Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصوير ثلاثي الأبعاد ميكرون النطاق للتركيز الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية التي تدور الإلكترونات المجهري الرنين.
Abstract
يصف هذا البروتوكول الرنين الالكتروني المغناطيسي (ESR) الصغيرة التصوير طريقة لرسم خرائط ثلاثية الابعاد لمستويات الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية مع ميكرون على نطاق القرار 1. الأوكسجين هي واحدة من الجزيئات الأكثر أهمية في دورة الحياة. وهو بمثابة محطة المتقبلة الإلكترون الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا ، ويستخدم في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. قياسات الأكسجين هامة لدراسة وظائف الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي ، مما يشير الممرات ، وآثار مختلف المحفزات ، نفاذية الغشاء ، وتمايز المرض. استهلاك الأوكسجين وبالتالي علامة بالمعلومات الأيض الخلوي ، والتي تنطبق على نطاق واسع لمختلف النظم البيولوجية من الميتوكوندريا إلى خلايا للكائنات كلها. نظرا لأهميتها ، وقد وضعت العديد من الأساليب لقياس الأوكسجين في الأنظمة الحية. وتستند المحاولات الجارية لتوفير مستوى عال من الدقة التصوير الأكسجين بشكل رئيسي على مضان البصرية وأساليب تفسفر التي تفشل في تقديم نتائج مرضية كما أنها توظف تحقيقات مع ارتفاع السمية الصورة وحساسية منخفضة الأوكسجين. ومن المعروف ESR ، والذي يقيس إشارة من تحقيقات ممغطس الخارجية في العينة ، لتوفير قياسات دقيقة للغاية من تركيز الأوكسجين. في حالة نموذجية ، والقياسات ESR خريطة توسيع المسبار lineshape و / أو الاسترخاء في الوقت تقصير التي ترتبط مباشرة إلى تركيز الأوكسجين المحلية. (الأوكسجين ممغطس ، وبالتالي ، عندما يصطدم مع التحقيق ممغطس الخارجية ، فإنه ضيق أوقات الاسترخاء والخمسين.) تقليديا ، يتم تنفيذ هذا النوع من التجارب كان خارجا مع القرار منخفضة ، ملليمتر النطاق ESR للتصوير الحيوانات الصغيرة. هنا نبين كيف يمكن أيضا أن يكون التصوير ESR التي نفذت في الحجم ميكرون لفحص عينات حية صغيرة. ESR الدقيقة التصوير منهجية جديدة نسبيا ، والتي تمكن من الحصول على اشارات ESR مكانيا حل مع قرار يقترب 1 ميكرون في درجة حرارة الغرفة 2. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو بروتوكول لاظهار كيف ان هذه الطريقة الجديدة ، جنبا إلى جنب مع مجسات حساسة للأكسجين المطورة حديثا ، يمكن تطبيقها على رسم خرائط لمستويات الأكسجين في عينات حية صغيرة. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، سيكون أيضا ينطبق بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، والقدرة التي تجد وسائل أخرى من الصعب جدا تحقيقه.
Protocol
1. نظرة عامة على ESR الصغرى ، التصوير
أولا ، نحن نقدم شرحا موجزا ESR ، ESR المجهري ، ومختلف مكونات نظامنا ، ومن ثم فإننا سوف تصف تجارب التصوير الفعلي.
الإلكترون تدور الرنين هي تقنية التحليل الطيفي الذي يمتص الإشعاع الكهرومغناطيسي على تردد محدد من جزيئات الإلكترون يدور مع المفردة ، وضعت تحت حقل مغناطيسي خارجي ثابت (الشكل 1). ESR يعمل في مجالات واسعة من العلوم ، مثل الكيمياء والبيولوجيا والفيزياء وعلوم المواد ، من أجل الكشف والتعرف على الجذور الحرة ومراكز ممغطس. انها وسيلة قوية لدراسة البيئة من الجزيئات في الأنواع الحية ممغطس ويوفر معلومات حول الحموضة (PH) ، واللزوجة ، والأكسجين ، وعلى رد الفعل الأوكسجين الأنواع تركيزات 3.
