Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר ספין האלקטרון תהודה (שקיעת דם) מיקרו הדמיה שיטת מיפוי תלת ממדי של רמות החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים עם מיקרון בקנה מידה ברזולוציה 1. החמצן הוא אחד מולקולות החשובות ביותר במחזור החיים. היא משמשת acceptor מסוף אלקטרונים של זרחון חמצוני במיטוכונדריה והוא משמש בייצור של מינים חמצן תגובתי. מדידות של חמצן חשובה לחקר פונקציות המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים, מסלולי איתות, ההשפעות של גירויים שונים, חדירות הממברנה, והבחנה המחלה. צריכת חמצן ולכן הוא סמן אינפורמטיבי של חילוף החומרים הסלולר, אשר החלים רחב במערכות ביולוגיות שונות המיטוכונדריה לתאים לאורגניזמים כולו. בשל חשיבותו, שיטות רבות פותחו עבור מדידות של חמצן במערכות חיים. ניסיונות נוכחי לספק ברזולוציה גבוהה הדמיה חמצן מתבססים בעיקר על הקרינה אופטיים ושיטות זרחני כי אינם מצליחים לספק תוצאות משביעות רצון כפי שהם מעסיקים בדיקות רעילות עם תמונה גבוהה ורגישות חמצן נמוכה. שקיעת דם, אשר מודד את האות בדיקות פאראמגנטיים אקסוגניים במדגם, ידוע לספק מדידות מדויקות מאוד של ריכוז החמצן. במקרה טיפוסי, מדידות שקיעת דם המפה הרחבת lineshape של בדיקה ו / או רגיעה בזמן קיצור כי הם קשורים ישירות לריכוז חמצן המקומית. (החמצן הוא פאראמגנטיים, לכן כאשר מתנגשות עם החללית פאראמגנטיים אקסוגניים, זה קוצר פעמים הרפיה שלה.) באופן מסורתי, אלו סוגים של ניסויים מתבצעות עם רזולוציה נמוכה, מילימטר בקנה מידה שקיעת דם הדמיה חיות קטנות. כאן אנו מראים כיצד שקיעת דם הדמיה יכולה גם להתבצע בהיקף מיקרון עבור הבדיקה של דגימות חי קטן. שקיעת דם מיקרו הדמיה היא מתודולוגיה חדשה יחסית המאפשרת רכישה של אותות שקיעת דם מרחבית נפתרה עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון בטמפרטורת החדר 2. המטרה העיקרית של נייר פרוטוקול זה היא להראות כיצד השיטה החדשה, יחד עם חמצן רגיש בדיקות החדש שפותח, יכול להיות מיושם על מיפוי של רמות חמצן בדגימות לחיות קטנות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה גם ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג.
Protocol
1. סקירה של שקיעת דם מיקרו הדמיה
ראשית, אנו מספקים הסבר קצר על שקיעת דם, שקיעת דם מיקרוסקופית, ואת המרכיבים השונים של המערכת שלנו, ולאחר מכן נתאר את הניסויים הדמיה בפועל.
תהודה אלקטרונים ספין היא טכניקה ספקטרוסקופיות שבהן קרינה אלקטרומגנטית בתדר מסוים נספג על ידי מולקולות עם ספינים של אלקטרונים מזווג, תחת שדה מגנטי סטטי חיצוני (איור 1). שקיעת דם מועסק באזורים רחבים של המדע, כגון כימיה, ביולוגיה, פיזיקה, מדע החומרים, לאיתור וזיהוי של רדיקלים חופשיים ומרכזי פאראמגנטיים. זוהי שיטה רבת עוצמה לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיים במינים חיים ומספק מידע על חומציות (pH), צמיגות, חמצן, תגובתי מינים חמצן בריכוז 3.
לקבלת דוגמיות הטרוגנית, שקיעת דם מידע ספקטרלי ניתן לקבל באופן מוחלט מרחבית (כלומר, על ידי קבלת תמונה), באמצעות מעברים הדרגתיים השדה המגנטי 4. זה דומה מאוד לשיטה נפוצה יותר של הדמיה באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כי בעיקר מציין ספינים פרוטון. עד כה, כגון שקיעת דם טכניקות הדמיה יושמו עבור דגימות לחיות עם גודל גדול יחסית של כמה סנטימטרים וגם ברזולוציה מ"מ בקנה מידה. (לדוגמה ראה איור 2, שנלקחו הפניה 5.) ההתפתחות האחרונה יחסית שקיעת דם הדמיה היא הרחבה של יכולותיו מהתבוננות חיות קטנות ברזולוציה של מילימטר בהיקף של מדידות של דגימות מילימטר ותת בגודל מילימטר עם בקנה מידה מיקרון החלטה. תחום זה נקרא מיקרוסקופיה שקיעת דם, אשר היום יכול לספק תמונות שקיעת דם 3D עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון 2 (ראה דוגמאות נציג איור 3).
