Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor micronschaal drie-dimensionale beeldvorming van zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen door electron spin resonantie microscopie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een elektron spin resonantie (ESR) micro-imaging methode voor driedimensionaal in kaart brengen van zuurstof in de directe omgeving van levende cellen met micron-schaal resolutie van 1. Zuurstof is een van de belangrijkste moleculen in de cyclus van het leven. Het dient als de terminale elektron acceptor van oxidatieve fosforylering in de mitochondriën en wordt gebruikt bij de productie van reactieve zuurstof species. Metingen van zuurstof van belang zijn voor de studie van mitochondriële en metabolische functies, signaalwegen, effecten van verschillende stimuli, membraanpermeabiliteit, en ziekte differentiatie. Zuurstofverbruik is dan ook een informatieve marker van cellulaire stofwisseling, die breed toepasbaar op verschillende biologische systemen van mitochondriën naar de cellen tot hele organismen. Vanwege het belang ervan, zijn vele methoden ontwikkeld voor het meten van zuurstof in levende systemen. Huidige pogingen om hoge-resolutie zuurstof imaging bieden zijn voornamelijk gebaseerd op optische fluorescentie en fosforescentie methoden die geen bevredigende resultaten geven als zij in dienst hebben sondes met een hoge foto-toxiciteit en een lage zuurstof-gevoeligheid. ESR, die het signaal van exogene paramagnetische sondes in de steekproef maatregelen, is bekend om zeer nauwkeurige metingen van de zuurstofconcentratie te bieden. In een typisch geval, ESR metingen kaart brengen van de sonde lineshape verbreding en / of ontspanning-time verkorten die rechtstreeks verband houden met de lokale zuurstofconcentratie. (Oxygen is paramagnetisch, daarom, bij botsen met de exogene paramagnetische sonde, het kortademigheid haar relaxatietijden.) Traditioneel, dit soort experimenten worden uitgevoerd met een lage resolutie, millimeter-schaal ESR voor kleine dieren beeldvorming. Hier hebben we laten zien hoe ESR beeldvorming ook kan worden uitgevoerd in het micron-schaal voor het onderzoek van kleine live-samples. ESR micro-imaging is een relatief nieuwe methode die het verwerven van ruimtelijk-opgelost ESR-signalen met een resolutie nadert een micron bij kamertemperatuur 2 mogelijk maakt. Het voornaamste doel van dit protocol-paper is te zien hoe deze nieuwe methode, samen met de nieuw ontwikkelde zuurstof-gevoelige probes, kunnen worden toegepast op het in kaart brengen van het zuurstofgehalte in kleine live-samples. Een ruimtelijke resolutie van ~ 30 x 30 x 100 micrometer is aangetoond, met een bijna micromolair zuurstofconcentratie gevoeligheid en sub-femtomole absolute zuurstof gevoeligheid per voxel. Het gebruik van ESR micro-imaging voor zuurstof in kaart brengen van in de buurt van cellen een aanvulling op de thans beschikbare technieken op basis van micro-elektroden of fluorescentie / fosforescentie. Bovendien, met de juiste paramagnetische sonde, zal het ook goed toepasbaar voor intracellulaire zuurstof micro-imaging, een mogelijkheid die andere methoden vinden heel moeilijk te bereiken.
Protocol
1. Overzicht van de ESR Micro-imaging
Eerst geven we een korte uitleg van de ESR, ESR microscopie, en de verschillende onderdelen van ons systeem, en dan zullen we de werkelijke imaging experimenten.
Elektron spin resonantie is een spectroscopische techniek waarbij elektromagnetische straling op een bepaalde frequentie wordt geabsorbeerd door moleculen met ongepaarde elektron spins, geplaatst onder een extern statisch magnetisch veld (figuur 1). ESR is werkzaam in grote gebieden van de wetenschap, zoals scheikunde, biologie, natuurkunde en materiaalkunde, voor de detectie en identificatie van vrije radicalen en paramagnetische centra. Het is een krachtige methode voor het bestuderen van het milieu van paramagnetische moleculen in levende soorten en geeft informatie over de zuurgraad (pH), viscositeit, zuurstof en reactive oxygen species concentraties van 3.
Voor heterogene monsters, kan ESR spectrale informatie worden verkregen in een ruimtelijk opgelost manier (dat wil zeggen, door het verkrijgen van een afbeelding), door het gebruik van het magnetisch veld gradiënten 4. Dit is zeer vergelijkbaar met de meer gebruikelijke methode van magnetic resonance imaging (MRI) die vooral merkt proton spins. Tot nu toe werden dergelijke ESR beeldvormende technieken toegepast voor levende specimens met een relatief grote omvang van een paar centimeter omhoog en in mm-schaal resolutie. (Bijvoorbeeld: zie figuur 2, overgenomen uit referentie 5.) Een relatief recente ontwikkeling in de ESR beeldvorming is de uitbreiding van de mogelijkheden uit te kijken naar kleine dieren in millimeter-schaal resolutie van de metingen van millimeter-en sub-millimeter-size monsters met een micron-schaal resolutie. Dit veld staat bekend als ESR microscopie, die vandaag de dag kunnen 3D-beelden te leveren ESR met een resolutie naderen een micron 2 (zie representatieve voorbeelden in figuur 3).