للعينات غير متجانسة ، يمكن الحصول على المعلومات الطيفية ESR بطريقة حل مكانيا (أي عن طريق الحصول على صورة) ، من خلال استخدام تدرجات المجال المغناطيسي 4. هذه هي مشابهة جدا لطريقة أكثر شيوعا من التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الذي يدور أساسا يلاحظ البروتون. حتى الآن ، تم تطبيق تقنيات التصوير مثل ESR لعينات حية مع حجم كبير نسبيا من بضعة سنتيمترات ومم على نطاق القرار. (على سبيل المثال انظر الشكل 2 ، المأخوذ من المرجع 5) وهناك تطور حديث نسبيا في مجال التصوير ESR هو امتداد لقدراتها من النظر إلى الحيوانات الصغيرة الحجم في المليمتر القرار إلى قياسات لعينات من الملليمتر ، وشبه عادية مع الحجم ميكرون على نطاق القرار. ويعرف هذا المجال ، حيث ESR المجهري ، والتي يمكن اليوم تقديم صور ESR 3D مع قرار يقترب 1 2 ميكرون (انظر الأمثلة ممثل في الشكل 3).
مجهر ESR يشبه أساسا إلى مطياف ESR التقليدية. انها عامل جذب لتوليد حقل ثابت ، ونظام الميكروويف لتدور الإثارة واكتشاف الإشارات ، تحقيقا لعقد العينة ، وحدة محوسبة للتحكم في عملية اقتناء ومعالجة البيانات. مكونات أخرى فريدة من نوعها التصوير ESR بشكل عام والموجودة أيضا في مصغرة ESR ممغنطة مصادر التدرج الميدانية ، التي هي جزء من النظام الالكتروني ، وملفات الانحدار التي تقع في التحقيق التصوير. ويرد مزيد من التفاصيل حول نظامنا محددة في الفيلم ، ووصف بروتوكول في إشارة 2.
2. ESR إعداد نموذج مايكرو التصوير
ويصف هذه المرحلة طريقة لإعداد نموذج للتجربة التصوير ESR متناهية الصغر. في نهاية هذه المرحلة يتم وضع الخلايا في الجزء السفلي من الزجاج ESR أعدت خصيصا لحاوية العينة المجهر جنبا إلى جنب مع حل جذري trityl العازلة 6. يصف هذا البروتوكول قياس خلايا البكتيريا الزرقاء ، وبالتالي ، بالنسبة لأنواع أخرى من الخلايا ، قد تكون هناك حاجة إلى إجراء تعديلات مناسبة على عينة مرحلة التحضير.
- أولا ، يتم اتخاذ مربعات قليلة من ورقة ماصة بحجم 400 400 ميكرومتر ~ وإدراجها في أنبوب إيبندورف التي شغلها في وقت لاحق مع 1.2 مل من تعليق البكتيريا الزرقاء (بتركيز 40 ملغ / مل).
- يتم طرد تعليق لمدة 2 دقيقة عند 6000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge.
- بعد هذا ، تتم إزالة تماما العازلة طاف باستثناء ميكرولتر 50 ~ التي يتم ترك البكتيريا الزرقاء لتجنب الجفاف. نتيجة لهذه العملية ، مشبعة الآن ورقة ماصة من قبل خلايا البكتيريا الزرقاء.
- باستخدام الملقط غرامة ، ويتم استخراج ألياف قليلة من الورق وتوضع في قاع فنجان تشبه الزجاج أعدت خصيصا صاحب العينة 7. بعد أن تتم إضافة 3 ملم من trityl في حل BG - 11 8 ، 9 (انظر المخطط 1) لصاحب العينة من خلال المعونة من حقنة الغرامة. ومن ثم ختم صاحب الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها باستخدام الغراء ، وترك منفذ الهواء صغيرة مفتوحة.