מיקרוסקופ ESR הוא דומה במהותו ספקטרומטר שקיעת דם רגילה. יש לו מגנט ליצירת שדה סטטי, מערכת מיקרוגל עבור עירור ספין זיהוי אות, בדיקה לקיום המדגם, מסוף ממוחשב לשלוט בתהליך הרכישה וטיפול נתונים. רכיבים אחרים הדמיה ייחודית שקיעת דם בכלל קיים גם שקיעת דם microcopy הם מגנטיים שיפוע בתחום מקורות, שהם חלק ממערכת אלקטרונית, סלילי צבע הנמצאים לחקור את ההדמיה. פרטים נוספים על מערכת ספציפית שלנו מוצגים בסרט הפרוטוקול המתואר התייחסות 2.
2. שקיעת דם מיקרו הדמיה לדוגמא הכנה
בשלב זה מתאר את שיטת הכנת המדגם לניסוי שקיעת דם מיקרו הדמיה. בסוף שלב זה התאים ממוקמים בתחתית מיוחד שהוכן שקיעת דם מיכל זכוכית מיקרוסקופ מדגם יחד עם פתרון trityl 6 הרדיקלי למאגר. פרוטוקול זה מתאר את המדידה של תאים כחוליות ולכן, עבור סוגים אחרים של תאים, התאמות הנכון עשוי להיות נחוץ בשלב הכנת המדגם.
- ראשית, כמה ריבועים של נייר סופג עם גודל של 400 ~ 400 מיקרומטר נלקחים ונוסף צינור Eppendorf אשר מלא לאחר מכן עם 1.2 מ"ל של ההשעיה כחוליות (בריכוז של 40 מ"ג / מ"ל).
- ההשעיה היא centrifuged 2 דקות ב 6000 סל"ד ב microcentrifuge.
- בעקבות זאת, למאגר supernatant נמחק לחלוטין למעט μL 50 ~ אשר עזבו כדי למנוע התייבשות כחוליות. כתוצאה מתהליך זה, הנייר סופג רווי עכשיו על ידי התאים כחוליות.
- בעזרת פינצטה בסדר, סיבים כמה המחולצים הנייר והניח בתחתית כוס דמוי בעל שהוכנו במיוחד זכוכית מדגם 7. לאחר מכן 3 מ"מ של trityl בפתרון-11 BG 8, 9 (ראה Scheme 1) הוא הוסיף לבעל המדגם על ידי סיוע של מזרק בסדר. בעל הוא חתום מכן באמצעות דבק לריפוי UV, משאיר משקע קטן אוויר פתוח.
במלאי 4 במלאי 3 במלאי 2 במלאי 1 H 3 BO 3
2.86g/literK 2 HPO 4: 3H 2 O
4.0g/literMgSO 4: 7H 2 O
7.5g/literNa 2 מ"ג EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O
1.81g/literאמוניום ציטרט Ferric 0.6g/liter ZnSO 4: 7H 2 O
0.222g/literחומצה ציטרית: 1H2O
0.6g/literCuSO 4: 5H 2 O
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 O
3.6g/literCOCl 2 : 6 שעות 2 O
0.050g/literNaMoO 4: 2H 2 O
0.391g/liter
Scheme 1. הכנת בינוני 11 BG.
3. שקיעת דם מיקרו הדמיה ניסויים
- כדי להתחיל את הניסוי הדמיה, להפעיל את המערכת שקיעת דם מיקרו הדמיה להכניס את הדגימה לתוך מהוד שהולך בתוך החללית הדמיה.
- כעת, באמצעות תוכנת שליטה במחשב, להגדיר את המערכת על מצב "כוון" ולמצוא את המיקרוגל תהודה בתדירות של החללית, אשר ישמשו למדידת שקיעת דם.
- לאחר מכן, הגדר את שדה מגנטי סטטי על ערך התואם את תדר המיקרוגל מיושם, להגדיר את הפרמטרים תזמון רצף הדופק ולבחון את האות שקיעת דם על מנת לוודא כי המערכת פונקציות היטב המדגם הוא מוכן היטב.
- ואז, להגדיר את הפרמטרים הדמיה, כגון מספר של פיקסלים, כוחו של מילויים, ואת אורכו של פולסים שיפוע לערכים הנדרשים שלהם.
- לאחר ההתקנה, לאסוף שלוש תמונות 3D שקיעת דם על ידי רצף הד האן הדופק הדמיה (איור 4) עם הפרדה interpulse, ערכי 500, 600, ו 700 ns.
- אור מוקרן על המדגם הוא מופעל או כבוי בהתאם לתנאי הניסוי הנדרש.
- במהלך הרכישה, הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. ותיזות קבצי נתונים גולמיים מעובדים אז דרך סקריפט תוכנות Matlab לספק תמונות של ריכוז קיצוני trityl וזמן רגיעה T 2 המפה, אשר תורגמו תמונה חמצן בריכוז באמצעות כיול קיימים.
