Summary
इस प्रोटोकॉल माइक्रोन पैमाने इलेक्ट्रॉन स्पिन गूंज माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं के तत्काल वातावरण में ऑक्सीजन एकाग्रता के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Protocol
1. माइक्रो इमेजिंग ESR का अवलोकन
सबसे पहले, हम ESR के एक संक्षिप्त विवरण, ESR माइक्रोस्कोपी, और हमारी प्रणाली के विभिन्न घटकों प्रदान करते हैं, और फिर हम वास्तविक इमेजिंग प्रयोगों का वर्णन होगा.
इलेक्ट्रॉन स्पिन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है जिसमें एक विशिष्ट आवृत्ति में विद्युत चुम्बकीय विकिरण unpaired इलेक्ट्रॉन स्पिन के साथ अणुओं द्वारा अवशोषित है, एक बाहरी स्थैतिक चुंबकीय क्षेत्र (चित्रा 1) के तहत रखा है. ESR विज्ञान के रसायन शास्त्र, जीव विज्ञान, भौतिकी, विज्ञान और सामग्री के रूप में व्यापक क्षेत्रों में कार्यरत है, मुक्त कण और paramagnetic केन्द्रों का पता लगाने और पहचान के लिए. यह जीवित प्रजातियों में paramagnetic अणुओं के वातावरण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है और अम्लता (पीएच), दलदलापन, ऑक्सीजन, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 3 सांद्रता के बारे में जानकारी प्रदान करता है है.
विषम नमूने के लिए, ESR वर्णक्रमीय जानकारी एक spatially हल तरीके से (यानी, एक छवि प्राप्त करने के द्वारा) में प्राप्त किया जा सकता है चुंबकीय क्षेत्र चार gradients के उपयोग के माध्यम से. यह बहुत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के अधिक आम तरीका है (एमआरआई) है कि मुख्य रूप से प्रोटॉन spins के अनुसार के लिए इसी तरह की है. अब तक, ऐसे ESR इमेजिंग तकनीक रहते नमूनों के लिए कुछ सेंटीमीटर के अपेक्षाकृत बड़े आकार के साथ और मिमी पैमाने पर संकल्प में लागू किया गया. (उदाहरण के लिए चित्रा 2, 5 संदर्भ से लिया देखें.) ESR इमेजिंग में एक अपेक्षाकृत हाल ही विकास मिलीमीटर पैमाने पर संकल्प पर छोटे जानवरों को देख के साथ मिलीमीटर और उप मिलीमीटर आकार के नमूने का माप से अपनी क्षमताओं का विस्तार माइक्रोन पैमाने संकल्प. इस क्षेत्र ESR माइक्रोस्कोपी, जो आज 1 2 माइक्रोन (चित्रा 3 में प्रतिनिधि उदाहरण देखें) आ संकल्प के साथ 3 डी ESR छवियों को प्रदान कर सकते हैं के रूप में जाना जाता है.
एक ESR खुर्दबीन अनिवार्य रूप से एक पारंपरिक ESR स्पेक्ट्रोमीटर के समान है. यह स्थिर क्षेत्र, स्पिन उत्तेजना और संकेत का पता लगाने के लिए एक माइक्रोवेव प्रणाली, नमूना रखने के लिए एक जांच, और एक कम्प्यूटरीकृत सांत्वना पैदा करने के लिए अधिग्रहण प्रक्रिया नियंत्रण और डेटा को संभालने के लिए एक चुंबक है. अन्य सामान्य में अद्वितीय ESR इमेजिंग और ESR microcopy में भी मौजूदा घटक के चुंबकीय क्षेत्र ढाल स्रोतों, जो इलेक्ट्रानिक प्रणाली का हिस्सा हैं और ढाल coils कि इमेजिंग जांच में स्थित हैं. हमारे विशिष्ट प्रणाली के बारे में अधिक जानकारी प्रोटोकॉल फिल्म में दिखाया गया है और 2 के संदर्भ में वर्णित है.