الأسهم 4 الأسهم 3 الأسهم 2 المخزون 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 هبو 4 : 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4 : 7H 2 O
7.5g/literغ 2 ملغ EDTA 0.1g/liter MnCl 2 : 4H 2 O
1.81g/literالحديديك سترات الأمونيوم 0.6g/liter ZnSO 4 : 7H 2 O
0.222g/literحامض الستريك : 1H2O
0.6g/literكبريتات النحاس (4) : 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2 : 2H 2 O
3.6g/literرمع الفتح المهبطي 2 : 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4 : 2H 2 O
0.391g/liter
مخطط (1) إعداد المتوسطة BG 11.
3. ESR مايكرو التصوير التجارب
- لبدء تجربة التصوير ، وتشغيل نظام التصوير الجزئي ESR وتضاف العينة إلى أن يذهب مرنان داخل مسبار التصوير.
- الآن ، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الكمبيوتر ، وضبط النظام على الوضع "اللحن" والعثور على تردد صدى الميكروويف لجنة التحقيق ، والتي سيتم استخدامها لقياس ESR.
- بعد ذلك ، تعيين الحقل المغناطيسي ثابتة على القيمة التي تتوافق مع وتيرة الميكروويف التطبيقية ، وتعيين المعلمات توقيت لتسلسل النبض ومراقبة إشارة ESR للتأكد من أن نظام وظائف جيدة والعينة مستعدة جيدا.
- ثم ، تعيين المعلمات والتصوير ، مثل عدد البكسل ، وقوة من التدرجات ، وطول البقول الانحدار إلى القيم المطلوبة لديهم.
- بعد الإعداد ، وجمع ثلاث صور ESR 3D بواسطة تسلسل صدى نبض التصوير هان (الشكل 4) مع فصل interpulse والقيم من 600 ، 500 ، 700 و NS.
- يتم تشغيل الضوء المسقط على عينة أو إيقاف تشغيله اعتمادا على الظروف التجريبية المطلوبة.
- خلال اقتناء وحفظ البيانات تلقائيا. ثم تتم معالجة البيانات الخام الأطروحات الملفات عن طريق برنامج ماتلاب النصي لتوفير صور من تركيز trityl الراديكالية ووقت الاسترخاء T 2 الخريطة ، والتي تترجم الى تركيز الأوكسجين عن طريق صورة موجودة مسبقا المعايرة.
4. ممثل النتائج
نتائج التجربة عدة ثلاثي الأبعاد ESR متناهية الصغر الصور المسجلة على قيم τ مختلفة. يتم توفير البيانات الخام الصور النمطية في الشكل 5. أعلى ثلاث صور ، ويقاس في ظروف مظلمة ، متشابهة جدا ، باستثناء انخفاض في كثافة الإشارة. من ناحية أخرى ، يتغير نمط الصور تحت أشعة ضوء نتيجة اوقات الاسترخاء مختلفة في أجزاء مختلفة من العينة. يمكن معالجة هذه البيانات من 1 إلى الحصول على صورة السعة ، كما هو مبين في الشكل (6) وأيضا صور من الوقت للاسترخاء ، تي 2 (الشكل 7). وتترجم على شكل حرف T 2 الصور في قيم تركيز الأوكسجين عبر منحنى المعايرة قبل القائمة التي تربط بين تركيز الأكسجين إلى وقت الاسترخاء عن طريق المعادلة : 
هنا ، T 2 0 هو وقت الاسترخاء تدور تدور بسرعة التحقيق في ظل ظروف نقص الأكسجين (اعتمادا على تركيز التحقيق ، وجيم ، ومعامل لنشرها ، D) ، و k هو ثابت التناسب. في معظم الحالات ، فإن معامل الانتشار لا تختلف كثيرا عن عينات حية (على الرغم من ذلك ، إذا لزم الأمر ، من حيث المبدأ يمكن أن يكون أيضا من خلال تقييمها مباشرة ESR 6 ، 10) ، ويتم الحصول على تركيز تدور أثناء عملية التصوير. ولذلك ، يمكن استخدام هذه العلاقة لقياس تركيز الأوكسجين مباشرة.
