterogenitet så mycket som möjligt, i detta experiment var konfluenta gliacellsmarkörer kultur berikat astrocyter blandade primära kulturen utan kemisk behandling och rötning spridning, vilket ytterligare kan skada cellen och orsaka skador svar astrocyter. Den slutliga astrocyternas renhet är mer än 90% GFAP positiv, med föroreningar fibroblaster mindre än 1% vilket kan verifieras med fibrobasts FN. Den låga seedning densitet vid början gjorde celler genomgå flera omgångar av division innan sammanflöde. Enligt faskontrastmikroskop var gliacellsmarkörer heterogenitet observeras av olika underkonstruktionen bestående av olika morfologiska astrocyter. Det andra målet var att få hög renas DRG nervceller och coculture dem med gliaceller att studera heterogenitet påverkan på neuron beteende. Kontaminerande celler i dorsalrotsganglier såsom fibroblaster och Schwann celler uppenbarligen kan påverka eller ändra axonet tillväxt i odlingsbetingelser 5, 6, för att undvika denna oönskade inflytande, var DRG nervceller odlade i serum fritt medium och behandlas av FUDR för 72h att döda alla andra celltyper. Efter denna behandling kan DRG nervceller renas så hög som 99%. Det var effektivare än traditionella metoden som måste behandla nervceller kultur flera gånger 7. Enstaka DRG neuron vidhäftning och axon tillväxt lätt skulle kunna övervakas och spåras i faskontrastmikroskop av tid förfaller inspelning och bildanalys metoden kan deras samspel med gliaceller kan analyseras i detalj genom immuncytokemi och elektroniska mikroskop teknik.
Det antecknades att DRG nervceller inte kunde upprätthållas in vitro vid mer än 4 veckor, hade sin överlevnad inga tecken på minskning men de kunde inte hålla sig till underlaget längre, brukar de skulle bort och rulla ihop.
DRG nervceller kunde bibehållas på astroglial celler under lång tid (mer än 2 månader). Detta långsiktiga coculture mellan högt renade DRG nervceller och astrocyter gör spårning av enskilda nervceller och axon tillväxt på olika typer av astrocyter lättare, undvika det också okontrollerad påverkan från andra föroreningar celler i dorsalrotsganglier. Under hela kulturen processen bör alla celler skall hanteras varsamt och alla celler bör alltid vara nedsänkta i odlingsmedium. Att få hög nervceller renhet DRG, är en kritisk punkt längd FUDR behandling, kommer mer än 72h behandling kompromiss betydligt cellulära livskraft och kort tid behandling får inte döda alla föroreningar celler. I optimalt skick, kan vi få stora mängder av hög nervceller renhet DRG inom 1 vecka. Med hjälp av detta coculture system, fann vi att, i motsats till gängse uppfattningar, hade heterogena astrocyter olika influenser i neuron vidhäftning och axon tillväxt, och subpopulation astrocyter visade stark hämning både neuron vidhäftning och Axon tillväxt. Förutom samspelet mellan astrocyternas och axonet tillväxt, kan denna metod användas i andra studier som myelin bildas, vägar nervsystemets utveckling förändringar i inneboende axonet tillväxtkapacitet, gener och signal relaterade till Axon tillväxt. Den kan också användas i möss och andra djur "centrala nervsystemet regionerna för att studera interaktionen mellan nervceller och gliaceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av FMMU nya finna grunden och delvis NIH finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