2. ESR माइक्रो इमेजिंग नमूना तैयार
इस चरण में ESR प्रयोग माइक्रो इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करने के लिए विधि का वर्णन करता है. इस चरण में कोशिकाओं के अंत में विशेष रूप से तैयार एक गिलास ESR माइक्रोस्कोपी नमूना कंटेनर के तल पर trityl कट्टरपंथी 6 समाधान बफर के साथ एक साथ रखा जाता है. इस प्रोटोकॉल cyanobacteria कोशिकाओं की माप का वर्णन है और इसलिए कोशिकाओं के अन्य प्रकार के लिए उचित समायोजन नमूना तैयारी चरण में आवश्यक हो सकता है.
- सबसे पहले, ~ 400 400 सुक्ष्ममापी का एक आकार के साथ शोषक कागज के कुछ वर्गों लिया है और जो बाद में cyanobacteria निलंबन की 1.2 एमएल (40 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में) के साथ भरा है एक Eppendorf ट्यूब में डाला.
- निलंबन 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 6000 आरपीएम पर centrifuged है.
- इस के बाद, सतह पर तैरनेवाला बफर ~ 50 μL जो cyanobacteria निर्जलीकरण से बचने के लिए छोड़ दिया जाता है के लिए छोड़कर पूरी तरह से हटा दिया है. इस प्रक्रिया का एक परिणाम के के रूप में, शोषक कागज अब cyanobacteria कोशिकाओं द्वारा संतृप्त है.
- ठीक चिमटी का प्रयोग, कुछ फाइबर कागज से निकाले जाते हैं और एक कप की तरह विशेष रूप से तैयार कांच नमूना 7 धारक के तल पर रखा . कि बीजी 11 8 समाधान, 9 में trityl के 3 मिमी (योजना 1 देखें) ठीक एक सिरिंज की सहायता से नमूना धारक को जोड़ा जाता है. धारक तो यूवी का इलाज गोंद का उपयोग करने के लिए बंद है, एक छोटा सा हवा दुकान खुला छोड़.
4 स्टॉक 3 स्टॉक 2 स्टॉक 1 स्टॉक 3 एच बो 3
2.86g/liter2 कश्मीर 4 HPO: 3H 2 हे
4.0g/liter4 MgSO: 7 2 हे
7.5g/literना 2 मिलीग्राम EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 हे
1.81g/literFerric अमोनियम साइट्रेट 0.6g/liter ZnSO 4: 7 2 हे
0.222g/literसाइट्रिक एसिड: 1H2O
0.6g/liter4 CuSO: 5H 2 हे
0.079g/literCaCl 2: 2H 2 हे
3.6g/liter2 COCl 6 2 हे
0.050g/liter4 NaMoO: 2H 2 हे
0.391g/liter
1 योजना बीजी 11-मध्यम की तैयारी.
3. ESR माइक्रो इमेजिंग प्रयोगों
- इमेजिंग प्रयोग शुरू करने के लिए, ESR सूक्ष्म इमेजिंग प्रणाली पर बारी और गुंजयमान यंत्र कि इमेजिंग जांच के अंदर चला जाता है में नमूना सम्मिलित.
- अब, कंप्यूटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग, "ट्यून" मोड पर प्रणाली स्थापित और जांच की गूंज माइक्रोवेव आवृत्ति है, जो ESR माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगा लगता है.
- के बाद कि, स्थैतिक चुंबकीय क्षेत्र निर्धारित मूल्य है कि लागू माइक्रोवेव आवृत्ति मैचों पर, पल्स अनुक्रम के लिए समय पैरामीटर सेट और ESR के लिए सुनिश्चित करें संकेत का पालन कि प्रणाली अच्छी तरह से कार्य करता है और नमूना अच्छी तरह से तैयार है.
- फिर, इमेजिंग मापदंडों जैसे पिक्सेल की संख्या, gradients की ताकत है, और उनके लिए आवश्यक मूल्यों को ढाल दालों की लंबाई निर्धारित किया है.