4. נציג תוצאות
התוצאות של הניסוי הם מספר תלת מימדי שקיעת דם מיקרו תמונות נרשם ערכים שונים τ. תמונות אופייניות נתונים גולמיים ניתנים באיור 5. העליון שלוש תמונות, נמדד בתנאים כהה, דומים מאוד, למעט הפחתה בעוצמת האות. מצד שני, דפוס תמונה השינויים תחת קרינה אור בשל פעמים הרפיה שונים בחלקים שונים של המדגם. מידע זה יכול להיות מעובד 1 להשיג תמונה משרעת, כפי שמוצג באיור 6 וגם תמונות של זמן הרפיה, T 2 (איור 7). T 2 תמונות מתורגמים ריכוז חמצן ערכים באמצעות עקומת קיימים כיול המקשר את ריכוז החמצן בזמן הרפיה באמצעות המשוואה: 
הנה, T 2 0 הוא הזמן ספין ספין הרפיה של החללית בתנאים anoxic (תלוי בריכוז של בדיקה, C, מקדם הדיפוזיה שלה, D), ו-k הוא קבוע המידתיות. ברוב המקרים, מקדם הדיפוזיה אינו משתנה הרבה דוגמאות לחיות (אם כי, במידת הצורך, הוא יכול עקרונית להיות מוערך באופן ישיר גם על ידי 6 שקיעת דם, 10), ריכוז ספין מתקבל במהלך תהליך ההדמיה. לכן, יחס זה יכול לשמש כדי למדוד ישירות ריכוז החמצן.
נחזור איור 6, ברור מהתמונה משרעת כי תאי כחוליות היו ממוקמים בעיקר בצד ימין של בעל המדגם. יתר על כן, מבוסס על איור 7, ברור כי לאור יוזם את הייצור של O 2 ו - גורם לעלייה משמעותית בריכוז O 2 של פתרון, בעיקר voxels ליד כחוליות.
איור 1: רמות אנרגיה בתהודה ספין האלקטרון.
איור 2: חמצן בריכוז תמונה אופיינית של עכבר נושאת גידול. התמונה משמאל מראה את המידע האנטומי, המבוסס על תמונה MRI. יציבה חינם אורגני רדיקלי היה מוזרק אל העכבר ומאפיינים שקיעת דם שלה לספק את ריכוז החמצן בכל סביבתו (מימין). שקיעת דם מבוסס התוצאות על גבי תמונת ה-MRI האנטומית. שדה הראייה הוא 32 מ"מ.
איור 3: שתי דוגמאות של ES גבוה מיקרו בקנה מידה ברזולוציהR תמונות של מדגם photolithographically שנוצר עם אבקת N C 60 @ (משמאל) גבישים פאראמגנטיים LiPc (מימין)
איור 4: אופיינית האן הדמיה רצף הדופק מראה את מיקרוגל (MW) ואת שיפוע, G x, y G ו-G z פולסים.
איור 5: אופיינית גלם נתונים שקיעת דם מיקרו תמונות: a, b, ו-c הם נתונים גולמיים של המדגם cyanobacterium עם תאורה לא קלה נמדד τ = 500600700 ns, בהתאמה. פריטים D, E, ו - זהים a, b, ו-c, אבל עם תאורה אור. עוצמה היא להתוות סולם שרירותי (אך עולה בקנה אחד בתוך כל קבוצה של שלוש תמונות הגלם נתונים כהה או בהיר)
איור 6: תמונה Amplitude המתאים ריכוז קיצוני הפתרון (בקנה מידה שרירותי).
איור 7: T 2 תמונות המקביל [O 2] ערכי תחת (מימין) בתנאי חושך (משמאל) אור.
Discussion
פרוטוקול זה מראה כיצד שקיעת דם מיקרו הדמיה יכול להיות מיושם על המפה ריכוז החמצן ליד דגימות קטנות לחיות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג. בעתיד הקרוב אנו מתכננים להמשיך ולשפר את המתודולוגיה לספק תמונות מדגם לחיות עם רזולוציה של מיקרונים אחדים, מתן פרמטרים כגון ניגודיות ריכוז תחמוצת סופר, חומציות (pH), מקדם בדיקה דיפוזיה, כמובן, ריכוז החמצן. יכולות אלה משלימים האופטי מבוסס מתודולוגיות הנוכחי הן מבחינת סוג בניגוד וגם דוגמאות של מאפיינים (למשל, לא שקוף דגימות עבה, במקרים מסוימים, מדידות תאיים לעומת תאיים).
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענק לא. 213/09 של קרן המדע הישראלי, אין להעניק. 2005258 מקרן BSF, מענק לא. 201,665 מן המועצה האירופית למחקר (ERC), ועל ידי מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה בטכניון. אנו מכירים את עזרתו של פרופ 'נועם אדיר פארס סלאמה מהפקולטה Schulich לכימיה בטכניון לגבי אספקת וטיפול של כחוליות. העזרה והתמיכה של סבטלנה Yoffis מן היחידה Micro-Nano ייצור הטכניון הוא מאוד מוערך.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