Een ESR microscoop is in wezen vergelijkbaar met een conventionele ESR spectrometer. Het is een magneet voor het genereren van het statische veld, een magnetron voor spin-excitatie en signaal-detectie, een sonde voor het houden van het monster, en een geautomatiseerde console om de overname proces-en data handling controle. Andere componenten die uniek de ESR beeldvorming in het algemeen en ook in de bestaande ESR microkopie zijn magnetisch veld gradiënt bronnen, die deel uitmaken van het elektronische systeem, en gradiëntspoelen die zich in de beeldvorming sonde. Meer details over onze specifieke systeem zijn weergegeven in het protocol film en beschreven in referentie 2.
2. ESR Micro-imaging Monstervoorbereiding
Deze fase beschrijft de methode voor monstervoorbereiding voor de ESR micro-imaging experiment. Aan het eind van deze fase cellen zijn geplaatst op de bodem van een speciaal bereide glas ESR microscopie monsterhouder, samen met een trityl radicale 6 bufferoplossing. Dit protocol beschrijft de meting van cyanobacteriën cellen en daarmee, voor andere soorten cellen, de juiste aanpassingen kunnen nodig zijn bij de monstervoorbereiding podium.
- Eerst worden een paar vierkanten van absorberend papier met een afmeting van ~ 400 400 micrometer genomen en ingebracht in een eppendorfbuisje, die vervolgens wordt gevuld met 1,2 ml van de cyanobacteriën suspensie (met een concentratie van 40 mg / ml).
- De suspensie wordt gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 6000 rpm in een microcentrifuge.
- Na deze, is het supernatant buffer volledig verwijderd, behalve voor ~ 50 uL, die worden overgelaten aan cyanobacteriën uitdroging te voorkomen. Als gevolg van dit proces, is het absorberend papier nu verzadigd door de cyanobacteriën cellen.
- Met behulp van fijne pincet, zijn een paar vezels uit de krant en op de bodem van een cup-achtige speciaal geprepareerde glas monsterhouder 7. Naar aanleiding van dat een 3 mM van trityl in BG-11-oplossing 8, 9 (zie Schema 1) wordt toegevoegd aan de monsterhouder met behulp van een fijne spuit. De houder wordt vervolgens afgedicht met behulp van UV-lijm, waardoor een kleine luchtuitlaat te openen.
Voorraad 4 Voorraad 3 Voorraad 2 Voorraad 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 mg EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literIjzer ammoniumcitraat 0.6g/liter ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literCitroenzuur: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 : 6H 2 O
0.050g/literNaMoO 4: 2H 2 O
0.391g/liter
Schema 1. Voorbereiding van de BG-11 medium.
3. ESR Micro-imaging experimenten
- Om te beginnen de beeldvorming experiment, zet de ESR micro-imaging-systeem en breng het monster in de resonator, dat gaat in de imaging-sonde.
- Nu, met behulp van de computer te bedienen software, zet het systeem op "Tune" mode en vind de resonantie microgolf frequentie van de sonde, die zal worden gebruikt voor de ESR metingen.
- Naar aanleiding van dat, het statisch magnetisch veld ingesteld op de waarde die de toegepaste microgolf frequentie wedstrijden, de timing parameters voor de pulssequentie en observeer de ESR signaal om ervoor te zorgen dat het systeem goed functioneert en het monster is goed voorbereid.
- Stel vervolgens de imaging parameters, zoals het aantal pixels, de sterkte van de hellingen, en de lengte van het verloop pulsen om de vereiste waarden.
- Na de installatie, het verzamelen van drie 3D-beelden door een ESR Hahn echo imaging pulssequentie (figuur 4) met interpulse scheiding, de waarden van 500, 600 en 700 ns.
- Licht geprojecteerd op het monster is in-of uitgeschakeld, afhankelijk van de vereiste experimentele omstandigheden.
- Tijdens de overname, worden de gegevens automatisch opgeslagen. Scripties ruwe data bestanden worden vervolgens verwerkt via Matlab software script om beelden van de trityl radicale concentratie en de relaxatietijd T 2 kaart, die wordt vertaald naar een zuurstofconcentratie afbeelding via reeds bestaande calibratie te bieden.