- सेटअप के बाद, हैन गूंज इमेजिंग पल्स अनुक्रम (चित्रा 4) के द्वारा interpulse जुदाई, 500, 600 के मूल्यों, और 700 एनएस के साथ तीन 3D ESR छवियों को इकट्ठा.
- नमूना पर अनुमान लाइट पर या बंद अपेक्षित प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है बदल गया है.
- अधिग्रहण के दौरान डेटा स्वचालित रूप से सहेजा गया है. शोध करे कच्चे डेटा फ़ाइलों को तब Matlab सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट के माध्यम से संसाधित कर रहे हैं trityl कट्टरपंथी एकाग्रता और विश्राम का समय टी 2 नक्शे, जो पूर्व मौजूदा अंशांकन के माध्यम से एक ऑक्सीजन एकाग्रता छवि में अनुवाद किया है की छवियों को प्रदान.
4. प्रतिनिधि परिणाम
प्रयोग के परिणामों में कई तीन आयामी ESR अलग τ मूल्यों पर दर्ज सूक्ष्म छवियों हैं. ठेठ कच्चे डेटा छवियों चित्रा 5 में प्रदान की जाती हैं. शीर्ष तीन छवियाँ, अंधेरे शर्तों के तहत मापा संकेत तीव्रता में कमी के अलावा बहुत समान हैं. दूसरी ओर, प्रकाश विकिरण के तहत छवि पैटर्न परिवर्तन नमूना के विभिन्न भागों में विभिन्न विश्राम बार कारण. यह डेटा 1 संसाधित किया जा एक आयाम छवि प्राप्त कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 6 में दिखाया गया है और भी विश्राम का समय, 2 टी (चित्रा 7 ) के चित्र. टी 2 छवियों को एक पूर्व मौजूदा अंशांकन वक्र है कि समीकरण के माध्यम से विश्राम का समय के लिए ऑक्सीजन एकाग्रता लिंक के माध्यम से ऑक्सीजन एकाग्रता मूल्यों में अनुवाद कर रहे हैं: 
यहाँ, टी 2 0 स्पिन स्पिन anoxic शर्तों (जांच की एकाग्रता, सी, और उसके प्रसार गुणांक, विकास के आधार पर) के तहत जांच के विश्राम का समय है, और कश्मीर समानता निरंतर है. ज्यादातर मामलों में, प्रसार गुणांक रहते नमूने के लिए बहुत भिन्न नहीं करता है (हालांकि, अगर जरूरत है, यह सिद्धांत में सीधे ESR 6, 10 के द्वारा किया जा सकता है भी मूल्यांकन), और स्पिन एकाग्रता इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान प्राप्त की है . इसलिए, इस संबंध सीधे ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 6 के लिए वापस जा रहे हैं, यह आयाम छवि से स्पष्ट है कि cyanobacteria कोशिकाओं नमूना धारक के सही पक्ष पर मुख्य रूप से स्थित थे. इसके अलावा, 7 चित्रा के आधार पर, यह स्पष्ट है कि प्रकाश 2 हे के उत्पादन शुरू और समाधान हे 2 एकाग्रता में एक उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता है, मुख्य रूप से cyanobacteria निकट voxels में .
चित्रा 1: इलेक्ट्रॉन स्पिन गूंज में ऊर्जा का स्तर .
चित्रा 2: एक ट्यूमर असर माउस के विशिष्ट ऑक्सीजन एकाग्रता छवि. बाईं तरफ छवि संरचनात्मक जानकारी के लिए, एक एमआरआई छवि के आधार पर पता चलता है. एक स्थिर मुक्त कार्बनिक कट्टरपंथी माउस को इंजेक्ट किया गया था और अपनी ESR विशेषताओं को अपने वातावरण में ऑक्सीजन एकाग्रता (दाएं) प्रदान करते हैं. ESR-आधारित परिणाम एमआरआई शारीरिक छवि पर आरोपित कर रहे हैं. देखने के फील्ड में 32 मिमी है.