بالعودة إلى الشكل (6) ، يتضح من الصورة السعة التي كانت موجودة في خلايا البكتيريا الزرقاء أساسا على الجانب الأيمن لصاحب العينة. وعلاوة على ذلك ، على أساس الشكل 7 ، فمن الواضح أن الضوء يبدأ إنتاج O 2 ويؤدي إلى زيادة كبيرة في تركيز المحلول 2 O ، وأساسا في voxels بالقرب من البكتيريا الزرقاء.
الشكل 1 : مستويات الطاقة في الرنين الالكتروني المغناطيسي.
الشكل 2 : صورة نموذجية للتركيز الأوكسجين ماوس مع الورم. الصورة على اليسار يظهر المعلومات التشريحية ، استنادا إلى صورة بالرنين المغناطيسي. تم حقن مستقرة خالية العضوية جذرية للفأرة وخصائصها ESR توفير تركيز الأكسجين في بيئتها (يمين). يتم فرضه على أساس النتائج ESR على الصورة التشريحية التصوير بالرنين المغناطيسي. مجال الرؤية هو 32 ملم.
الشكل 3 : مثالين على صور عالية الصغيرة الحجم القرار ESR من العينة photolithographically ولدت مع مسحوق N @ C 60 (يسار) وLiPcبلورات ممغطس (يمين)
الشكل 4 : النموذجية هاهن تسلسل نبض التصوير تبين الميكروويف (MW) ، والتدرج ، ومجموعة X ، Y G G والبقول ض.
الشكل 5 : نموذجي البيانات الخام ESR متناهية الصغر الصور : أ ، ب ، ج والبيانات الأولية من عينة Cyanobacterium مع عدم وجود إنارة الضوء المقاسة لτ = 500600700 نانوثانية ، على التوالي. البنود د ، ه ، و هي نفس أ ، ب ، ج ، ولكن مع الإضاءة الخفيفة. يتم رسم كثافة في حجم التعسفي (ولكن متناسقة داخل كل مجموعة من ثلاثة الظلام أو الضوء صور البيانات الخام)
الشكل 6 : صورة السعة المقابلة لتركيز جذري في حل (مقياس التعسفي).
الشكل 7 : T 2 الصور والمناظر و[O 2] القيم في ظل ظروف (يمين) الظلام (يسار) والخفيفة.
Discussion
هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن تطبيقها ESR التصوير الجزئي لتعيين تركيز الأكسجين بالقرب من عينات صغيرة حية. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، فإنه يمكن تطبيقه بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، وقدرة وسائل أخرى والتي تجد من الصعب جدا تحقيقه. في المستقبل القريب نخطط لزيادة تحسين هذه المنهجية لتقديم عينة من الصور الحية مع قرار من بضعة ميكرونات ، وتوفير معلمات النقيض من مثل تركيز أكسيد عظمى والحموضة (PH) ، نشر وتحقيق معامل ، بالطبع ، وتركيز الأوكسجين. هذه القدرات هي مكملة لمنهجيات البصرية الحالي القائم على حد سواء من حيث النوع ، وكذلك على النقيض من خصائص العينات (مثل عينات غير شفافة وسميكة ، في بعض الحالات ، مقابل قياسات الخلايا خارج الخلية).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من خلال منحة لا. 213/09 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية ، ومنحة لا. 2005258 من مؤسسة البنك السعودي الفرنسي ، ومنحة لا. 201665 من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، وتقنية النانو في معهد روسيل Berrie في التخنيون. نعترف بمساعدة البروفيسور نعوم أدير وفارس سلامة من كلية Schulich الكيمياء في التخنيون بشأن العرض والتعامل مع البكتيريا الزرقاء. يحظى بتقدير كبير في مساعدة ودعم Yoffis سفيتلانا من وحدة التصنيع التخنيون الصغير نانو.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