4. Representatieve resultaten
De uitkomsten van het experiment zijn verschillende drie-dimensionale ESR micro-beelden die op verschillende τ waarden. Typische ruwe data beelden worden gegeven in figuur 5. De top drie beelden, gemeten onder donkere omstandigheden, zijn zeer vergelijkbaar, behalve voor vermindering van het signaal intensiteit. Aan de andere kant, het beeld patroon verandert onder lichte bestraling te wijten aan de verschillende relaxatietijden in verschillende delen van het monster. Deze gegevens kunnen worden verwerkt tot een een amplitude beeld te verkrijgen, zoals weergegeven in figuur 6, maar ook beelden van de relaxatietijd, T 2 (figuur 7). De T 2 beelden worden omgezet in zuurstof waarden via een reeds bestaande calibratie curve die de zuurstof concentratie naar de relaxatietijd via de vergelijking links: 
Hier, T 2 0 is de spin-spin relaxatietijd van de sonde onder zuurstofloze omstandigheden (afhankelijk van de concentratie van de sonde, C, en de diffusiecoëfficiënt, D), en k een evenredigheidsconstante. In de meeste gevallen, is de diffusie coëfficiënt niet veel afwijken van levende monsters (hoewel, indien nodig, het kan in principe ook direct worden geëvalueerd door ESR 6, 10), en de spin concentratie is verkregen tijdens het beeldvormingsproces. Daarom kan deze relatie worden gebruikt om rechtstreeks te meten zuurstofconcentratie.
Terug te gaan naar figuur 6, blijkt uit de amplitude beeld dat de cyanobacteriën cellen bevonden zich vooral op de rechterkant van de monsterhouder. Bovendien, op basis van figuur 7, is het duidelijk dat licht de productie van O 2 initieert en leidt tot een aanzienlijke toename van O van de oplossing 2-concentratie, vooral in de voxels de buurt van de cyanobacteriën.
Figuur 1: Energie niveaus in elektron spin resonantie.
Figuur 2: Typische zuurstofconcentratie beeld van een tumor dragende muizen. De afbeelding aan de linkerkant toont de anatomische informatie, op basis van een MRI-beeld. Een stabiele vrije organische radicaal werd geïnjecteerd om de muis en de ESR kenmerken bieden de zuurstofconcentratie in de omgeving (rechts). ESR-based resultaten zijn bovenop MRI anatomische beeld. Gezichtsveld is 32 mm.
Figuur 3: Twee voorbeelden van hoge resolutie micro-schaal ESR beelden van photolithographically gegenereerde monster met N @ C 60 poeder (links) en LiPc paramagnetische kristallen (rechts)
Figuur 4: Typische Hahn beeldvorming pulssequentie met de magnetron (MW) en de gradiënt, G x, y G en G z pulsen.
Figuur 5: Typische raw-data ESR micro-beelden: a, b, en c de ruwe gegevens van de cyanobacterie monster zonder licht gemeten verlichtingssterkte voor τ = 500600700 ns, respectievelijk. Items d, e, en zijn hetzelfde als a, b en c maar met licht verlichting. Intensiteit is uitgezet in willekeurige schaal (maar is consistent binnen elke set van drie donkere of lichte ruwe data beelden)
Figuur 6: Amplitude afbeelding die overeenkomt met de radicale concentratie in de oplossing (willekeurige schaal).
Figuur 7: T 2 foto's en de bijbehorende [O 2] waarden onder donker (links) en licht (rechts) omstandigheden.
Discussion
Dit protocol laat zien hoe ESR micro-imaging kan worden toegepast op de zuurstofconcentratie in de buurt wonen kleine monsters kaart. Een ruimtelijke resolutie van ~ 30 x 30 x 100 micrometer is aangetoond, met een bijna micromolair zuurstofconcentratie gevoeligheid en sub-femtomole absolute zuurstof gevoeligheid per voxel. Het gebruik van ESR micro-imaging voor zuurstof in kaart brengen van in de buurt van cellen een aanvulling op de thans beschikbare technieken op basis van micro-elektroden of fluorescentie / fosforescentie. Bovendien, met de juiste paramagnetische sonde, zal het gemakkelijker toepasbaar voor intracellulaire zuurstof micro-imaging, een mogelijkheid die andere methoden vinden heel moeilijk te bereiken. In de nabije toekomst zijn we van plan op het verder verbeteren van deze methodologie om te leven monster beelden te leveren met een resolutie van enkele microns, waardoor het contrast parameters, zoals superoxide concentratie, zuurgraad (pH), probe diffusiecoëfficiënt en, natuurlijk, de zuurstofconcentratie. Deze mogelijkheden zijn complementair aan de huidige optische-based methoden, zowel in termen van contrast soort en ook van de monsters kenmerken (bv. niet-transparante dikke monsters en in sommige gevallen, intracellulaire vs extracellulaire metingen).
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie niet. 213/09 van de Israëlische Science Foundation, geef geen. 2005258 van de BSF stichting, verlenen geen. 201.665 van de European Research Council (ERC), en door de Russell Berrie Nanotechnologie Instituut aan de Technion. Wij erkennen de hulp van Prof Noam Adir en Faris Salame van de Schulich Faculteit Chemie van de Technion met betrekking tot de levering en behandeling van de cyanobacteriën. De hulp en de ondersteuning van Svetlana Yoffis van het Technion Micro-Nano Fabrication Unit wordt zeer gewaardeerd.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