चित्रा 3: एन @ 60 सी (बाएं) पाउडर और LiPc साथ photolithographically उत्पन्न नमूने के उच्च संकल्प सूक्ष्म पैमाने पर ESR छवियों के दो उदाहरणparamagnetic क्रिस्टल (दाएं)
चित्रा 4: ठेठ हैन इमेजिंग नाड़ी माइक्रोवेव (मेगावाट) दिखा और ढाल, जी x, जी y और जी z दालों अनुक्रम
चित्रा 5: ठेठ कच्चे डेटा ESR सूक्ष्म छवियों: एक, ख, ग τ = 500,600,700 एनएस क्रमशः मापा नहीं प्रकाश रोशनी के साथ Cyanobacterium नमूने के कच्चे डेटा कर रहे हैं . आइटम डी, ई, और क, ख और ग के रूप में, लेकिन प्रकाश रोशनी के साथ वही कर रहे हैं. तीव्रता मनमाना पैमाने पर प्लॉट किए जाते है (लेकिन तीन अंधेरे या प्रकाश कच्चे डेटा छवियों के प्रत्येक सेट के भीतर संगत है)
चित्रा 6: एम्प्लीट्यूड समाधान में कट्टरपंथी एकाग्रता (मनमाने ढंग पैमाने) इसी छवि.
चित्रा 7: टी 2 छवियों और इसी हे [2] अंधेरे (बाएं) और प्रकाश (दाएं) शर्तों के तहत मान .
Discussion
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे सूक्ष्म इमेजिंग ESR रहते छोटे नमूनों के निकट ऑक्सीजन एकाग्रता नक्शा करने के लिए लागू किया जा सकता है. ~ 30 x 30 के एक स्थानिक संकल्प x 100 सुक्ष्ममापी, के पास micromolar ऑक्सीजन एकाग्रता संवेदनशीलता और उप femtomole voxel के प्रति पूर्ण ऑक्सीजन संवेदनशीलता के साथ प्रदर्शन किया है. कोशिकाओं के पास ऑक्सीजन के मानचित्रण के लिए सूक्ष्म इमेजिंग ESR का उपयोग वर्तमान में उपलब्ध सूक्ष्म इलेक्ट्रोड phosphorescence / या प्रतिदीप्ति पर आधारित तकनीक का पूरक है. इसके अलावा, उचित paramagnetic जांच के साथ, यह आसानी से intracellular ऑक्सीजन सूक्ष्म इमेजिंग, एक क्षमता है जो अन्य तरीकों को खोजने के लिए बहुत मुश्किल से हासिल के लिए लागू हो जाएगा. निकट भविष्य में हम आगे इस पद्धति में सुधार के कुछ microns के एक संकल्प के साथ रहते हैं नमूना छवियों को प्रदान करने पर योजना है, ऐसे सुपर ऑक्साइड एकाग्रता, अम्लता (पीएच), जांच प्रसार गुणांक और पाठ्यक्रम के, ऑक्सीजन एकाग्रता के रूप में इसके विपरीत मापदंडों प्रदान. दोनों विपरीत प्रकार के मामले में और भी नमूने विशेषताओं (जैसे गैर पारदर्शी मोटी नमूने और कुछ मामलों में, intracellular बनाम कोशिकी माप) के मौजूदा ऑप्टिकल आधारित तरीके के लिए इन क्षमताओं के पूरक हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम आंशिक रूप से कोई अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. 213/09 इजराइली विज्ञान फाउंडेशन से कोई अनुदान. 2005258 बीएसएफ नींव से कोई अनुदान. यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से, 201665 और प्रणालियों पर रसेल Berrie नैनो संस्थान द्वारा. हम Schulich और cyanobacteria की आपूर्ति से निपटने के बारे में प्रणालियों में रसायन विज्ञान के संकाय के प्रोफेसर नोम Adir और Faris Salame की मदद से स्वीकार करते हैं. मदद और प्रणालियों लघु नैनो निर्माण यूनिट से स्वेतलाना Yoffis के समर्थन काफी सराहना की है.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | |
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Novosibirsk | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | ||
| Syringe | Hamilton Co | Microliter 7000.5 | |
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
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- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
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